유전자 Inducible의 운명 매핑에 대한 실용적인 접근법 : 셀을 선택하고 추적하는 비주얼 가이드 VIVO에서

운명 지도는 생체 내에서 세포를 표시하고 추적하여 전구 세포가 발달 중인 조직과 성체 조직의 특정 구조와 세포 유형에 어떻게 기여하는지 확인하여 생성됩니다. 그리고 이 개념의 발전은 유전자 유도 가능한 운명 매핑 또는 GIFM으로, 유전자 발현, 황산염 및 생체 내 세포 행동을 연결하여 유전적 혈통을 기반으로 운명 지도를 생성합니다. 안녕하세요, 제 이름은 브라운 대학의 분자 생물학, 세포 생물학 및 생화학과와 Mark Services Laboratory의 Deborah Ellisor입니다.

오늘 저의 동료인 애슐리 브라운(Ashley Brown), 리즈 노먼 닌 하겐(Liz Norman Neen Hagen), 스티브 브라운(Steve Brown)과 저는 유전적으로 유도할 수 있는 운명 매핑 절차를 시연할 것입니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 초기 뇌 발달을 연구합니다. 우리는 또한 이 기술을 유전자 불활성화 연구 및 인간 질병의 동물 모델에 적용할 수 있습니다.

그럼 시작하겠습니다 X cre, E-R-M-G-F-P 배아. MGFP LAE는 회색 타원 X cre, er로 표시되는 모든 세포에 존재하는 리포터 대립유전자이며, 여기서 X는 유전자 조절 요소를 나타냅니다. C ER 발현 조절은 파란색으로 표시된 유전자 X의 발현 도메인으로 공간적으로 제한되며 CRE ER 단백질은 HSP 90에 의해 세포질에서 격리됩니다.

타목시펜이 없으면 리포터는 자리를 비울 것입니다. 타목시펜 투여는 HSP 90에서 CER이 방출되어 핵으로 전위되고 리포터 대립유전자에서 정지 카세트를 제거하기 때문에 도메인 X에 운명 매핑된 세포를 생성합니다. 영구적이고 유전적인 재조합은 세포가 MG FP LA Z.The 조합을 구성적으로 표현한다는 것을 보장합니다.리포터 대립유전자 CER과 타목시펜의 조합은 세포 집단이 유전자 발현에 따라 배아의 원시 뇌 영역에서 처음에 표시될 때 마킹 결과이며, 이러한 운명 매핑 세포는 CER을 구동하는 데 사용되는 초기 유전자 발현이 소멸된 후에도 추적됩니다.

이런 식으로. 유전적으로 정의된 세포 계통의 최종 분포와 말기 운명은 성체에서 확인할 수 있습니다. 이 절차는 유리 흡입 바이알에 전쟁 전 옥수수 기름 10밀리리터에 타목시펜 200밀리그램을 용해시킨 타목시펜의 밀리리터 줄기 줄기 용액 20밀리그램을 준비하는 것으로 시작됩니다.

그런 다음 Tator vortex에서 2시간 동안 섭씨 37도에서 용액을 배양합니다. 이 용액은 바이알을 호일로 감싸고 섭씨 4도에서 보관하여 준비된 Tamoxifen 스톡 용액을 빛으로부터 간헐적으로 보호합니다. 재고는 최대 한 달 동안 사용할 수 있습니다.

운명 매핑 실험을 위해 야생형 스위스 웹스터 암컷과 유전자 특이적 CreER 대립유전자와 리포터 대립유전자를 모두 가진 수컷으로 구성된 번식 쌍을 설정합니다. 이 데모에서는 한 명의 CreER MG FP 남성에게 승리를 사용합니다. 매일 아침 스위스 웹스터 암컷에게 질 플러그가 있는지 확인한다.

cotus 후 0.5일로 보이는 질 마개 당일 아침을 지정하고 Tamoxifen 투여 날짜를 계산합니다. 이 실험의 이 시작점을 기반으로 Tamoxifen은 배아 8.5일에 투여됩니다. 동물 먹이 바늘이 있는 1밀리리터 주사기를 사용하여 200마이크로리터의 타목시펜 줄기 용액을 뽑습니다.

