Name: 진드기의 RNA 간섭 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 배우세요 진드기 RNA 간섭 기법으로 특정 유전자를 침묵시켜 진드기 생물학을 연구하는 방법을. 이 기법은 진드기 매개 질병 관리 전략 개발에 필수적인 도구입니다.

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우리는 결실 토론 및 기술 지원을위한 실험실의 구성원 감사합니다. 이 비디오 프레 젠 테이션은 연구 베티 Pathobiology학과에 대한 준회원 딘, 베티 건강 과학 센터, 오클라호마 주립 대학에 의해 지원되었다. 연구는 정부의 드 Ciencia 전자 Innovación, 스페인 (프로젝트 BFU2008-01244/BMC), JF에 CSIC 교내 프로젝트 PA1002451에 의해 후원 되었음 : 월터 R. Sitlington는 KMK, CVHS 2,009 RAC 부여 OAES 음식 동물 연구를위한 의자를 둘러 싸인 동물 건강 자금과 USDA, 국가 연구 이니셔티브 경쟁 그랜트 번호 2007-04613.

1. dsRNA의 생성. <ol><li> dsRNA의 시험 관내 전사 및 합성 (예를 들어, Dermacentor에 대한 oligonucleotide primers subolesin에게 D8AAT75를 사용 variabilis에 대한 T7 프로 모터 시퀀스를 포함하는 oligonucleotide primers를 합성 : 5' - TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT - 3 '와 D8DVT73 : 5' - TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG - 3'). </li><li> RT - PCR은 각 oligonucleotide 뇌관과 틱 총 RNA 중 1-10 NG 10 pmol를 사용하여 대상 유전자를 증폭. </li><li> PCR 제품을 정화. </li><li> 정화 PCR 제품의 8 μL를 사용하여 dsRNA를 합성. </li><li> 분석법에 의해 dsRNA를 계량. </li></ol> 2. dsRNA와 진드기의 사출. 2.1. 주사 진드기의 준비. <ol><li> 첫째, 50 ML 일회용 원심 분리기 튜브의 각 솔루션에서 그들을 흔들어 진드기를 유지하기 위해 튜브 톱을 통해 고급 메쉬 와이어 화면을 통해 솔루션을 decanting하여 솔루션의 일련의 진드기 씻으십시오. 세탁 진드기에 대한 솔루션의 순서는 수돗물, 3 % 과산화수소, 증류수, 70 % 에탄올과 증류수로 두 번 더 씻는다 두 씻는다입니다. </li><li> 종이 타올에있는 진드기를 얼룩 건조. </li><li> 실험에 따라, 20 50 그룹으로 진드기를 계산, 실험 그룹의 번호로 단단히 장착되어 뚜껑과 라벨을 가진 1.25 온스 플라스틱 컵의 각 그룹에서 진드기를 놓습니다. </li></ol> 2.2. 사출 팀 틱. RNAi 팀은 세 사람으로 구성되어 있습니다 : (1) 붉은 치과 왁스의 시트에 부착된 이중 끈적끈적한 테이프의 각 체크를 위치 한 사람이, 후에 진드기를 모니터링 진드기 (3) 한 사람을 주사 (2) 한 사람 사출 그들을 활성화하는 진드기에 CO 2를 통기하여 실험 그룹의 번호로 표시 컵에 사는 진드기로 계산됩니다. 모든 팀 구성원은 일회용 장갑을 착용해야합니다. 2.3. 주사 진드기의 배치. <ol><li> 더몬트 미세 집게를 사용하여 체크를 캡처하여 붉은 치과 왁스의 3 "X 6"시트에 부착된 스티커를 두 번 테이프에 복부 쪽을 놓으십시오. 진드기는 밀접한 5 진드기의 그룹에서 함께 위치하고 있습니다. </li><li> 모든 5 진드기의 mouthparts 더들을 구속하기 위해 이상의 마스킹 테이프의 작은 스트립을 플레이스하지만 사출 과정이 체크 주입기 (그림 1)에 의해 관찰 수 있도록 노출 신체의 대부분을 떠나있는 동안. </li></ol> 2.4. 진드기의 사출. <ol><li> 진드기는 외골격의 복부 표면의 오른쪽 하단 사분면에 주입됩니다. </li><li> 첫째, 피어스 ½ ", 29 게이지 바늘 (그림 2A)가 장착되어 Monoject의 인슐린 주사기를 사용하여 외골격에 구멍. </li><li> 45 ° beveled 포인트와 1 인치 33 게이지 바늘로 맞춤 제작 해밀턴 주사기를 사용하여 - (μL 당 5 X 10 11 분자 5 × 10 10) (그림 2B) dsRNA 솔루션의 0.2-0.5 μL 즉시 개나 주사 . 