유전자 Inducible의 운명 매핑에 대한 실용적인 접근법 : 셀을 선택하고 추적하는 비주얼 가이드 VIVO에서

운명 지도(Fate maps)는 생체 내에서 세포를 표시하고 추적함으로써 전구 세포가 발달 중인 조직 및 성체 조직의 특정 구조와 세포 유형에 어떻게 기여하는지를 결정하여 생성됩니다. 이러한 개념의 발전된 형태인 유전적 유도 운명 지도 작성법(GIFM)은 생체 내 유전자 발현 상태와 세포 행동을 연결하여 유전적 계통에 기반한 운명 지도를 생성합니다. 안녕하세요, 저는 브라운 대학교 분자생물학, 세포생물학 및 생화학과의 Mark Services 연구실 소속 Deborah Ellisor입니다.

오늘 저와 동료인 Ashley Brown, Liz Norman, Neen Hagen, Steve Brown은 유전적 유도 운명 지도 작성(genetic inducible fate mapping) 절차를 시연하겠습니다. 저희 연구실에서는 초기 뇌 발달을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 또한 이 기술을 유전자 불활성화 연구 및 인간 질병의 동물 모델에도 적용할 수 있습니다.

그럼 시작해 보겠습니다. X cre, E-R-M-G-F-P 배아에서, MGFP LAE는 회색 타원으로 표시된 모든 세포에 존재하는 리포터 대립유전자입니다. X cre, er에서 X는 유전자 조절 요소를 나타냅니다. C ER 발현을 조절하는 과정은 파란색으로 표시된 유전자 X의 발현 영역으로 공간적으로 제한되며, CRE ER 단백질은 HSP 90에 의해 세포질에 격리됩니다.

Tamoxifen이 없을 때, 리포터는 작동하지 않습니다. Tamoxifen을 투여하면 CER이 HSP 90에서 분리되어 핵으로 이동하고 리포터 대립유전자에서 stop cassette를 제거하므로 도메인 X의 세포들이 운명 지도(fate mapped)화됩니다. 영구적이고 유전 가능한 재조합을 통해 세포들은 MG FP LA Z를 지속적으로 발현하게 됩니다. 리포터 대립유전자 CER과 tamoxifen의 조합은 마킹을 가능하게 하며, 배아의 원시 뇌 영역에서 유전자 발현을 기반으로 세포 집단이 처음에 마킹되면, CER을 구동하는 데 사용된 초기 유전자 발현이 사라진 후에도 이 운명 지도화된 세포들을 추적할 수 있습니다.

이러한 방식으로, 유전적으로 정의된 세포 계통의 최종 분포와 말단 운명을 성체에서 확인할 수 있습니다. 이 절차는 20 mg/mL 농도의 타모キシ펜 스톡 솔루션을 준비하는 것으로 시작합니다. 유리 흡입 바이알에 200 mg의 타모キシ펜을 10 mL의 예열된 옥수수유에 녹입니다.

그 다음 용액을 Tator vortex에서 37 °C로 2시간 동안 배양합니다. 준비된 Tamoxifen 스톡 용액의 바이알을 호일로 감싸 빛으로부터 차단하고 4 °C에서 보관하십시오. 이 스톡 용액은 최대 한 달 동안 사용할 수 있습니다.

운명 지도(fate mapping) 실험을 위해, 야생형 Swiss Webster 암컷과 유전자 특이적 CreER 대립유전자 및 리포터 대립유전자를 모두 가진 수컷으로 교배 쌍을 구성합니다. 본 시연에서는 win to one CreER MG FP 수컷을 사용하겠습니다. 매일 아침 Swiss Webster 암컷의 질전(vaginal plug) 형성 여부를 확인하십시오.

질 플러그(vaginal plug)가 확인된 날의 아침을 교배 후 0.5일로 지정하고 Tamoxifen 투여 날짜를 계산합니다. 본 실험의 이 기준점을 바탕으로, Tamoxifen은 배아기 8.5일(embryonic day 8.5)에 투여합니다. 동물용 급여 바늘이 장착된 1 mL 주사기를 사용하여 Tamoxifen 스톡 용액 200 µL를 흡입합니다.