시간이 초과된 임신한 스위스 웹스터 암컷의 목덜미와 등의 낮잠을 잡고 머리를 움직이지 못하게 하고 마우스를 뒤집어 복부 쪽이 위를 향하도록 단단히 제지합니다. 몸이 일직선이 되도록 자유로운 손가락 사이에 꼬리를 잡습니다. 다음으로, 수유 바늘을 입가에 놓고 수유 바늘 끝이 대략 눈의 위치에 올 때까지 바늘을 입천장과 평행하게 부드럽게 안내합니다.

식도에 접근할 수 있도록 머리를 부드럽게 뒤로 젖힙니다. 바늘을 후두개(epiglottis)를 지나 식도를 따라 위(胃)로 안내합니다. 기관에 들어가지 않도록 주의하세요.

영양 바늘이 위에 들어가면 타목시펜을 투여하고 바늘을 제거합니다. 그런 다음 해부 날짜까지 암컷을 집 우리로 되돌려 놓습니다. 해부 당일, 시간 제한이 있는 임산부의 E 12.5 배아를 자유롭게 절부한 후 GFP 마킹을 평가합니다.

GFP 긍정적 인 배아에서, 우리는 바람 하나 파생 된 뉴런이 중뇌, coddle 뒷뇌 및 척수에 기여한다는 것을 관찰합니다. MG FP 리포터는 축삭돌기(axonal projection)에 라벨을 붙이고, GFP 양성인 배아를 PPS가 들어있는 페트리 접시에 집에 장착하여 옮기는 것도 볼 수 있습니다. 배아를 촬영한 후, 집게를 사용하여 각 배아에서 작은 꼬리 조각을 떼어내고 각 조각을 PCR 튜브에 넣습니다. 조직은 전체 마운트 분석을 통해 확인된 결과를 확인하기 위해 두 대립유전자에 대해 PCR을 사용하여 유전형을 분석합니다.

다음 절차를 통해 배아 영역에서 파생된 표시된 세포가 개두술을 시작하기 전에 성인 뇌에 어떻게 채워지는지 분석할 수 있습니다. 발가락 꼬집음으로 마우스가 완전히 innu임을 확인했습니다. nembutal로 ized 된 것은 흉곽을 통해 심장에 접근하기 위해 절개를 수행합니다.

그런 다음 나비 바늘을 심장의 정점 또는 좌심실에 삽입하고 C 클램프로 고정합니다. 가위로 오른쪽 아트리움에 유체 배출 부위를 만든 다음 액체가 맑아질 때까지 10-15ml의 얼음 식염수를 관류합니다. 그 다음에는 20-25 밀리리터의 4 % 파라 폼 알데히드가 뒤 따른다.

심장 내 분비가 완료되면 어깨 바로 위의 척추를 가위로 잘라 머리를 제거합니다. 머리의 등쪽 정중선을 따라 메스를 돌리고 두피를 자르고 S 두개골을 드러냅니다. 메스를 사용하여 두개골의 측면과 후면을 따라 여분의 조직이나 근육을 긁어냅니다.

집게로 정중선의 두개골에 구멍을 뚫고 후각 구근에 엎드려 가는 가위 끝을 수용할 수 있는 작은 구멍을 만듭니다. 이 구멍에 가는 가위를 삽입하고 후각구의 길이를 따라 정중선에서 두 개의 양측 절개를 만듭니다. 이 절단은 코뼈와 전두골의 교차점에서 두개골을 부러뜨리고 가위에 쉽게 접근할 수 있도록 합니다.

