Name: 재조합 Adeno - 관련 바이러스 혈청형 3 벡터에 의해 간암 세포의 고효율 전달 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 2 s
Description: 학습하세요 AAV3 벡터를 이용한 간암 세포의 고효율 유전자 전달 방법을. 이 기술은 293 세포에서 바이러스를 생산하고 정제하여 인간 간암 세포에 효과적으로 유전자를 도입하는 프로토콜을 제공합니다.

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우리는 DRS 감사합니다. 넉넉한 Hep293TT 세포를 제공하는 재조합 AAV3 및 AAV - EGFP의 plasmids, 각각 박사 게일 톰린슨 그들의 종류의 선물 R. 주드 Samulski과 샤오 샤오. 이 연구는 국립 보건원에서 공중 보건 서비스 권한을 부여 부여 R01 HL - 076901, R01 HL - 097088, 및 P01 DK - 058327 (프로젝트 1) (로)에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. 재조합 Adeno - 관련 바이러스 혈청형 3 (rAAV3) 벡터의 포장 <ol><li> 웹사이트로 이동 : " <a href="http://www.geguchadze.com/calc">http://www.geguchadze.com/calc</a> "과 DNA의 양을 계산합니다. </li><li> FBS와 항생제없이 중간에 미리 혼합 plasmids pHelper (아데노 바이러스 도우미), pACG2c3 (AAV 도우미) 및 pdsAAV - CB - EGFP (rAAV 벡터). 총 볼륨 열 15cm 두 접시를 위해 8750 μL해야합니다. </li><li> 단계 1.2 DNA 솔루션으로 PEI의 직접 1,250 μL를 (0.1 % M / V, Polysciences, 고양이 # 23966, 산도 4.5) 추가합니다. 몇 초 동안 소용돌이 DNA - PEI 솔루션입니다. </li><li> 실온 (RT)에서 5 분 복잡한 형태로 품어 DNA - PEI 솔루션입니다. </li><li> 15cm 2 판 당 DNA - PEI 솔루션 1 ML을 추가합니다. </li><li> 신선한 25 ML 완벽한 매체로 대체, 4 시간 후 배지를 제거 10% FBS (C - DMEM). </li><li> 세븐티 이시간 이후 transfection, 긁어 세포와 250 ML 원뿔 원심 튜브에 부어. </li><li> 4 3,000 rpm으로 회전, ° 10 분 C. 뜨는을 하거라. </li><li> 다시 중지 RB TMS 버퍼 (50 MM 트리스 - HCL, 150 MM NaCl, 산도 8.0) 5 ML에있는 세포 펠릿. 새로운 15 ML 원뿔 관을 전송합니다. </li><li> 37 10 분 및 해동을위한 드라이 아이스 - 에탄올 욕조에 고정 ° C 10 분. 세 번 반복합니다. </li><li> 4.8 M MgCl 2 단계 중 1 μL 및 Benzonase 2 μL (25 U / μL, Novagen, 고양이 # 70664-3)을 추가합니다. 37 소용돌이와 부화 ° 40 분 C. </li><li> 40 분 ° 4, 4000 RPM에서 C를 스핀 다운 및 (lysate를 명확히) 표면에 뜨는를 수집합니다. </li><li> 15 %의 두 ML, 25 % 2 ML, 40 %의 1.5 ML 후 13 ML 빠른 시일 원심 분리기 튜브 (베크 고양이 # 342413), 아래로 위로부터 하중 iodixanol 기울기 (OptiPrep, 고양이 # 1114542)에서 60 % iodixanol 1.5 ML. iodixanol 그라디언트의 상단에 뜨는 (1.12 단계)를로드합니다. RB TMS 버퍼로 튜브를 입력합니다. </li><li> 16에서 1 시간 동안 75,000 rpm으로 원심 분리기 ° C 베크맨 90Ti의 로터를 사용합니다. </li><li> 40-60% 경계에 주사기를 삽입하여 40 % iodixanol 분율를 수집합니다. </li><li> 한 50 ML 원뿔 관에서 40 % iodixanol 분율을 전송하고 버퍼 40 ML까지하게 (20 MM 트리스, 15 MM NaCl, 산도 8.5). </li><li> HiTrap Q HP 열 (GE 헬스케어, 고양이 # 17-1154-01)를 사용하여 여과 장치 조립. 