바늘은 dsRNA의 배치 및 유지를 확보하기 위해 틱 캐비티에 잘 배치해야합니다. 어떤 액체가 주입 사이트 (그림 2C)에서 탈출 가능성이 높습니다. 관리는 이상 hemolymph의 손실을 일으킬 것입니다 진드기를 주입하고 진드기의 죽음을 일으킬 수하지 않도록해야합니다. </li><li> 각 실험 그룹의 주사를 완료한 후 해밀턴 주사기를 청소합니다. 또 다른 실험 그룹에 대한 사용하기 전에. 폐기물 컨테이너에 추방, 15 번 반복 후 3 % 과산화수소를 포함하는 비커에서 먼저 주사기를 작성합니다. 폐기물 컨테이너에 추방, 15 번 반복 후 멸균 물을 들어있는 비커에서 주사기를 작성합니다. 벤트 경우, 플런저가 원활하게 이동하고 진드기의 주입에 필요한 부드러운 터치에 응답하지 않습니다, 때문에 해밀턴 주사기의 플런저를 구부 않도록주의를 가져가라. </li></ol> 2.5. 주사 후 진드기의 치료. <ol><li> 좋은 포셉 즉시 더블 끈적끈적한 테이프에서 주입 체크를 들고 플라스틱 복구 컨테이너 (약 6 "X 6"과 진드기의 탈출을 방지하기 위해 마스킹 테이프와 함께 반지를 낀)에 놓으십시오. 진드기는 주사 후 간략하게 운영 중지 상태가됩니다하지만 곧 접시 주위에 크롤 링을 시작합니다. </li><li> 입김을 즉시 진드기를 활성화에 도움이되는 복구 컨테이너에서 그들을 배치 후 진드기에 2 CO. 진드기가 크롤 링하고 활성화되면, 사출 상처가 빠르게 치유하고 그들이 가장 가능성이 살아남을 것입니다. </li><li> 각 실험 그룹의 숫자에 따라 진드기를 카운트하고 단단하게 장착되어 뚜껑이있는 표시 플라스틱 컵에서 그들을 놓으십시오. 대체 진드기는 언제는 다음 실험 그룹을 주입하기 전에 죽었를 대체하는 주입해야합니다. </li></ol> 2.6. 개최 틱. <ol><li> 습도 챔버에있는 진드기 (12hr 밝은 장소 : 22-25 12 시간 어두운 photoperiod을 ° C 및 95 %의 상대 Humidity) 및 1 일 개최. </li><li> 틱 수유 세포에 넣어 거려, 실험 그룹 당 하나는 양에 접착시키고 uninjected 남성 또는 여성 진드기 (주입 아니었 중에서 성별)의 동일한 번호와 피드 수 있습니다. 충만 피드 여성 진드기는 10 먹이의 일 때 제어 여성 후 양에서 제거됩니다 이들은 호스트 수집 무게 아르를 떨어뜨리고있다. </li><li> 종이팩에 진드기를 삽입하고, 산란의 완성까지 습도 챔버하다. 가중치 그룹의 모든 진드기에 의해 생산되는 계란 질량에 의해 산란을 평가해보십시오. </li></ol> 2.7. RNAi 후 틱 표현형 분석. <ol><li> , 틱 중량, 산란 및 달걀 다산 살아남은 진드기의 수를 결정하여 수유 후 표현형 틱 평가. 그러나, 다른 분석은 연구의 대상 유전자와 목적에 따라 수행할 수 있습니다. </li></ol> 3. RT - PCR로 유전자 입을를 확인 분석. <ol><li> 수유 후 제어 주입 및 dsRNA - 주입 그룹에서 개별 진드기의 침샘과 배짱을 해부하다. </li><li> 개별 조직 샘플에서 총 RNA를 추출합니다. </li><li> 실시간 RT - PCR에 의해 개별 조직의 목표 유전자 성적표를 분석하고 틱 16에 대한 RNA 수준을 정상화는 genNorm 방법 (생물 래드 iQ5 일반용, 버전 2.0에 의해 구현으로 ddCT 방법)을 사용하여 rRNA. </li><li> 한 amplicon이 형성되도록하는 반응의 끝에 그 해리 곡선을 실행하여 모든 시료에 대해 동일한 온도 범위에서 일관되게 amplicons의 변성. </li><li> mRNA 수준 (표준 CT 값) 제어 주입 및 dsRNA - 주입 진드기는 학생`S T 테스트 (P는 = 0.05)를 사용하여 사이를 비교합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 프로토콜은 여기에 (표 1) 다양한 ixodid 틱 수종에 RNAi을 위해 저희 실험실에서 사용되었습니다 설명했다. 진드기에 주입 dsRNA의 금액은 체크의 크기에 따라 다릅니다; 큰 틱 종 더 큰 볼륨을 수용할 수 있습니다. 부정적인 제어 진드기는 관련이없는 dsRNA로 주입해야합니다. 이러한 subolesin 14-19,22-25,27-32,34 및 베타 굴지 20,21 등 여러 dsRNAs는 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 그것이 혼합 dsRNA 솔루션을 피하기 위해 트리 트먼트를 사이에 주사기를 씻어하는 것이 중요합니다. 