임신 기간이 정해진 Swiss Webster 암컷 쥐의 목덜미와 등을 단단히 잡아 머리를 고정하고, 배 쪽이 위를 향하도록 쥐를 뒤집어 제압합니다. 자유로운 손가락 사이에 꼬리를 잡아 몸이 일직선이 되도록 유지합니다. 다음으로, 급이 바늘을 입 구석에 넣고 바늘 끝이 눈의 위치에 올 때까지 입천장과 평행하게 부드럽게 안내하여 삽입합니다.

식도를 확보하기 위해 머리를 부드럽게 뒤로 젖힙니다. 바늘을 후두개 너머 식도를 따라 위장 방향으로 안내합니다. 이때 기관으로 진입하지 않도록 주의하십시오.

급이 바늘이 위장에 위치하면 tamoxifen을 투여하고 바늘을 제거합니다. 그 후, 박리 날짜까지 암컷을 홈 케이지로 돌려보냅니다. 박리 당일에, 시기 조절 임신 암컷으로부터 E 12.5 배아를 박리하여 분리한 다음 GFP 표지 여부를 평가합니다.

GFP 양성 배아에서, wind one 유래 뉴런이 중뇌, 후뇌 및 척수로 분배되는 것을 관찰합니다. MG FP 리포터는 축삭 돌기를 표지하며, 이는 PPS가 포함된 페트리 접시에 GFP 양성 배아를 홀마운트로 옮긴 후 사진 프레임을 사용하여 촬영함으로써 확인할 수 있습니다. 배아 촬영 후, 핀셋을 사용하여 각 배아의 꼬리 부분을 조금씩 떼어내어 각각 PCR 튜브에 넣습니다. 조직은 홀마운트 분석을 통해 확인된 결과를 검증하기 위해 두 대립유전자에 대한 PCR 유전형 분석을 수행합니다.

다음 절차를 통해 개두술을 시작하기 전, 배아 영역에서 유래된 표지 세포들이 성체 뇌에 어떻게 분포하는지 분석할 수 있습니다. 발가락 꼬집기 테스트를 통해 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다. Nembutal로 마취시킨 후, 흉곽을 통해 심장에 접근할 수 있도록 절개합니다.

다음으로 나비 바늘을 심장의 심첨부 또는 좌심실에 삽입하고 C 클램프로 고정합니다. 가위로 우심방에 유체 배출구를 만든 후, 유체가 투명하게 흘러나올 때까지 10~15 mL의 ice cold saline으로 관류합니다. 이어서 20~25 mL의 4% paraform aldehyde로 관류합니다.

심장 내 관류가 완료되면, 어깨 바로 윗부분의 척주를 가위로 절단하여 머리를 분리합니다. 메스로 머리의 등쪽 정중선을 따라 주둥이 방향으로 절개하여 두피를 자르고 두개골을 노출시킵니다. 메스를 사용하여 두개골의 측면과 후면을 따라 남아 있는 과잉 조직이나 근육을 긁어내어 제거합니다.

포셉을 사용하여 후각구(olfactory bulbs) 바로 앞쪽의 정중선에서 두개골을 천공하고, 미세 가위의 끝이 들어갈 수 있도록 작은 구멍을 만듭니다. 이 구멍에 미세 가위를 삽입하여 정중선으로부터 후각구의 길이를 따라 양측으로 두 번 절개합니다. 이 절개는 비골(nasal bone)과 전두골(frontal bone)의 교차 지점에서 두개골을 분리하여 가위가 원활하게 진입할 수 있게 합니다.

두개골의 시상봉합선을 따라 절개하되, 하부 조직의 손상을 방지하기 위해 가위 끝이 뇌 반대 방향을 향하도록 각도를 유지하십시오. 다음으로, 핀셋으로 두개골을 조심스럽게 잡고 내측 절개선을 따라 뼈를 벗겨내어 뇌를 노출시킵니다. 이때 두개골이 작은 조각으로 떨어져 나가거나 더 큰 구역으로 분리될 수 있습니다.