다음 버퍼로 컬럼을 씻어 : 버퍼의 25 ML (20 MM 트리스, 15 MM NaCl, 산도 8.5), 버퍼 B (10 MM 트리스, 500 MM NaCl, 산도 8.5) 25 ML, 버퍼의 50 ML; 버퍼에서 바이러스 샘플의 40 ML, 버퍼 50 ML (20 MM 트리스, 15 MM NaCl, 산도 8.5), 버퍼 C (20 MM 트리스, 175 MM NaCl, 산도 8.5) 20 ML; </li><li> 20 ML 아폴로 Concentrators (올비털 Biosciences)에 버퍼 C를 수집합니다. 4 3,000 rpm으로 원심 분리기, ° C 10 분. </li><li> 흐름 -을 통해을 취소하고 4, 3000 RPM 20 냉장 PBS의 ML과 원심 분리기를 추가 ° C, 10 분. </li><li> 흐름 -을 통해를 버리고 차가운 PBS 500 μL를 추가합니다. -80에서 작은 aliquots에 얼어 붙 어서 실리콘 - 대우 Eppendorf 튜브 및 저장하는 멤브레인 및 전송 ° C.에서 벡터를 씻어 </li></ol> 2. rAAV3 벡터 Titers의 결정 <ol><li> 얼음 Eppendorf 튜브에 바이러스를 정화 10 μL를 녹여. ddH 2 O. 40 μL 추가 </li><li> Benzonase의 0.2 μL (25 U / μL, Novagen, 고양이 # 70664)을 추가하고 37 품어 ° C를 1 시간. </li><li> 다른 Eppendorf 튜브에 플라스미드 표준 (0.2 NG / μL) 50 μL를 가져가라. </li><li> 65 각 튜브와 부화 ° C 30 분 100 MM NaOH 50 μL를 추가합니다. </li><li> 적어도 5 분 즉시 얼음 칠. </li><li> 바이오 점 여과지 (바이오 - 래드, 고양이 # 1620161)에 따라 전송 막 (Millipore, 고양이 # INYC00010)을 잘라 버릴거야. 20 분 세 여과지와 10X SSC의 막을 린스. </li><li> 슬롯 얼룩 SF 장치 (바이오 점, 고양이 # 170-6542)를 설정합니다. 진공 플라스크에 연결하고 슬롯 얼룩 장치에 10X SSC 100 μL를 추가합니다. </li><li> 단계 2.5의 샘플 각 20x SSC 100 μL와 배의 로딩 색소 1 μL를 추가합니다. </li><li> 슬롯 얼룩 장치에서 막에 각 시료 100 μL를로드합니다. </li><li> 샘플의 각으로 10X SSC의 또 다른 100 μL를 추가합니다. </li><li> 모든 예제는 세포막을 통해 될 때까지 단계 2.9와 2.10를 반복합니다. </li><li> 슬롯 얼룩 장치를 분해하여 세포막을 제거하십시오. 경감 링커 SL - 1000 자외선 Crosslinker으로 넣어요. "에너지"를 켭니다 "최적 Crosslink"(쇼 1200) 및 "시작"푸시. </li><li> 연어 정자의 종기 일 ML (SS) DNA (피셔, 고양이 # NC9753983) 5 분. 적어도 5 분 얼음 칠. </li><li> ddH 2 O, 15 ML의 27.5 ML을 혼합하여 사전 하이브 리다이 제이션 솔루션을 준비 20x SSC, 50x Denhardt의 솔루션 5 ML, 20 % SDS의 1.25 ML, PolyA의 0.25 ML과 단계 2.13에서 SS DNA 1 ML. </li><li> ° 하이브리드화 챔버에서 C 야간 65 덮인 유리 실린더와 부화에 사전 하이브 리다이 제이션 솔루션의 25 ML에 멤브레인을 일시 중지합니다. </li><li> ddH 2 O 10 μL의 50 NG DNA 템플릿을 희석. 100 삶아 ° C 이상에서 5 분 즉시 얼음에 5 분 및 진정하십시오. </li><li> 1 분에 대한 RT에서 3,000 rpm으로 원심 분리기. 10 MM 3 dNTPs 2 μL (dCTP를 부족), Hexanucleotide 믹스 2 μL (로체, ​​고양이 # 11277081001) Klenow 1 μL (로체, ​​고양이 # 11008404001)와 α -32 P - dCTP 5 μL를 추가합니다. 37 ° C 10 분 알을 품다. </li><li> 2 분 3,000 RPM에서 G - 50 열 (GE 헬스케어, 고양이 # 27-5330-01) 원심 분리기. 열에 단계 2.17에서 프로브를로드합니다. 2 분 3,000 rpm으로 원심 분리기와 흐름을 통해 수집합니다. </li><li> 방사능 백작. ° C 즉시 얼음에 5 분 및 진정에 대한 최소한 5 분 100에 프로브를 끓여. </li><li> 막과 사전 하이브 리다이 제이션 솔루션에 프로브를 (6x10 5 CPM / ML) 추가합니다. </li><li> 하이브리드화 챔버 65 ° C에서 밤새 품어. </li><li> 하이브 리다이 제이션 솔루션을 무시하고 15 분 RT에서 2X SSC 0.1 % SDS에서 막을 린스. </li><li> 솔루션을 버리고 ° C 30 분 65 0.1x SSC 0.1 % SDS에서 막을 린스. </li><li> 솔루션을 삭제하고 알티 간략에서 0.1x SSC에서 막을 린스. </li><li> 6 시간 -80 ° C에서 필름을 노출하고 필름을 개발합니다. 