프로토콜이 제대로되면 5 % 미만의 사망률은 24 시간 후 주사 절차에서 얻을 수 있습니다. 진드기의 유전자 최저 후 전형적인 표현형 보호하는 항원을 체크를 위해 화면을 위해 dsRNA의 수영장과 함께 주입 진드기의 패널​​로 그림 3에 표시됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 종 틱 </td><td> dsRNA는 주입 </td><td> 참조 </td></tr><tr><td> Ixodes scapularis의 </td><td> cDNA 도서관, subolesin, 굴지, nucleotidase, NF - KB, akirin </td><td> 21, 22, 29, 30 </td></tr><tr><td> Dermacentor variabilis </td><td> subolesin, GST, ubiquitin, vATPase, selenoproteins M과 W2a, 조혈 줄기 / 전구 세포 굴지 Proteasome 26S subunit, ferritin1, varisin, akirin, 단백질과 같은 </td><td> 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 </td></tr><tr><td> Dermacentor marginatus </td><td> subolesin </td><td> 22 </td></tr><tr><td> Amblyomma americanum </td><td> cDNA 도서관, subolesin, akirin </td><td> 17, 22, 30 </td></tr><tr><td> Amblyomma hebraeum </td><td> subolesin, voraxin </td><td> 28 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus의 sanguineus </td><td> Rs86, subolesin </td><td> 22, 23 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus microplus </td><td> GST, ubiquitin, selenoprotein, Bm86, Bm91, subolesin, GI, GIII, EF1a, flagelliform 실크 단백질, 폰 Willebrand 인자 </td><td> 16, 18, 25, 27 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus의 annulatus </td><td> ubiquitin, subolesin, EF1a, GIII </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> 표 1. RNAi 프로토콜이 사용되었습니다있는 수종으로 톡톡 두드려. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 빨간 치과 왁스의 시트을 준수 더블 스티커 테이프에 진드기의 배치, 최대 복부 측면. 진드기는 마스킹 테이프의 작은 스트립이 주입기는 주입 중에 진드기의 사체를 관찰 수 있도록하면서 추가로 진드기를 확보하기 위해 mouthparts 위에 배치되는 후, 5 그룹에 배치됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 분사 절차는 인슐린 싸이로 틱 외골격의 (A) 오른쪽 아래 사분면 피어싱을 포함ringe는 주사 사이트를 만들기 위해 29 게이지 바늘로 장착되어, (C) 대부분은 / 틱 hemolymph의 일부 누수가 발생합니다 33 게이지 바늘로 해밀턴 주사기를 사용하여이 사이트에서 dsRNA의 (B) 즉시 분사 유체. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. RNAi가 Amblyomma americanum에서 진드기 항원에 대한 보호 화면으로 사용된있는 체크 여섯 그룹의 패널. 긍정적인 subolesin RNAi 제어 및 부정 무관한 dsRNA 제어와 비교하면 진드기의 phenotypic 변화를 볼 수 있습니다. 본 실험에서는 각 그룹의 틱 사망률, 무게, 그리고 산란에 대한 RNAi의 효과는 통계적으로 분석했다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