포셉을 계속 사용하여 전두-두정골, 두정간골 및 후두골을 모두 제거합니다. 소뇌 높이의 뇌 외측 가장자리를 따라 위치한 안와 주변골(para oculi)의 양측 구형 뼈를 부드럽게 집어 분리합니다. 가위를 사용하여 뇌줄기를 둘러싸고 있는 뼈의 등쪽 부분을 조심스럽게 절단합니다.

가위의 한쪽 끝을 척수가 절단된 지점부터 소뇌 방향으로, 뼈의 등쪽 가장자리 바로 아래에 삽입하여 절개합니다. 이는 뇌줄기와 소뇌를 분리하기 위함입니다. 핀셋을 사용하여 뇌줄기 주변에 남아 있는 뼈를 제거합니다.

뼈를 조심스럽게 걷어내고 머리를 등쪽이 아래로 향하게 돌린 후, 포셉을 사용하여 뇌신경을 절단하고 두개골에서 뇌를 분리합니다. 뇌를 얼음이 담긴 페트리 접시에 놓습니다. Cold PPS 형광 해부 현미경을 사용하여 성체 뇌의 GFP 표지를 확인하고, 픽처 프레임을 사용하여 사진을 촬영합니다.

본 예시에서는 배아 발생 과정 및 성체에서의 계보 분석 용도 외에도 midbrain을 GFP로 표지하였습니다. GIFM은 미세 절제 및 조직 외식편 실험과 같이 발생 생물학에서 흔히 사용되는 다른 응용법들과 결합하여 사용할 수 있습니다. 예를 들어, ventral mesencephalon은 wind one 유전자를 발현하는 도파민 뉴런이 발달하는 전구 세포 구역입니다. 따라서 미세 절제를 통해 ventral mesencephalon을 분리하면, 해당 발달 과정을 추가로 연구하기 위한 in vitro 환경을 구축할 수 있습니다.

이는 유전적 이력으로 정의된 관심 전구세포 영역을 분리하기 위해 GIFM을 사용하는 하나의 예시에 불과합니다. 이 절차를 시작하려면, 미세 가위를 사용하여 이전에 확인된 GFP 양성 배아를 세포 배양 접시의 얼음처럼 차가운 멸균 PBS로 옮깁니다. 배아의 머리 부분을 횡단면으로 절단하여 제거합니다.

다음으로, 두부의 머리 부분을 관상면으로 절단하여 제거합니다. 이렇게 하면 중뇌 소포를 통해 제4뇌실이 배측 조직과 복측 조직 사이의 도관을 형성하는 튜브 모양의 구조가 노출됩니다. 가위 끝을 제4뇌실에 조심스럽게 삽입한 다음, 튜브를 완전히 개방하여 오픈 북(open book) 표본을 만들기 위해 배측 정중선을 따라 미측에서 두측 방향으로 절개합니다.

이제 중뇌의 복측을 내측으로 노출시킵니다. 중뇌의 등측 두 절반은 외측에 위치하게 되며, 복측 중뇌 아래에 남아 있는 비신경 조직을 제거해야 할 수도 있습니다. 설명물(explan)이 평평하게 놓이게 하려면, 등측 중뇌가 날개를 나타내고 thrombo mere one이 꼬리를 나타내는 나비 모양이 되어야 합니다.

팩스 분석 또는 세포 배양 실험을 위해 복측 중뇌를 추가로 분리하려면 조직의 외측 부분을 제거하십시오. 이제 GIFM의 대표적인 결과 몇 가지를 보여드리겠습니다. 본 실험에서는 WNT1을 발현하는 세포를 E 8.5에 표지하여, WNT1 직접 세포가 발달 과정 전반에 걸쳐 신경 구조에 어떻게 기여하는지 시각화하였습니다.