전형 결과는 그림 1에 표시됩니다. </li></ol> 3. rAAV3 벡터 - 중재 전달 및 인간 간암 세포에 Transgene 표현 <ol><li> 96 - 웰 플레이트의 각 우물에 씨앗 1x10 4 셀 (Huh7 또는 Hep293TT 중). 최소한 18 시간 동안 humidified CO 2 인큐베이터에서 부화. </li><li> 96 - 웰 플레이트에서 매체를 제거합니다. </li><li> FBS와 항생제없이 중간 50 μL로 두 번 세포를 씻고 제거합니다. </li><li> 5000 vgs / 휴대폰 FBS와 항생제와 rAAV 벡터 않고 중간의 50 μL를 추가합니다. </li><li> 4 시간 동안 CO 2 배양기에서 번호판을 품어. </li><li> 매체 폐기하십시오. 전체 매체 50 μL로 두 번 세포를 씻고 제거합니다. </li><li> 각 잘하는 C - DMEM 150 μL를 추가하고 72 시간 CO 2 배양기에서 접시를 부화하고, 형광 현미경을 사용하여 EGFP 식을 시각화 (DMI 4000B을, Leica 마이크로 시스템즈). </li><li> 바이러스에 감염된 세포의 세 웰스의 이미지는 ImageJ 분석 소프트웨어 (NIH, 베데스다, MD, 미국)에 의해 양적 분석하고 있습니다. </li><li> Transgene 표현은 영상 분야마다 녹색 형광의 총면적 (픽셀 2)로 평가됩니다. 전형 결과는 그림 2에 표시됩니다. </li><li> Transgene 표현도 유동세포계측법에 의해 결정하실 수 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 위에서 설명한 프로토콜에 따라, 하나는 효율적으로 AAV의 혈청형 벡터를 생성할 수 있습니다. 전형적인 수확량은 500 μL ~ 10 11 vgs 포함 / 벡터 주식을 정화의 μL. 벡터 주식의 순도가와 양적 DNA 슬롯 blots에서 하이브 리다이 제이션 신호를 비교하여하고 Benzonase는 소화하지 않고 결정됩니다. 효율적으로 세포 라인 - hepatoblastoma (HB)와 간세포암 (HCC) - rAAV3 벡터 transduce 인간 간암을 정화. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. rAAV3 벡터의 titers을 결정하는 정량 DNA 슬롯 얼룩 분석. Benzonase (맨 윗줄)과 소화 바이러스 주식, 정화의 2 배 dilutions는 32 P - 라벨 EGFP 특정 DNA 프로브와 양적 DNA 슬롯 blots에서 분석했다. AAV3 벡터의 titer는 1 NG (중앙 행) 또는 멤브레인에 로드된 AAV - EGFP 플라스미드 기준 10 NG (하단 행)과 비교에 의해 결정되었다. 숫자는 DNA 사본과 일치합니다. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 재조합 AAV 인간 간암 세포에 벡터 중재 transgene 표현. Hep293TT 세포, 최근에 설립된 인간 hepatoblastoma 전지 라인 4, 중 모의에 감염된 (왼쪽 패널)되었다, 또는 2 시간 동안 37 ° C에서 scAAV2 - EGFP 또는 scAAV3 - EGFP 벡터 중 5,000 vgs / 세포와 transduced. Transgene 표현 72 시간 이후 도입은 형광 현미경을 사용하여 시각되었습니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