다른 방법은 진드기 14 33 RNAi에 대해 설명하고 있지만, dsRNA의 주입은 가장 널리 unfed (표 1)과 먹이 진드기 16,25,34 모두에서 사용됩니다 여기에 설명되어 있습니다. RNAi는 틱 유전자 기능 연구, 경마 병원체 인터페이스의 특성 및 심사와 진드기 항원 보호 14,35의 특성화를위한 유용한 도구로 표시되었습니다. 특히, RNAi가 나 35 기능 분석을위한 가장 중요한 도구가되고 있습니다. Methodologically, RNAi 가능성이 높습 개인의 다수의 유전자 최저를 허용할 수 있습니다보다 효율적인 방법으로 진화합니다. 진드기의 dsRNA 유도된 RNAi의 메커니즘은 더 나은 이해하고이 수종 35,36에서이 유전자 접근 방식의 활용에 기여하기 위해 정제해야합니다. 진드기의 RNAi의 오프 대상 효과의 정도도 충분히 14,27 연설을해야 할 중요한 질문이다. 마지막으로, RNAi는 대부분 틱 유전자 규정 및 시스템 생물학의 연구에 종합적인 기여를 제공하고 경마 병원체 인터페이스와 틱 infestations과 틱 통한 병원균의 전송을 제어하는​​ 백신의 개발에 영향을 미칠 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Access RT-PCR 시스템</td><td>Promega</td><td>A1250</td><td></td></tr><tr><td>Purelink PCR 정제 키트</td><td>Invitrogen</td><td>K3100-02</td><td></td></tr><tr><td>Megascript RNAi 키트</td><td>Ambion</td><td>AM1626M</td><td></td></tr><tr><td>적색 치과용 왁스</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72674</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 컵(1.25 oz) 및 뚜껑</td><td>Solo Cup Company, Urbana Ill.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>정밀 핀셋</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>Monoject</td><td></td><td>&amp;#189;&quot;, 29 gauge 바늘 장착</td></tr><tr><td>Hamilton 주사기</td><td>Hamilton</td><td>701SN,33/.375&amp;#8221;/45DGR</td><td>주문 제작</td></tr><tr><td>TriReagent</td><td>Sigma</td><td>93289</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green 포함 iScript One-Step RT-PCR 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8892</td><td></td></tr><tr><td>실시간 PCR 검출 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>Several</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/&lt;/a&gt;를 참조하십시오.</td></tr></tbody></table>