두개골의 시상 봉합선을 따라 자르고, 가위 끝이 뇌에서 멀리 떨어지도록 하여 기저 조직이 손상되지 않도록 합니다. 그런 다음 집게로 두개골을 부드럽게 잡고 내측 절개 부위를 따라 뼈를 벗겨내어 뇌를 드러냅니다. 두개골은 작은 조각으로 나뉘어 잘리거나 큰 부분으로 나뉘어 떨어져 나갈 수 있습니다.

집게를 계속 사용하여 전두엽 두정골, 두정간 뼈 및 후두골을 모두 제거합니다. 소뇌 수준에서 뇌의 측면 가장자리를 따라 위치한 파라 안구를 양쪽의 구형 뼈를 부드럽게 꼬집어 제거합니다. 가위를 사용하여 뇌간을 둘러싸고 있는 뼈의 등쪽 부분을 조심스럽게 자릅니다.

가위의 한쪽 면을 뼈의 등쪽 가장자리 바로 아래에 삽입하되, 척수가 절단된 곳부터 소뇌를 향해 자릅니다. 뇌간과 소뇌를 자유롭게 하기 위해서입니다. 집게로 뇌간 주변의 나머지 뼈를 제거합니다.

뼈를 부드럽게 잡아당기고 머리를 등쪽을 아래로 돌린 다음 집게를 사용하여 뇌신경을 절단하고 두개골에서 뇌를 분리하십시오. 뇌를 얼음이 담긴 페트리 접시에 넣는다. Cold PPS 형광 해부 내시경을 사용하여 성인의 뇌에서 GFP 표시를 평가하고 액자를 사용하여 사진을 찍습니다.

이 예에서 중뇌는 배발생 중 계통 분석에 사용되는 것 외에도 GFP로 표시되며 성인의 경우 GIFM은 미세 해부 및 조직 외식 실험과 같은 발생 생물학에서 일반적으로 사용되는 다른 응용 프로그램과 결합할 수 있습니다. 예를 들어, 복부 중뇌(ventral mesencephalon)는 바람 유전자를 발현하는 도파민 뉴런을 발달시키는 전구 영역입니다. 따라서 미세 박리로 복부 중뇌를 분리하면 그 발달을 더 자세히 조사하기 위해 시험관 내 설정을 설정할 수 있습니다.

이는 GIFM을 사용하여 유전적 역사에 의해 정의된 전구 관심 영역을 분리하는 한 가지 예일 뿐입니다. 이 절차를 시작하려면 미세한 가위를 사용하여 이전에 확인된 GFP 양성 배아를 세포 배양 접시의 얼음 저온 멸균 PBS로 이식합니다. 배아의 머리 부분을 가로로 잘라 rommy로 제거합니다.

다음으로, 두부를 관통하는 관상 절개로 머리의 상부 부분을 제거합니다. 이것은 중두형성 소포를 통한 네 번째 뇌실이 등쪽 조직과 복부 조직 사이에 도관을 형성하는 튜브와 같은 구조를 노출시킵니다. 가위 끝을 네 번째 심실에 조심스럽게 삽입하고 등쪽 정중선을 따라 잘라 튜브를 완전히 열어 열린 책 준비를 만듭니다.

이제 복부 중뇌가 내측으로 노출됩니다. 중뇌의 두 등쪽 절반은 측면으로 상주하지만 복부 중뇌 아래에 남아 있는 비신경 조직을 제거해야 할 수도 있습니다. 엑스플랜이 평평하게 놓이기 위해서는, 엑스플랜은 이제 나비와 비슷해야 하는데, 그 나비에서 등쪽 중뇌는 날개를 나타내고 혈전은 꼬리 하나를 나타내

팩스 분석 또는 세포 배양 실험을 위해 복부 중뇌를 추가로 분리하려면 조직의 측면 측면을 제거합니다. 이제 GIFM의 대표적인 결과를 보여드리겠습니다. 이 실험에서는 E 8.5로 표시된 WINT one 발현 세포를 시각화하여 WINT one 직접 세포가 발달 전반에 걸쳐 신경 구조에 어떻게 기여하는지 확인합니다.