비 병원성 인간의 파르 보 바이러스, adeno - 관련 바이러스 (AAV)에 따라 재조합 벡터가 개발하고, 유전자 치료 임상 시험 5 여러 사용 현재되었습니다. 이전에는 10 개의 가장 일반적으로 사용되는 AAV의 serotypes의 일반적으로 AAV3 벡터의 전달 효율은 체외에서 생체내 1 두, 특히 낮은 것으로보고되었습니다. 그러나, 최근 관찰되는 AAV3로 유동세포계측법 2 양적 결정 매우 잘 벡터 transduce 인간 간암 세포 라인, 그 AAV3이에 바인딩 및 항목에 대한 공동 수용체 세포로 인간 hepatocyte 성장 인자 수용체 (hHGFR)를 활용 세포 3, 강하게 특히 일반적으로 인간의 간암 세포에 대한 AAV3의 선택 조직 tropism, 인간 간암 세포를 권장합니다. 그러나, 이후 AAV3 벡터는 또한 정상적인 인간 hepatocytes에게 효율적으로 2 transduce, 생체내에서 암 유전자 치료 응용 프로그램에서 자신의 잠재적인 사용에 부정적인 영향을 것입니다. 이 잠재적인 문제를 우회하는 한 가지 가능한 전략과 관련된 transcriptional 타겟팅 정상 hepatocytes에 의해 선택적으로 종양에 의해 생산되는 유전자 제품을 식별하여 암 세포하지만. 정상 hepatocytes은 일반적으로 매우 소량을 생산 이후 예를 들어, 이전의 연구 결과, α - 페토 프로테인 (AFP)의 혈청 수준이 존재, 진행 및 / 또는 간 암의 특정 유형의 reoccurrence를 추적하기위한 구체적인 표지로 사용하는 것으로 나타났습니다 이 단백질. 사실, 우리는 간암 세포에서 transgene 표현을 대상으로 AFP 프로 모터를 포함하는 AAV3 벡터를 사용한 있지만 정상적 hepatocytes 2, 연구의 현재 간암의 murine 이종 이식 모델에서이 접근 방식의 효능을 테스트하기 위해 진행되고 있습니다. 우리가 추가적인 연구에서 우리는 다양한 AAV의 혈청형 벡터의 전달 효율이 상당히 6-14 바이러스 capsids의 표면 노출 티로신 잔류의 사이트 이동 돌연변이 유발에 의해 증가된 수 있습니다 관찰했습니다. 6 7 표면 노출 tyrosines도 AAV3에 보존되어 있기 때문에, 우리는 이러한 잔류물의 사이트 감독 돌연변이 유발을 수행하고 티로신 - 돌연변이 AAV3 벡터의 전달 효율이 대폭 인간 간암 세포 (게시되지 않은 데이터)에 향상된 것을 관찰했습니다. 연구는 또한 인간 hepatoblastoma 및 간세포암에 대한 마우스 이종 이식 모델에서 티로신 - 돌연변이 AAV3 벡터의 안전성과 효능을 평가하기 위해 현재 진행되고 있으며, 성공적인 경우, 최적의 티로신 - 돌연변이 AAV3의 혈청형 벡터는 인간의 간을를 타겟팅하는 유용하다는 것을 증명하기 수 있습니다 잠재적인 유전자 치료에 대한 암.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-0170CM</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q HP 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>연어 정자 DNA</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9753983</td><td></td></tr><tr><td>Iodixanol 구배액</td><td>OptiPrep</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>G-50 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr></tbody></table>

재조합 adeno - 관련 바이러스 혈청형 3 벡터에 의해 간암 세포의 고효율 전달

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors 

비 병원성 인간 파르 보 바이러스에 따라 재조합 벡터는, adeno - 관련 바이러스 2 (AAV2)가 개발하고, 유전자 치료 임상 실험의 여러 사용 현재되었습니다. 최근 추가 AAV의 serotypes의 숫자도 다양한 크고 작은 동물 모델 1 조직 tropism 선택을 전시 게재된 보유하고있는, 고립되었습니다. 10 가장 일반적으로 사용되는 AAV의 serotypes의 AAV3는 체외에서뿐만 아니라 생체내의 세포와 조직을 transducing에 의해 지금까지 가장 효율적입니다. AAV3는 바인딩을위한 공동 수용체 세포로 인간 hepatocyte 성장 인자 수용체를 이용하기 때문에 매우 효과적으로 세포 라인 - hepatoblastoma (HB)와 간세포암 (HCC) - 그러나, 우리가 최근에 출판된 연구에, 우리는 AAV3 벡터 인간 간암 transduce 것을 문서화해야 이러한 세포 2,3에서 항목. 이 문서에서는, 우리는 기자의 유전자를 운반 재조합 벡터로 AAV3 인간 간암 세포의 고효율 전달을 달성하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 치료 유전자를 운반 재조합 AAV3 벡터의 사용은 결국 인간의 간 암의 가능성 유전자 치료가 발생할 수 있습니다.