진드기의 rna 간섭

RNA Interference in Ticks

진드기는 야생 국내 동물과 인간의 의무 hematophagous ectoparasites하고 있으며, 인간의 질병 1과 가장 중요한 벡터의 벡터는 가축 업계 세계 2에 영향을 미치는 것으로 모기의 두번째 세계로 간주됩니다. 진드기는 하위 클래스 Acari, 주문 Parasitiformes, 아목 Ixodida 분류하고 북극에서 열대 지역 3 전세계 배포됩니다. 틱 infestations을 제어하기위한 노력에도 불구하고, 이러한 ectoparasites는 4,5 인간과 동물의 건강에 심각한 문제가 남아 있습니다. RNA 간섭 (RNAi) 6 신진 대사 경로에 유전자 기능 또는 효과를 결정하기 위해 유전자 발현의 중단과 관련된 핵산 기반 반대 유전자 접근 방식이다. 작은 방해 RNAS (siRNAs)는 dsRNA 트리거 7-9과 같은 순서를 포함하는 세포질 mRNAs의 강력한 일련의 특정 저하를 두 번 좌초 RNA (dsRNA)과 결과에 의해 시작되는 RNAi 경로의 효과기 분자 수 있습니다. dsRNA에 의해 시작 포스트 transcriptional 유전자 입을 메커니즘은 모든 eukaryotes에서 발견되었습니다 것은 지금까지 공부하고, RNAi는 급속하게 기능 게놈 연구와 다른 응용 프로그램 10 도구로 생물의 다양한 개발되었습니다. RNAi는 유전자 조작에 대한 대체 방법을 사용할 수 없거나 신뢰할 수 5,11 아르 진드기 및 다른 유기체에서 가장 널리 사용되는 유전자 입을 기술되었다. 진드기의 유전적 특성은 RNAi 12,13의 최근 응용까지 제한되었습니다. RNAi를 사용할 것으로 짧은 시간에, 그것은 틱 유전자 기능을 연구를위한 유용한 도구로, 경마 병원체 인터페이스의 특성 및 심사와 진드기 항원 보호 14 특성 것으로 판명되었습니다. 여기에, unfed 거려에 dsRNA의 주입을 통해 RNAi에 대한 방법을 설명합니다. 그것은이 실험 방법에서 얻은 지식은 기본적인 생물 학적 시스템의 이해와 틱 infestations을 제어하고 체크 통한 병원균 15-19의 전송을 방지하기 위해 백신의 발전에 현저하게 기여할 가능성이 높습니다.

