진드기의 RNA 간섭

이 절차의 전반적인 목표는 주사에 의한 진드기의 RNA 간섭 기술을 입증하는 것입니다. 이것은 먼저 관심 유전자 또는 유전자의 이중 가닥 RNA를 합성하여 수행됩니다. 그런 다음 RNA를 진드기에 주입한 후 24시간 동안 습도 챔버에 보관합니다.

이 보유 기간이 지나면 진드기는 마침내 양 진드기와 같은 동물을 먹을 수 있습니다. 체중, 탈피 및 난자 위치와 같은 먹이 매개변수와 실시간 R-T-P-C-R에 의한 표적 유전자 또는 관심 유전자의 발현이 결정됩니다. 궁극적으로, 실시간 R-T-P-C-R에 의한 진드기 생물학적 매개변수 및 유전자 발현의 평가를 통해 진드기 생물학에 대한 표적 유전자의 침묵 효과를 입증하는 결과를 얻을 수 있습니다.

우리 그룹은 진드기 병원체 계면에서 분자 이벤트를 특성화하여 이 기본 정보를 사용하여 진드기 감염을 통제하고 인간과 동물에게 병원체를 전파하는 방법을 개발하기 위해 진드기를 연구합니다. RNA 간섭은 진드기의 유전자 조작에 사용할 수 있는 유일한 방법이기 때문에 이 연구에서 필수적인 도구로 부상했습니다. 많은 진드기 유전자의 기능은 알려져 있지 않다.

RNA 간섭을 통해 우리는 짝짓기, 번식, 먹이, 소화, 타액선 기능 및 병원체 전달을 위한 진드기 매개체 역량을 포함한 진드기 생물학의 여러 측면에서 진드기 유전자 및 유전자 발현의 역할을 정의할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 진드기 RNA 간섭 팀인 대학원생 에드 르윈 박사(Dr. Ed Lewin)와 버스비(Busby)와 저입니다. 이중 가닥 RNA를 생성하기 위해 먼저 RNA의 체외 전사를 위해 T 7개의 프로모터 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성합니다.

예를 들어, derma center vari lesin. 여기에 표시된 올리고뉴클레오티드 프라이머 D 8 A, T 75 및 D 8 DVT 73을 사용합니다. 각 올리고뉴클레오티드 프라이머 10피코몰과 1-10나노그램의 진드기 총 RNA를 사용하여 R-T-P-C-R로 표적 유전자를 증폭합니다.

다음으로, PCR 산물을 정제합니다. 그런 다음 8마이크로리터 또는 약 100나노그램을 사용하여 이중 가닥 RNA를 합성합니다. 먼저 주사를 위해 진드기를 준비하려면 다음 일련의 용액, 수돗물 3% 과산화수소 증류수 2회, 70% 에탄올 및 증류수로 2회 최종 세척으로 진드기를 세척합니다.

50ml 일회용 원심분리기 튜브를 흔들어 세척할 때마다 수행합니다. 그런 다음 미세한 메쉬 와이어 스크린을 통해 솔루션을 디캔팅합니다. 종이 타월로 진드기를 말리는 것을 막은 다음 실험에 따라 진드기를 20-50 개의 그룹으로 나눕니다.

각 그룹을 꼭 맞는 뚜껑이 있는 1.25온스 플라스틱 컵에 넣고 각 컵에 실험 그룹에 라벨을 붙입니다. 다음으로, 주입 과정을 수행할 3명으로 구성된 RNAi 팀을 구성합니다. 첫 번째 사람은 3 x 6인치 크기의 빨간 치과용 왁스 시트에 부착된 이중 접착 테이프에 각 진드기를 놓습니다.

두 번째 사람은 진드기를 주사하고 세 번째 사람은 주사 후 진드기를 모니터링하여 진드기에 이산화탄소를 흡입하여 진드기를 활성화하고 살아있는 진드기를 계수하여 실험 그룹 번호가 표시된 컵으로 옮깁니다. 모든 팀원은 일회용 장갑을 착용해야 합니다 진드기 주입 과정을 시작하려면 dumont 미세 집게를 사용하여 진드기를 포획하고 빨간색 치과 왁스 시트에 부착된 이중 접착 테이프에 복부 쪽이 위로 향하게 놓습니다. 5 개의 진드기 모두의 입 부분에 작은 마스킹 테이프를 붙입니다.

진드기를 더 제지하기 위해, 진드기 주사기가 주입 과정을 관찰할 수 있도록 신체의 대부분을 노출시켜 두십시오. 진드기를 주입하려면 29게이지 1/2인치 바늘이 장착된 모노 배출 인슐린 주사기를 사용하여 외골격 복부 표면의 오른쪽 하단 사분면에 구멍을 뚫습니다. 다음으로, 맞춤형 Hamilton 주사기와 45도 경사 지점의 33 게이지 1인치 바늘을 사용하여 0.2-0.5마이크로리터의 이중 가닥 RNA 용액을 진드기에 즉시 주입하고, 이중 가닥 RNA의 배치 및 유지를 보장하기 위해 바늘을 진드기 구멍에 잘 놓습니다.