이 문서에서는, 우리는 인간 간암 세포를 타겟팅하는 가장 효율적인 벡터로 adeno - 관련 바이러스 혈청형 3 (AAV3)의 신분증을 설명합니다.

재조합 Adeno - 관련 바이러스 혈청형 3 벡터에 의해 간암 세포의 고효율 전달

비병원성 인간 파르보바이러스인 아데노 부속 바이러스 2(AAV2)를 기반으로 한 재조합 벡터가 개발되었으며, 현재 ...에서 사용되고 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 인간 간암 세포를 효율적으로 형질도입할 수 있는 활성 상태의 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus) 혈청형 3 벡터를 제작하는 것입니다. 이는 먼저 세 가지 서로 다른 플라스미드를 2 9 3 세포에 동시에 형질전환함으로써 이루어집니다. 이 절차의 두 번째 단계는 2 9 3 세포 내에서 조립된 AAV 3 비리온을 정제하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 정제된 AAV3 벡터 스톡의 역가를 결정하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 정제된 AAV3 벡터를 사용하여 인간 간암 세포를 형질도입하는 것입니다. 최종적으로 형광 현미경을 통해 인간 간암 세포에서 EGFP 단백질이 높게 발현된 결과를 얻을 수 있습니다.기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 인간 간암 세포에서 높은 유전자 전달 및 발현 효율을 달성하는 것입니다. 이 방법은 AAV 3 벡터 생성에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 더 널리 사용되는 AAV 2 벡터와 같은 다른 시스템에도 적용 가능합니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 지루할 수 있는 여러 단계가 포함되어 있어 어려움을 겪을 수 있으며, 본 절차는 저희 연구실의 생명과학자가 시연할 예정입니다.본 프로토콜 섹션의 실험 조작은 이 절차를 시작하기 48시간 전에 조직 배양 후드 내부에서 수행합니다. transfection 당일에 세포 밀도가 70~80%가 되도록 10~15cm 조직 배양 접시에 human embryonic kidney cell line 2, 9 3을 파종합니다. 웹사이트 www.를 이용하십시오.transfection에 사용할 plasmid DNA의 양을 계산하려면 ge shae. com/calc를 이용하십시오. 정확한 plasmid DNA 부피가 계산되면, transfection을 진행하여 FBS와 항생제가 포함되지 않은 적절한 부피의 세포 배양 배지를 멸균된 15 milliliter 튜브에 피펫팅하십시오.그 다음, 필요한 양의 P helper, PACG two, C3 및 PDSA AAV C-B-E-G-F-P를 배지에 피펫팅합니다. 10 15 centimeter 플레이트 10개를 위한 총 부피는 8,750 microliters여야 합니다. 플라스미드 DNA가 포함된 배지에 PEI 1,250 microliters를 피펫팅합니다. DNA-PEI 용액을 몇 초간 볼텍싱한 후, DNA-PEI 복합체가 형성될 수 있도록 DNA-PEI 용액을 실온에서 5분 동안 인큐베이션합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 HEC 2 9 3 세포가 배양된 10 15 centimeter 플레이트를 꺼냅니다.그 다음, 각 플레이트에 1 µL의 D-N-A-P-E-I 용액을 피펫팅합니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건의 조직 배양 인큐베이터에서 4~6시간 동안 배양합니다. 4~6시간 후, 플레이트에서 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.그 다음, 10% FBS가 포함된 완전 배지 25 milliliters를 각 플레이트에 피펫팅하여 넣습니다. 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 약 72시간 동안 배양합니다. 72시간이 지나면 플레이트를 배양기에서 꺼내 조직 배양 후드로 옮깁니다.