unfed 거려에 dsRNA의 주입에 의한 RNA 간섭 (RNAi)의 방법을 설명합니다. RNAi는 유전자 조작의 다른 방법의 사용이 제한되었습니다 진드기에서 가장 널리 사용되는 유전자 입을 기술입니다.

진드기의 RNA 간섭

진드기는 야생 동물, 가축 및 인간의 필수 혈식성 외부 기생충이며, 모기에 이어 세계적으로 두 번째로 중요한 매개체로 간주됩니다...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 주입을 통한 진드기의 RNA 간섭 기술을 입증하는 것입니다. 이는 먼저 관심 유전자의 이중 가닥 RNA를 합성함으로써 수행됩니다. 그 다음 RNA를 진드기에 주입하고, 이후 24시간 동안 습도 챔버에 보관합니다.이 유지 기간이 지난 후, 진드기를 양과 같은 동물에 붙여 흡혈하게 합니다. 체중, 탈피 및 난 위치와 같은 흡혈 파라미터와 real-time R-T-P-C-R을 통한 표적 유전자 또는 관심 유전자의 발현을 측정합니다. 최종적으로, 진드기의 생물학적 파라미터 평가와 real-time R-T-P-C-R을 이용한 유전자 발현 분석을 통해 표적 유전자 억제가 진드기 생물학에 미치는 영향을 입증하는 결과를 얻을 수 있습니다.저희 연구팀은 진드기와 병원체 사이의 접점에서 발생하는 분자적 사건들을 규명하여, 이러한 기초 정보를 바탕으로 진드기 감염 및 인간과 동물로의 병원체 전파를 제어하는 방법을 개발하는 연구를 수행하고 있습니다. RNA 간섭은 진드기의 유전적 조작이 가능한 유일한 방법이기 때문에 이 연구에서 필수적인 도구로 부상했습니다. 많은 진드기 유전자의 기능은 아직 알려지지 않은 상태입니다.RNA 간섭은 교미, 번식, 섭식, 소화, 타액선 기능 및 병원체 전송을 위한 진드기의 매개 능력 등 진드기 생물학의 여러 측면에서 진드기 유전자와 유전자 발현의 역할을 정의할 수 있게 해줍니다. 본 절차의 시연은 본 연구실의 진드기 RNA 간섭 팀인 Ed Lewin 박사, 대학원생 Busby 및 제가 진행하겠습니다. 이중 가닥 RNA를 생성하려면, 먼저 RNA의 인 비트로(in vitro) 전사를 위한 T7 프로모터 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 합성하십시오.예를 들어, derma center vari lesin의 경우입니다. 여기에 표시된 oligonucleotide 프라이머 D eight A a T 75 및 D eight DVT 73를 사용하십시오. 각 oligonucleotide 프라이머 10 picomoles와 tick total RNA 1~10 nanograms를 사용하여 R-T-P-C-R로 표적 유전자를 증폭합니다.다음으로, PCR 산물을 정제하십시오. 그런 다음 8 µL 또는 약 100 ng을 사용하여 이중 가닥 RNA를 합성합니다. 주입을 위한 진드기를 준비하려면, 먼저 수돗물, 3% 과산화수소, 증류수 2회, 70% 에탄올, 그리고 마지막으로 증류수로 2회 세척하는 일련의 과정을 거치십시오.각 세척 단계는 50 milliliter 일회용 원심분리 튜브에 넣고 흔들어 수행합니다. 그 후 고운 망의 와이어 스크린을 통해 용액을 따라내어 제거합니다. 진드기를 종이 타월 위에서 건조시킨 다음, 실험에 따라 20~50마리씩 그룹으로 분주합니다.각 그룹을 밀폐 가능한 뚜껑이 있는 1.25 ounce 플라스틱 컵에 넣고, 각 컵에 실험 그룹 이름을 표시합니다. 다음으로, 주입 과정을 수행할 3명으로 구성된 RNAi 팀을 구성합니다. 첫 번째 사람은 빨간색 치과용 왁스 3 x 6 inch 시트에 부착된 양면 테이프 위에 각 진드기를 배치합니다.두 번째 연구원은 진드기에 주사하고, 세 번째 연구원은 주사 후 진드기를 모니터링합니다. 진드기를 활성화하기 위해 이산화탄소를 분사한 뒤, 살아있는 진드기의 수를 세어 실험군 번호가 표시된 컵으로 옮깁니다. 모든 팀원은 일회용 장갑을 착용해야 합니다. 진드기 주사 과정을 시작하려면, Dumont 미세 핀셋을 사용하여 진드기를 잡은 뒤 빨간색 치과용 왁스 시트에 부착된 양면 테이프 위에 진드기의 배면이 위로 오도록 놓습니다. 진드기를 5마리씩 그룹으로 밀착시켜 배치합니다. 다섯 마리 진드기 모두의 구강 부위 위에 작은 마스킹 테이프 조각을 붙입니다.더욱 확실하게 고정하기 위해, 진드기 주입자가 주입 과정을 관찰할 수 있도록 몸체의 대부분을 노출시킨 상태로 둡니다. 진드기에 주입하기 위해 29 gauge 0.5인치 바늘이 장착된 일회용 인슐린 주사기를 사용하여 외골격 복면의 우하단 영역에 구멍을 뚫습니다. 