예를 들어, E 12.5에서 하나의 C EER MG FP 배아는 주로 중뇌, 후방 뒷뇌 및 척수에서 GFP 형광을 나타내며, 고배율 미세 신경 세포 돌기가 신경 분포하는 것으로 보입니다. 중뇌, 신체, 벽, 사지 및 두개골 안면 부위로 표시된 세포도 면역조직화학을 통해 세포 수준에서 시각화하고 분석할 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, E 8.5에서 타목시펜 투여로 표시된 E 12.5 배아의 광학 단면은 빨간색으로, 녹색으로 표시된 GFP 항체 표시는 복부 중뇌에 표시된 운명 매핑 세포를 나타냅니다.

여기서 우리가 결합한 세포는 성인 뇌에 있는 조건부 MGFP 리포터의 특성 때문에 이중 양성입니다. 성숙한 조직의 밀도는 내부 뇌 구조에서 나오는 GFP 형광을 가릴 수 있습니다. 따라서 전체 마운트 형광 현미경 검사는 승리를 평가하는 성인의 우수한 CUI에서 희미한 GFP 형광만 보여줍니다.

저배율 현미경 검사로 성인 절편에서 E 8.5로 표시된 한 계통은 WIN one 계통이 상뇌 및 하뇌 cui를 포함한 중뇌 구조를 발생시킨다는 것을 보여줍니다. 도파민 뉴런 부근의 복부 중뇌에서 촬영한 이 고배율 이미지에서는 핵 베타 칼 양성 세포와 풍부한 GFP 양성 축삭신경총을 E 9.5의 대비 표시에서 볼 수 있으며, 이는 전체 마운트 형광에 의해 중뇌의 하부 대장에서 즉시 관찰되는 상당한 GFP 라벨링 결과를 제공합니다. 성체 절편에서 E 9.5로 표시된 WINT one 계통은 저배율 현미경으로 볼 수 있듯이 하카울루에 집중되어 있습니다.

도파민 뉴런의 복부 중뇌에서 촬영한 이 고배율 이미지에서는 핵 베타 젤 양성 세포와 풍부한 GFP 양성 축삭 신경총을 볼 수 있습니다. 따라서 Win One에서 E 8.5 대 E 9.5로 표시된 파생 뉴런은 배쪽 중뇌에 기여하는 것이 점진적으로 제한됩니다. WIN one 계통은 복부 중뇌에 지속적으로 기여합니다.

생체 내에서 세포 계통을 표시하고 추적하기 위한 유전자 유도 가능한 운명 매핑 절차를 보여드렸습니다. 이를 통해 유전자 계통을 기반으로 세포를 표시하고 유전자 발현이 소멸된 후에도 시간이 지남에 따라 세포를 추적할 수 있습니다. 타목시펜을 8시 반에 투여한 결과, 우리는 성인의 전체 중뇌 외에도 위트 원 도메인이 중뇌 발달에 기여한다는 것을 보여주었습니다.

대조적으로, 위트 원 도메인이 제한될 때 9시 반에 타목시펜을 투여하면 배발생 동안 발달 중뇌에 대한 기여가 더 제한되며, 이는 성인까지 지속됩니다. 이 절차를 수행할 때 시스템이 세포를 모자이크로 표시하므로 특정 구조의 모든 세포에 레이블이 지정되지 않을 수 있다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 이는 CRE er line 또는 조건부 reporter 대립유전자 때문일 수 있습니다.

중요한 것은 세포 마킹이 모자이크이지만 mar 세포의 패턴과 분포가 재현성이 높다는 것입니다. 우리는 구강 위장에 의한 타목시펜 투여가 배아에 대한 기계적 손상뿐만 아니라 복강 간 공간의 염증을 최소화하기 때문에 복강 간 주사에 의한 투여에 비해 유리하다는 것을 발견했습니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.