Name: Interferometric 반사율 이미징 센서 (IRIS)를 채용 Biomolecular 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 배우세요 간섭 반사율 이미징 센서(IRIS)를 활용한 무표지 바이오분자 검출 방법을 실리콘 이산화물 표면에서 항체-항원 결합을 정량 분석하는 고효율 광학 감지 기술입니다.

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저자는 지원 Zoiray 기술 주식 회사, 공동 스폰서와 상용화 파트너를, 감사하고 싶습니다.

1. 기판 준비 <ol><li> 외투 계층 실리콘 그런가 자기 adsorbing copoly (DMA - NAS - MAPS) 2 기판 : <ol><li> 공중 합체의 합성, 화학 구조, 및 코팅 과정으로 게시됩니다 : G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero합니다. DNA Microarray 유리 슬라이드에 고분자 Adsorbed 코팅의 특성. 항문. 화학. 2004, 76, 1352년에서 1358년까지. </li><li> 간단히, deionized (DI) 물 5 ML하는 폴리머의 100 밀리그램을 추가하여 폴리머 솔루션을 준비하고 0.92 M.의 최종 농도에 도달 40 % 포화 암모늄 황산 ((NH 4) 2SO 4) 솔루션의 5 ML을 추가 </li><li> 흔드는 30 분 용액에 그리고 잠수함 칩 디 물로 깨끗이 씻어. 아르곤 / N 2 가스로 완전히 건조. </li><li> 80 베이크 칩 ° C 15 분. </li></ol></li><li> 스토어 폴리머 코팅 최대 3 개월 동안 건조 환경 (진공 건조기)에 기판 / 칩 탐사선이 절차를 야생까지. </li></ol> 2. 항체, 항원, SS / dsDNA, RNA 등 : 프로브 배열의 준비 <ol><li> 원하는 버퍼에 적절한 농도 프로브 (S)을 희석. 이 단계는 상당히 다를 수 있지만, 전형적인 실험 산도 ≈ 7.4에서 호수 (PBS)를 버퍼 인산의 0.5 MG / ML의 농도 (0.1 -1 MG / ML 범위)에 항원 또는 IgG을 활용합니다. </li><li> 이곳은 96 솔루션 - 또는 384 - 글쎄 플레이트 (또는 반점을 찍는 사용을위한 표준 소스 판) </li><li> 원하는 인쇄 배열 매개 변수를 야생 설정 (시간, 접근 속도 등 머물러) 사용되는 표면 및 솔루션에 적합한 야생 매개 변수를 결정합니다. 그리드, 그리드 레이아웃, 복제 그리드의 번호 및 칩 원하는 야생 위치마다 각각의 조건의 복제의 수를 결정합니다. 플레이스 기판과 적절한 위치에 소스 판은 물론 폐기물 및 공급 병 준비 확인 및 인쇄 실행을 시작합니다. </li><li> 관찰은 고정 및 해제 과정이 계속 수 있도록 (4~18시간) 높은 습도 환경에서 장소 기판은 밤새 완료되면. </li><li> 와시 기판 : 0.1 % 트윈 (PBST), PBS, 그리고 마지막으로 deionized (DI) 물을 PBS 세 별도의 세척을위한 3 분 다음과 같은 솔루션에서 그들을 놓으십시오. 실험의 종류에 따라 (서부 유럽 표준시 대 건조), 아르곤 가스로 철저하게 칩을 건조하고 부화를 시작하거나 흐름 챔버에 칩을 넣고 조립. </li><li> 쉐이크 접시에있는 동안 30 분 동안 7.4로 조정 산도와 ethanolamine 50 MM 솔루션의 칩 잠수함이 잠수하여 공중 합체의 표면에 남아있는 NHS 그룹을 비활성화합니다. 이러한 히드록 실 아민 또는 트리스와 같은 기본 아민 함유 화합물은 또한 오랫동안 준비된 솔루션은 단백질과 함께 사용하는 것이 안전으로 사용할 수 있습니다. 철저히 PBS 다음 DI 워터를 사용하여 해제 솔루션을 씻어. </li><li> 선택 단계 (고용되는 표면 화학에 따라 다름) : BSA, 카제인의 용액 또는 30 분 rehydrated 우유를 사용하여 블록 표면. 폴리머 백본이 아닌 특정 단백질 바인딩을 방지하기 위해 행위로 우리가 사용하는 현재의 고분자 표면 화학에 대한, 우리는이 단계를 수행하지 마십시오. </li></ol> 3. 데이터 수집과 부화 절차 : 종점 형식 <ol><li> 원하는 버퍼에 대한 관심의 대상의 솔루션을 확인하십시오. 여기, 그것은 PBS에 방지 BSA의 적절한 농도 (10 NG / PBS에 방지 BSA의 ML 솔루션 중 1-10 ML을 예)의 솔루션이 될 것입니다. 또한, 대조군 보육에 대한 버퍼의 상당 금액을 (대상 제외)해야 있는지 확인합니다. </li><li> 모두 이후에 수집된 데이터를 정규화를위한 실리콘 미러 검사를 가져가라. </li><li> 각 명소의 초기 광학 높이 (질량)을 결정하기 전에 인큐베이션 단계로 IRIS 시스템으로 준비 프로브 배열을 검사합니다. 이것은 표면에 질량의 변화에​​ 적절한 분석을 위해 수, 부화 후, 바인딩의 수준을 즉. 여기 몇 가지 매개 변수가 현재와 같은 노출 시간으로 실험, 시야, prospering 초점 등 조정됩니다 </li><li> 쉐이크 접시에 1 시간 동안 준비 용액에 잠수함 칩 (S). 배양 시간이 상당히 동요의 수준에 따라 달라질 수, 대상의 농도가 감지되고, 흐름 챔버의 전송 특성 (실시간 감지 모드를 사용중인 경우), 대상 - 프로브 쌍 동질성이 등 . </li><li> 부화 후) 2.5 단계에서 설명한 세척 절차를 반복 </li><li> IRIS 시스템을 사용하여 동일한 프로브 어레이를 스캔 및 사전 부화 비교 후 부화 이미지를 구하십시오. </li><li> 보조 항체가 사용되고 샌드위치 분석 형식으로 예를 들어, 필요한 경우 다른 부화 단계에 대해이 과정을 반복합니다. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 프로 연구실 개발한 소프트웨어를 사용, 각 IRIS 스캔 (강도 이미지 시퀀스)에 대한 수집된 이미지 맞추기광학 두께 정보를 포함하는 프로브 어레이의 이미지를 듀스. 