주사 후 체액이 방출되더라도 주사를 위해 바늘을 깊숙이 삽입하면 충분한 이중 가닥 RNA가 진드기 구멍에 침착되어 유전자 침묵을 유발하지 않도록 주의를 기울여야 합니다. 진드기를 주사하면 혈림프가 손실되고 진드기가 죽을 수 있습니다. 진드기를 주입한 직후, 가는 집게로 이중 접착 테이프에서 진드기를 집어 플라스틱 회수 용기에 넣습니다.

진드기는 주사 후 잠시 비활성 상태로 유지되지만 곧 접시 주위를 기어 다니기 시작할 것입니다. 진드기에 이산화탄소를 불어넣어 진드기를 활성화한다. 일단 진드기가 기어 다니며 활동하기 시작하면, 주사 상처는 빠르게 치유되고 생존할 가능성이 매우 높습니다.

각 실험 그룹의 진드기를 세고 각 그룹을 단단히 끼워진 뚜껑이 있는 라벨이 붙은 플라스틱 컵에 넣습니다. 다음 실험 그룹에 주입하기 전에 현재 그룹에서 죽는 진드기를 교체하십시오. 다음 실험군을 주입하기 전에 해밀턴 주사기를 세척하여 주사기에 3%의 과산화수소를 주입한 다음 배출합니다.

15회 후 멸균수로 15회 세척합니다. 해밀턴 주사기의 플런저가 구부러지지 않도록 주의하세요, 그렇지 않으면 플런저가 부드럽게 움직이지 않고 진드기 주입에 필요한 부드러운 터치에 반응하지 않습니다. 주사 후 진드기를 물과 황산 칼륨으로 채워진 용기가있는 챔버에 넣으면 높은 습도를 유지하고 하루 동안 유지할 수 있습니다.

다음으로, 개별 진드기를 양에게 붙어 있는 진드기 먹이 세포에 넣고, 주사하지 않은 성별에 관계없이 동일한 수의 unin 주입된 수컷 또는 암컷 진드기를 먹이로 삼도록 합니다. 약 10일 동안 먹이를 다 먹은 후 또는 대조군 암컷이 떨어졌을 때 숙주는 난자 위치가 완료될 때까지 습도실에서 각 진드기 그룹을 배양합니다. 먹이 주기 후 진드기 표현형을 평가하기 위해 그룹의 모든 진드기가 생산하는 알 질량의 무게를 측정하여 그룹별 난자 위치를 평가합니다.

살아남은 진드기의 수를 확인하고 진드기 무게와 난자 위치 및 난자의 생식력을 계산합니다. 표적 유전자 및 연구 목적에 따라 R-T-P-C-R에 의한 유전자 침묵을 확인하기 위해 다른 분석을 수행할 수 있습니다. 먹이를 준 후, 대조군 및 이중 가닥 RNA 주입 그룹에서 개별 진드기의 타액선과 내장을 해부한 다음 개별 조직 샘플에서 총 RNA를 추출합니다.

실시간 R-T-P-C-R로 개별 조직의 표적 유전자 전사체를 분석하고 tick 16 s 리보솜 RNA에 대한 RNA 수준을 정규화합니다. 유전자 규범법(gene norm Method)을 사용하여 반응 종료 시 dissociation curves를 실행하여 하나의 앰플리콘만 형성되고 모든 샘플에 대해 동일한 온도 범위에서 앰플리콘이 일관되게 변성되도록 하고, 대조군 주입 및 이중 가닥 간의 mRNA 수준에 대한 정규화된 CT 값을 비교합니다. RNA는 학생의 T-테스트를 사용하여 진드기를 주입했습니다.

여기에 설명된 프로토콜은 다양한 외래 진드기 종의 RNAi에 대해 당사 실험실에서 사용되었습니다. 진드기에 주입된 이중 가닥 RNA의 양은 진드기의 크기에 따라 다릅니다. 더 큰 진드기 종은 더 많은 부피를 수용할 수 있습니다.

참고 문헌은 프로토콜의 동반된 서면 부분에서 찾을 수 있습니다. 프로토콜이 올바르게 수행되면 24시간 후 주사 절차에서 5% 미만의 폐사율을 얻어야 합니다. 진드기의 유전자 녹다운 후 전형적인 표현형이 여기에 나와 있는데, 진드기 보호 항원을 스크리닝하는 데 사용된 이중 가닥 RNA 풀을 진드기 패널에 주입했습니다.

광학 현미경으로 검사한 진드기에서 진드기 조직에서 세포 변성이 관찰될 수 있습니다. 표현형 변화는 또한 기능 상실을 동반할 수 있습니다. 예를 들어, SUBIN의 RNAI는 RNA 간섭 및 진드기를 따라 암컷과 성공적으로 짝짓기를 할 수 없는 불임 수컷을 초래합니다.

유전자 및 단백질 발현과 진드기 생물학에 대한 유전자 침묵의 영향을 결정하기 위해 실시간 R-T-P-C-R, 광 전자 또는 컨포칼 현미경을 포함한 다른 방법을 사용할 수 있습니다. 유전체학 또는 단백질체학. RNA 간섭은 진드기 세포 배양에서도 수행될 수 있으며 진드기 세포 병원체 상호 작용 연구를 위한 시험관 내 방법을 제공합니다.