다음으로, 45도 베벨 팁이 있는 33 gauge 1인치 바늘과 맞춤 제작된 Hamilton 주사기를 사용하여 0.2 to 0.5 µL의 이중 가닥 RNA 용액을 진드기에 즉시 주입하며, 이때 이중 가닥 RNA의 정확한 배치와 유지를 위해 바늘을 진드기 체강 깊숙이 삽입합니다.주입 후 액체가 일부 유출되더라도, 주입 바늘을 깊게 삽입하면 진드기 체강 내에 충분한 이중 가닥 RNA가 전달되어 유전자 억제가 일어납니다. 다만, 혈림프 손실로 인해 진드기가 폐사할 수 있으므로 과도하게 주입하지 않도록 주의해야 합니다. 진드기에 주입을 마친 직후, 미세 핀셋을 사용하여 양면 테이프에서 진드기를 떼어내 플라스틱 회복 용기에 옮깁니다.주입 후 진드기는 잠시 비활성 상태로 남아있겠으나, 곧 접시 안을 기어 다니기 시작할 것입니다. 진드기에게 이산화탄소를 불어넣어 활성화시키십시오. 진드기가 활발하게 기어 다니기 시작하면 주입 부위의 상처가 빠르게 치유되며, 대부분 생존할 가능성이 높습니다.각 실험군 내의 진드기 수를 센 다음, 밀폐 가능한 뚜껑이 있는 라벨 부착된 플라스틱 컵에 각 군을 넣습니다. 다음 실험군에 주입하기 전에 현재 군에서 죽은 진드기가 있다면 교체합니다. 신선한 3% hydrogen peroxide로 해밀턴 시린지를 채운 후 배출하여, 다음 실험군에 주입하기 전 시린지를 세척합니다.멸균수로 15회 세척한 후 다시 15회 세척합니다. Hamilton 시린지의 플런저가 구부러지지 않도록 주의하십시오. 플런저가 구부러지면 부드럽게 움직이지 않아 진드기 주사에 필요한 미세한 조작이 어려워집니다. 주입 후에는 진드기를 물과 황산칼륨으로 채운 용기가 들어 있는 챔버에 넣어 하루 동안 고습도 상태를 유지하며 보관합니다.다음으로 개별 진드기를 양에 부착된 진드기 흡혈 셀에 넣고, 주입되지 않은 수컷 또는 암컷 진드기(주입되지 않은 성별)를 동일한 수로 함께 넣어 흡혈하도록 합니다. 약 10일 동안 흡혈을 마치거나 대조군 암컷 진드기가 숙주로부터 떨어져 나갈 때 흡혈 셀에서 암컷 진드기를 수집하고 무게를 잽니다. 각 진드기 그룹을 산란이 완료될 때까지 습도 챔버에서 배양합니다. 그룹별로 모든 진드기가 생성한 알 덩어리의 무게를 측정하여 산란 상태를 평가함으로써 흡혈 후의 진드기 표현형을 평가합니다.생존한 진드기의 수를 결정하고, 진드기의 무게와 난황의 위치 및 알의 부화율을 계산합니다. 표적 유전자와 연구 목적에 따라, R-T-P-C-R을 통해 유전자 억제를 확인하기 위한 다른 분석을 수행할 수 있습니다. 흡혈 후, 대조군 주입 그룹과 이중 가닥 RNA 주입 그룹의 개별 진드기에서 침샘과 장을 해부한 다음, 개별 조직 샘플에서 총 RNA를 추출합니다.실시간 R-T-P-C-R을 통해 개별 조직의 표적 유전자 전사체를 분석하고, tick 16 s 리보솜 RNA를 기준으로 RNA 수준을 정규화합니다. gene norm 방법을 사용하여 반응 종료 시 해리 곡선을 실행함으로써 단일 앰플리콘만 형성되었는지, 그리고 모든 샘플에서 앰플리콘이 동일한 온도 범위에서 일관되게 변성되는지 확인합니다. 이후 학생 T-검정을 이용하여 대조군 주입 tick와 이중 가닥 RNA 주입 tick 간의 mRNA 수준에 대한 정규화된 CT 값을 비교합니다.여기에 기술된 프로토콜은 당사 실험실에서 다양한 외래 진드기 종의 RNAi 연구에 사용되어 왔습니다. 진드기에 주입되는 이중 가닥 RNA의 양은 진드기의 크기에 따라 달라집니다. 크기가 더 큰 진드기 종일수록 더 많은 부피를 수용할 수 있습니다.참고 문헌은 프로토콜의 동반 서면 부분에서 확인하실 수 있습니다. 프로토콜을 정확하게 수행했다면, 주입 절차 후 24시간 이내의 사망률은 5% 미만이어야 합니다. 진드이 보호 항원을 스크리닝하는 데 사용된 이중 가닥 RNA 풀을 진드이 패널에 주입한 후, 유전자 넉다운(knockdown)이 일어난 전형적인 표현형이 여기에 제시되어 있습니다.광학 현미경으로 관찰한 진드기에서 진드기 조직의 세포 퇴행이 관찰될 수 있습니다. 표현형의 변화는 기능 상실을 동반할 수도 있습니다. 예를 들어, SUBIN의 RNAi는 암컷과 성공적으로 교미할 수 없는 불임 수컷을 생성합니다. 이는 RNA 간섭 처리 후 진드기 관찰 결과에 따른 것입니다.실시간 R-T-P-C-R, 투과 전자 현미경 또는 공초점 현미경, 게놈학 또는 단백질체학을 포함하여 유전자 억제가 유전자 및 단백질 발현과 진드기 생물학에 미치는 영향을 결정하는 다른 방법들을 사용할 수 있습니다. RNA 간섭은 진드기 세포 배양에서도 수행될 수 있으며, 이는 진드기 세포와 병원체 간의 상호작용 연구를 위한 인비트로(in vitro) 방법을 제공합니다.

