박테리오파지를 열거하기 위한 정량적 중합효소 연쇄 반응(Quantitative Polymerase Chain Reaction to Enumerate Bacteriophage)

정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 통해 박테리오파지를 열거하려면 최적화된 완충액에 Taq DNA 중합효소, 프라이머, 데옥시뉴클레오티드 삼인산(dNTP) 및 형광 리포터 염료 분자를 포함하는 qPCR 반응 칵테일을 얻을 수 있습니다. qPCR 플레이트의 웰로 옮깁니다.

열처리된 박테리오파지를 첨가합니다. 열처리는 박테리오파지 입자에서 박테리오파지 DNA를 방출합니다. 혼합물 증발을 방지하기 위해 플레이트를 밀봉하십시오. 플레이트를 qPCR 시스템에 로드하고 적절한 사이클링 조건을 설정합니다.

고온으로 가열하면 이중 가닥 DNA가 단일 가닥으로 변성됩니다. 또한 Taq DNA 중합효소를 활성화합니다. 어닐링은 염기서열 특이적 프라이머가 상보적인 박테리오파지 DNA 가닥에 결합하도록 합니다. 확장을 통해 활성화된 Taq DNA 중합효소가 프라이머의 3' 말단에 dNTP를 추가하여 성장하는 DNA 가닥을 5'에서 3' 방향으로 확장할

염료 분자는 새로 합성된 이중 가닥 DNA에 삽입되어 형광 강도를 증가시킵니다. 각 PCR 주기는 형광 강도를 증가시키는 표적 DNA 양을 두 배로 늘립니다.

측정된 형광이 배경 수준을 초과하는 임계값 주기 Ct 값을 결정합니다.

Ct 값은 시작 DNA의 양과 반비례하며, 각 박테리오파지 게놈은 하나의 박테리오파지 입자에 해당하므로 박테리오파지 DNA 표준 곡선에서 박테리오파지 정량화가 용이합니다.

증폭 후 용융 곡선 분석을 수행하여 반응 온도를 점차적으로 높입니다. 특정 용융 온도에서 DNA의 절반이 단일 가닥으로 분리되어 염료 분자를 방출하고 급격한 형광 감소를 일으킵니다.

qPCR 제품에 고유한 고유한 용융 온도는 제품 특이성을 검증합니다.