그 후 플레이트에서 배지를 흡입 제거하지 않은 상태에서, 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트 바닥의 세포층을 세포 배양 배지 속으로 긁어내립니다. 세포가 포함된 배지를 250 milliliter 원뿔형 원심분리 튜브에 붓습니다. 형질전환된 각 플레이트에 대해 이 과정을 반복하며, 각 플레이트의 내용물을 동일한 250 milliliter 원뿔형 원심분리 튜브에 모두 붓습니다.세포와 배지가 담긴 튜브를 냉각된 원심분리기로 원심분리합니다. 4°C에서 3000 rpm으로 10분간 처리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거한 다음, 펠렛에 5 mL의 RB TMS 버퍼를 피펫으로 가해 재현탁합니다. 세포 용액을 깨끗한 15 mL 원추형 원심분리 튜브로 옮깁니다.15 mL 튜브를 드라이아이스 에탄올 배스(bath)에 넣어 10분 동안 동결시킵니다. 배양 시간이 지나면 튜브를 꺼내 37 °C에서 10분 동안 둡니다. 해동을 위해 이러한 동결-해동 사이클을 2회 더 반복합니다.튜브를 몇 초간 볼텍싱합니다. 마지막 해동 단계 이후, 매 해동 시마다 4.8 molar magnesium chloride 1 µL와 25 units/µL Benzonase 2 µL를 세포 용액에 넣고 볼텍싱하여 혼합합니다.그 후 37 °C에서 40분 동안 배양합니다. 튜브를 4 °C로 냉각된 원심분리기에 넣고 4,000 rpm으로 40분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나갈 무렵, 바이러스 정제에 사용할 IAL 밀도 구배를 준비합니다. 이를 위해 13 mL 밀폐 원심분리 튜브에 15% IAL 2 mL, 25% IAL 2 mL, 40% IAL 1.5 mL 및 60% IAL 1.5 mL를 순차적으로 피펫팅하여 넣습니다.원심분리 후, 세포 펠렛이 섞이지 않도록 주의하며 원심분리 튜브에서 S 상층액을 피펫으로 옮겨 IAL 밀도 구배 위에 분주한 다음, 튜브가 완전히 찰 때까지 RB TMS 버퍼를 충분히 넣습니다. 튜브를 Beckman 90 TI 로터에 넣고 로터의 균형이 적절하게 맞았는지 확인합니다. 16 °C에서 75,000 rpm으로 1시간 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 18게이지 바늘이 장착된 5mL 주사기를 Iodixanol 농도 구배의 40~60% 경계면에 삽입하여 40% Iodixanol 분획을 수집합니다. 주사기로 조심스럽게 흡입하여 40% Iodixanol 분획을 수집합니다.주사기에서 40%IAL 분획을 50 mL 원추형 튜브에 배출합니다. 그런 다음 buffer a를 사용하여 튜브의 최종 부피가 40 mL가 되도록 채웁니다. 제조사의 지침에 따라 high trap Q HP 컬럼을 사용하여 여과 장치를 조립합니다.그 다음, 다음과 같은 용액들로 컬럼을 세척합니다. 버퍼 A 25 milliliters, 버퍼 B 25 milliliters, 버퍼 A 50 milliliters, 버퍼 A에 준비된 idal virus 샘플 40 milliliters, 버퍼 A 50 milliliters, 그리고 마지막으로 버퍼 C 20 milliliters 순으로 세척합니다. 버퍼 C는 20 milliliter Apollo 농축기에 수집합니다. 그 후, 4°C로 설정된 냉장 원심분리기에서 3000 rotations per minute로 10분 동안 샘플을 원심분리한 뒤, 통과액(flow through)은 버립니다.그런 다음, 냉각된 PBS 20 milliliters를 Apollo 농축기에 넣고, 4 °C의 냉장 원심분리기로 3000 rpm에서 10분 동안 다시 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 여과액을 다시 버리고, 냉각된 PBS 500 microliters를 멤브레인 위에 피펫팅하여 멤브레인으로부터 바이러스를 재부유시킵니다. 이어서 바이러스 벡터를 실리콘 처리된 Eppendorf 튜브에 10 microliter씩 분주하여 사용 전까지 -80 °C에서 보관하며, 정제된 바이러스 10 microliter 분주액 하나를 얼음 위에서 해동합니다.바이러스를 희석하기 위해 튜브에 2중 증류수 40 µL를 피펫팅합니다. 