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

라임 질병 연구 조사는 종종 병원체 Borrelia burgdorferi, 일반적으로 몇 주 정도 소요 프로세스에 감염된 진드기의 생성을 필요로합니다. 여기 시간 이내에 수행할 수 있습니다 microinjection 기반 틱 감염 절차를 보여줍니다. 우리는 또한 진드기 이내 B. burgdorferi의 현장 지방화에 대한 immunofluorescence 방법을 보여줍니다.

틱 굿 내에서 빠른 전송과 라임 질병 병원균의 현지화을위한 방법

라임 병은 북미에서 가장 일반적으로보고 된 벡터 매개 질병입니다. 원인 물질은 보렐리 아 burgdorferi는 Ixodid 진드기에 의해 전송 spirochete 박테리아입니다. 동물 모델에서 감염의 전송 및 검출은 우리가 여기에서 설명하는 진드기의 먹이의 사용에 최적화되어 있습니다.

라임 병 연구의 변속기 및 Xenodiagnosis에 대한 동물에 진드기의 먹이

건강한 실험실에서 재배 한 진드기의 생산은 진드기 생물학 및 진드기 - 병원체 상호 작용에 대한 연구에 필수적입니다. 여기서 우리는 마우스에 비용 효과적이고 스트레스가 적은 미성숙 진드기 먹이를위한 간단한 프로토콜을 시연합니다.

사육<em&gt; Ixodes의 scapularis,</em&gt; 블랙 다리 틱 : 마우스에 미성숙 단계를 먹이

중첩 된 PCR 틱 보렐 리아 burgdorferi, Lyme 질병의 원인이 되는 에이전트에 대 한 조사를 DNA 추출에 적용 될 수 있는 민감한, 특정, 그리고 간단한 기술입니다. 초기 PCR 실험 유전자 특정 뇌관을 사용 하 여 내부 뇌관을 사용 하 여 후속 반응에 대 한 템플릿 되 긴 amplicons 생성.

중첩된 한 PCR를 사용 하 여 틱에서 라임 질병 스피로, 보렐 리아 Burgdorferi, 감지

여기 우리는 식별 및 벡터 내에서 미생물 커뮤니티의 16S rRNA 시퀀싱에 대 한 다음-세대 시퀀싱 프로토콜을 제시. 이 방법은 DNA 추출, 증폭 및 PCR, 시퀀싱 흐름 셀 및 생물 정보학에 계통 발생 정보를 시퀀스 데이터 일치를 통해 샘플의 바코드를 포함 한다.

다음-세대 16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 틱 미생물 특성

이 연구에서는 실험실 마우스에 부착된 캡슐을 사용하여 하드 틱의 님프및 애벌레 단계를 위한 먹이 시스템이 개발되었습니다. 수유 캡슐은 유연한 재료로 만들어졌으며 적어도 일주일 동안 마우스에 단단히 부착되어 있어 진드기 공급에 대한 편안한 모니터링을 가능하게 합니다.

실험실 마우스에 미숙한 하드 진드기 단계 감염에 대 한 캡슐 기반 모델

본 프로토콜은 진드기 타액선 및 정제된 세포밖 소포로부터 마이크로RNAs의 단리를 기술한다. 이것은 일반적으로 사용되는 시약과 공급을 결합하는 보편적 인 절차입니다. 이 방법은 또한 적은 수의 틱을 사용할 수있게하여 쉽게 시퀀싱 할 수있는 양질의 microRNA를 생성합니다.

Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures 및 Extracellular Vesicles에서 microRNAs의 분리

본 프로토콜은 진드기 배아를 주입하는 방법을 기술한다. 배아 주입은 유전자 조작을 위해 트랜스제닉 라인을 생성하는 데 선호되는 기술입니다.

검은다리진드기의 유전자 편집을 위한 배아 주입 기술, Ixodes 견갑골

여기에 제시된 것은 다양한 진드기 수명 단계의 부분적 또는 전체 충혈을 허용하기 위해 인공 막 시스템을 통해 시험관 내에서 진드기를 혈액으로 공급하는 방법입니다.

Ixodes 견갑골에 대한 진드기 인공 막 공급

이 기사에서는 임상 연구를 위해 인간을 유충 Ixodes scapularis 에 노출시키는 방법을 제시합니다. 이 기술은 비교적 간단하고 연구 지원자가 견딜 수 있으며 실험적 필요에 따라 수정할 수 있습니다. 인간 피험자를 대상으로 하는 이러한 연구는 해당 규제 당국이 승인한 임상 연구 프로토콜에 따라 수행되어야 합니다.

유충 Ixodes scapularis 진드기에 대한 인간의 실험적 노출을 위한 모델

여기에서는 먹이를 먹인 개별 진드기를 해부한 후 타액, 혈림프, 침샘 및 중장을 수집하여 진드기 매개 병원체의 조직 특이적 국소화를 연구하여 벡터 능력 및 병원체-미생물군집 상호 작용에 대한 이해를 높이는 프로토콜을 제시합니다.

개별 진드기(Acari: Ixodidae)에서 타액, 혈림프, 침샘 및 중장 추출

배우세요 진드기 RNA 간섭 기법으로 특정 유전자를 침묵시켜 진드기 생물학을 연구하는 방법을. 이 기법은 진드기 매개 질병 관리 전략 개발에 필수적인 도구입니다.

진드기의 RNA 간섭

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