예를 들어, E 12.5의 C EER MG FP 배아의 경우 주로 중뇌, 후뇌 후방 및 척수에서 GFP 형광이 나타나며, 고배율에서는 미세한 신경 돌기가 중뇌 체벽 사지 및 두안면 부위를 신경 지배하는 것이 관찰됩니다. 표지된 세포들은 면역조직화학법을 통해 세포 수준에서 시각화 및 분석될 수 있습니다. E 8.5에 Tamoxifen을 투여하여 표지한 E 12.5 배아의 1 µm 두께 광학 절편에서 보는 바와 같이, 적색의 핵 베타-갈락토시더아제(nuclear beta galacto) 항체 표지와 녹색의 GFP 항체 표지는 복측 중뇌에 나타난 운명 지도화된 세포들을 나타냅니다.

여기서 결합된 세포들이 이중 양성을 띠는 이유는 성체 뇌 내 조건부 MGFP 리포터의 특성 때문입니다. 성숙한 조직의 밀도로 인해 뇌 내부 구조에서 나오는 GFP 형광이 가려질 수 있습니다. 따라서 전장 마운트 형광 현미경으로는 성체 CUI 상부에서 희미한 GFP 형광만이 관찰되어 승리를 평가하게 됩니다.

저배율 현미경으로 관찰한 성체 절편에서 E 8.5에 표지된 하나의 계보는 WNT1 계보가 상구와 하구를 포함한 중뇌 구조를 형성한다는 것을 보여줍니다. 도파민성 뉴런 인근의 복측 중뇌에서 촬영한 이 고배율 이미지에서는 nuclear beta-cat 양성 세포와 풍부한 GFP 양성 축삭 신경총을 확인할 수 있습니다. 이와 대조적으로 E 9.5에 표지하면 상당한 GFP 라벨링이 나타나며, 이는 전체 마운트 형광 염색을 통해 중뇌의 하구에서 쉽게 관찰됩니다. 저배율 현미경으로 확인한 성체 절편에서 E 9.5에 표지된 WNT1 계보는 하구에 집중되어 있습니다.

도파민성 뉴런의 복측 중뇌에서 촬영한 이 고배율 이미지에서는 nuclear beta gel 양성 세포와 풍부한 GFP 양성 축삭 신경총을 확인할 수 있습니다. 따라서 E 8.5와 E 9.5에서 유래한 뉴런들은 배측 중뇌에 기여하는 능력이 점진적으로 제한되는 반면, WIN one 계보는 복측 중뇌에 계속해서 기여하는 것으로 나타납니다.

지금까지 생체 내(in vivo)에서 세포 계통을 표시하고 추적하기 위한 유전적 유도 운명 지도 작성(genetic inducible fate mapping) 절차를 살펴보았습니다. 이 방법을 통해 유전적 계통에 따라 세포를 표시할 수 있으며, 유전자 발현이 소실된 후에도 시간이 경과함에 따라 해당 세포들을 추적할 수 있습니다. 타모キシ펜(tamoxifen)을 8.5일에 투여함으로써, wit 1 도메인이 성체 중뇌 전체뿐만 아니라 발달 중인 중뇌에도 기여한다는 것을 확인했습니다.

이와 대조적으로, wit one 도메인이 제한되는 시점인 9.5일에 타모시펜을 투여하면 배아 발생기 동안 발달 중인 중뇌에 기여하는 범위가 더 제한되며, 이러한 양상은 성체까지 지속됩니다. 이 절차를 수행할 때는 시스템이 세포를 모자이크 방식으로 표지하므로, 특정 구조 내의 모든 세포가 표지되지 않을 수 있다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 이는 사용된 CRE er 라인 또는 조건부 리포터 대립유전자로 인한 결과일 가능성이 높습니다.

중요한 점은, 세포 표지가 모자이크 형태로 나타나지만, 표지된 세포의 패턴과 분포는 재현성이 매우 높다는 것입니다. 우리는 경구 투여를 통한 tamoxifen 투여가 복강 내 주사 방식보다 유리하다는 것을 발견했는데, 이는 복강 내 공간의 염증뿐만 아니라 배아에 가해지는 기계적 손상을 최소화하기 때문입니다. 이상입니다.

시청해주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.