그 다음 25 units/µL 농도의 Ben Nase 0.2 µL를 첨가하고 혼합물을 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그동안 깨끗한 eend orph 튜브에 0.2 ng/µL 플라스미드 표준물질 50 µL를 피펫팅합니다.배양 후, 바이러스가 포함된 튜브에 100 millimolar 수산화나트륨 50 microliters를 첨가하십시오. 플라스미드 표준물이 포함된 튜브에도 동일하게 첨가하십시오. 두 튜브를 65 degrees Celsius에서 30분 동안 배양하십시오.30분이 경과한 후 즉시 두 튜브를 얼음 위에서 최소 5분 동안 냉각하십시오. 그다음 Bio-Dot 필터 페이퍼와 동일한 크기로 트랜스퍼 멤브레인을 자릅니다. 트랜스퍼 멤브레인과 Bio-Dot 필터 페이퍼 3장을 얕은 트레이에 넣으십시오.트레이에 10배 SSC를 채우고 멤브레인을 20분 동안 담가 둡니다. 제조사의 지침에 따라 슬롯 블록 SF 장치를 설치하십시오. 장치를 진공 플라스크에 연결한 다음, 바이러스 샘플 희석액과 플라스미드 표준 물질을 로딩할 각 슬롯에 100 µL의 10배 SSC를 피펫으로 분주합니다.4 °C로 설정된 냉장 원심분리기로 13,000 rpm에서 1분간 원심분리한 후 튜브를 꺼냅니다. 그다음 각 튜브에 20배 SSC 100 µL와 6배 로딩 다이 1 µL를 첨가합니다. 이어서 각 튜브에 10배 SSC 100 µL를 추가로 피펫팅하고, 각 샘플 100 µL를 인접한 슬롯에 로딩합니다.각 샘플의 총 부피가 슬롯 블록 장치에 로드되고, 10배 SSC를 100 µL 이하로 추가로 첨가할 때까지 희석 및 로딩 절차를 반복합니다. 모든 샘플이 멤브레인을 통과하면 슬롯 로스 장치를 분해하고 포셉으로 멤브레인을 제거합니다. 멤브레인의 가장자리 부분을 조심스럽게 잡고 inspector linker SL 1000 UV crosslinker의 챔버에 멤브레인을 넣습니다.그런 다음 에너지 최적 가교(energy optimal cross-link)를 선택하십시오. 가교 과정은 약 30초 동안 진행되어야 합니다. 이제 1 mL의 연어 정자 DNA를 5분 동안 끓여 하이브리드 형성(hybridization)을 준비하십시오. 5분간 끓인 후, 연어 정자 DNA를 즉시 얼음 위에서 최소 5분 동안 냉각시켜야 합니다.그 다음, 작성된 프로토콜에 따라 사전 혼성화 용액을 준비합니다. 연어 정자 DNA가 포함된 사전 혼성화 용액 25 milliliters를 혼성화 튜브에 피펫으로 넣습니다. 가교된 막을 혼성화 튜브로 조심스럽게 옮긴 후, 사전 혼성화 용액이 막을 완전히 덮었는지 확인하며 튜브 캡을 닫습니다.수평 상태에서 65°C의 하이브리다이제이션 챔버(hybridization chamber)에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 이노(einor) 튜브에 50 ng의 DNA 템플릿을 피펫팅하고 10 µL의 2중 증류수를 가해 희석하여 프로브 준비를 시작합니다. 희석된 DNA를 5분 동안 끓인 후, 즉시 얼음 위에서 최소 5분 동안 냉각합니다. 희석된 DNA 템플릿을 상온에서 13,000 rpm으로 1분 동안 원심분리합니다.그다음 기관의 방사성 물질 안전 지침에 따라 작업합니다. DCTP가 포함되지 않은 10 mM DN TPS 2 µL와 헥사 뉴클레오타이드 2 µL를 첨가하여 방사성 프로브를 준비합니다. AU 1 µL와 32P-D-C-T-P 5 µL를 혼합하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.G 50 컬럼을 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 준비합니다. 그런 다음 프로브를 컬럼에 로딩하고 3000 rpm에서 2분 동안 다시 원심분리한 후 통과액을 수집합니다. 이 시점에서 표준 절차를 사용하여 통과액의 방사능을 측정하여 프로브의 mL당 분당 계수(cpm/mL)를 결정합니다.다음으로, 프로브를 5분 동안 끓입니다. 그 후, 즉시 프로브를 얼음 위에서 5분 동안 냉각합니다. 이렇게 하면 멤브레인을 제거하지 않고도 프로브를 하이브리드화에 사용할 준비가 됩니다.5 counts per minute per milliliter 농도의 6배 농도 프로브를 하이브리드화 튜브 내의 전하이브리드화 용액에 직접 피펫팅합니다. 하이브리드화 챔버를 65 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 기관의 방사능 처리 프로토콜에 따라 하이브리드화 용액을 폐기하고, 25 milliliters의 2배 SSC + 0.1% SDS를 튜브에 피펫팅하여 상온에서 15분 동안 멤브레인을 세척합니다.용액을 버리고 0.1배 SSC 및 0.1% SDS 25mL를 튜브에 피펫으로 넣습니다. 65°C에서 30분 동안 멤브레인을 세척합니다. 세척 후, 용액을 버리고 실온의 0.1배 SSC 25mL로 멤브레인을 짧게 헹굽니다.멤브레인을 클링 랩으로 감싼 후 암실에서 노출 카세트에 넣습니다. 멤브레인 위에 필름 한 장을 얹고 카세트를 닫아 빛을 차단합니다. 노출 카세트를 -80 °C 냉동고에 6시간 동안 보관합니다.6시간 후, 필름을 현상하고 바이러스 밴드의 밀도를 플라스미드 표준 밴드와 비교하여 바이러스 스톡의 타이터를 결정합니다. 타이터가 결정되면 바이러스를 사용하여 세포를 형질전환할 수 있으며, 우선 1×10⁴개의 HEK 293T 세포를 시딩합니다.96웰 플레이트의 각 웰에 세포를 넣고 37°C, 5% 이산화탄소 배양기에서 최소 18시간 동안 배양합니다. 배양 후, 각 웰의 배지를 흡입하여 제거하고 항생제와 FBS가 없는 배지 50 µL를 각 웰에 조심스럽게 피펫팅하여 넣습니다. 이 배지를 다시 흡입하여 제거하는 과정을 반복하여 세포를 세척합니다.재조합 a a v 벡터를 FBS와 항생제가 없는 배지에 희석하여 세포당 5,000 VGS의 최종 농도로 만듭니다. 이 용액 50 µL 또는 음성 대조군으로 FBS가 없는 배지 50 µL를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고 37 °C, 5% CO₂ 배양기에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후, 바이러스가 포함된 배지를 제거하고 웰당 50 µL의 완전 배지를 사용하여 이전과 동일하게 세포를 2회 세척합니다.마지막 세척액을 제거한 후, 각 웰에 완전 배지 150 µL를 첨가하고 37 °C, 5% CO2 배양기에서 72시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 형광 현미경을 사용하여 EGFP 발현을 시각화합니다. 형광 강도는 Image J 소프트웨어를 사용하여 정량화할 수 있으며, 트랜스유전자 발현은 시야당 녹색 형광의 전체 면적으로 평가합니다.RAV3 벡터의 역가를 결정하기 위한 정량적 DNA 슬롯 블롯의 예가 여기에 나와 있습니다. 이 막은 P 32로 표지된 EGFP 특이적 DNA 프로브로 탐지되었습니다. 블롯의 상단 행은 Ben Nase로 소화시킨 정제된 바이러스 스톡의 2배 희석액으로 구성됩니다.중간 행과 하단 행은 각각 1 ng 또는 10 ng의 플라스미드로부터 희석된 A-A-V-E-G-F-P 표준물질로 구성됩니다. 바이러스 스톡의 타이터(titer)는 플라스미드 표준물질과의 비교를 통해 결정됩니다. 블롯에 표시된 숫자는 플라스미드 DNA 복제 수에 해당합니다.이것은 재조합 AAV 벡터를 이용한 외래 유전자 발현의 예시입니다. 인간 간모세포종 세포주에서 형질도입 72시간 후의 세포를 형광 현미경으로 관찰하였습니다. 첫 번째 이미지는 모의 감염(mock infection)의 결과를 보여줍니다.두 번째 이미지는 37 °C에서 2시간 동안 세포당 5,000 VG의 모든 AAV2-EGFP 벡터를 형질전환시킨 HEP 2 93 TT 세포를 보여줍니다. 마지막 이미지는 동일한 조건에서 세포당 5,000 VG의 RAAV3-EGFP로 형질전환시킨 결과를 보여줍니다. RAAV3가 RAAV2에 비해 이 세포 유형을 형질전환시키는 효율이 훨씬 더 높음을 알 수 있습니다.이 방법은 인간 간암 세포를 표적하는 방법과 같이 유전자 치료 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. V three는 인간 간암에서 치료 유전자를 높은 수준으로 특이적으로 발현하는 능력을 가지고 있으므로, 이 기술의 함의는 인간 간암 치료로 확장됩니다.

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