바인딩의 빠른 정성 분석 (등록) 게시 및 사전 부화 이미지를 빼서하여 수행할 수 있습니다. 바인딩 대량의 변경이 관찰되었다 반점에서 강도의 변화로 나타납니다. 정량 분석​​을 위해, 현장의 현장과 환대 밖 내의 각 픽셀에 대한 광학 두께 정보를 평균하고이 두 분야의 직접 비교하여 배경에 비해 각 지점의 질량 밀도를 결정한다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 그림 1은 대표적인 항체 배열로 발견 계층시 - 그런가 2 IRIS 기판의 예제 설계도를 보여줍니다. 각 항체 앙상블은 다른 단백질을 대상으로 다른 에피토프에 대한 특이성과 복제에서 발견됩니다. 두 개의 다른 모든 바이러스 및 바이러스 단백질은 예를 대상으로 표시됩니다. 대조군 항체는 분석에 따라이 아닌 특정 및 / 또는 바이러스 특정 수 있습니다. 그림 2는 (HSA) 인간 혈청 알부민의 바인딩을 보여줍니다 특정 발견 HSA와 토끼 IgG (제어) 명소의 배열에 항체. 여기로 본, 광학의 조립과 결정 후 사전 및 사후 부화 이미지 두께, 바인딩 배열의 차이 이미지는 질적으로 평가하기 위해 바인딩을 만들 수 있습니다. 정량 분석​​은 2.05와 0.13 나노미터는 광학 높이 변경 500 NG / ML의 방지 HSA 부화 농도에 대한 각각의 HSA와 토끼 IgG 명소에 대한 관찰 있었다는 것을 보여줍니다. 그림 3은 단백질 농도 및 dsDNA의 올리고머의 길이에 모피 단백질 바인딩 의존의 IRIS 측정을 보여줍니다. 상단 그래프는 초기 고정 올리고머 프로브 헤이츠 및 사후 배양 펄 바인딩에 대한 절대 광학 높이 측정을 보여줍니다. 모피의 증가 농도 (50, 100, 200 NM)은 DNA 프로브로 증가 바인딩 결과. oligomers의 길이도 더 바인딩의 결과로 더 이상 시퀀스와 펄 바인딩을 영향을 미칩니다. 여기, 오차 막대는 뜻에서 한 표준 편차를 나타냅니다. 하단 줄거리는 dsDNA 스트랜드 당 바인딩 계산 펄 단백질 이합체를 보여줍니다. 이합체 구속력이 크게되지 않은 특정 바인딩의 높은 수준을 제안 200 NM의 모피 단백질 농도에서 증가했다. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 일반적으로 IRIS 시스템을 갖춘 멀티 플렉스 방식으로 특정 바이러스 및 바이러스 구성 요소를 감지하는 실험에 사용되는 예제 프로브 배열의 도식. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 목격 HSA에 인간 혈청 알부민 특정 항체의 바인딩을위한 포스트 인큐베이션 차이 이미지 500 NG / ML의 농도에서이 레이블이없는 시스템을 수집했습니다. 각 장소에 대한 biomaterial 질량 밀도가 자리 이내 광학 두께 정보를 평균하고 배경을 나타내는 지점 주위에 고리의 평균이 비교에 의해 결정됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 올리고머의 길이, 올리고머 이내에 합의 순서의 위치, 그리고 펄 단백질 농도를 기반으로 알려진 합의 순서와 발견 더블 좌초 oligomers로 펄 단백질 상호 작용에 대한 데이터 바인딩의 플롯. 각 발견 순서 (상단)에 바운드 모피 단백질의 절대 금액에 대한 정보는 올리고머 (하단)의 각 유형에 바운드 모피 dimers의 수를 추정하는 데 사용할 수 있습니다.

<ol><li>Özkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+and+dynamic+detection+of+biomolecular+interactions+for+high-throughput+microarray+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).</li>
<li>Özkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+microarray+imaging+for+direct+detection+of+DNA+hybridization+and+single-nucleotide+mismatches%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).</li>
<li>Özkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+reflectance+imaging+for+a+multiplexed%2C+high-throughput%2C+label-free%2C+and+dynamic+biosensing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Selected+Topics+in+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).</li>
<li>Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., Özkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+multiplexed+virus+detection+using+spectral+reflectance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. , (2011).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

IRIS 플랫폼 microarray 형식으로 높은 처리량 데이터 바인딩을 수집하기 위해 사용하는 간단하고 신속한 시스템입니다. covalently 표면에 다른 기능 단백질이나 DNA 프로브를 immobilizing하여 대상 항원 / 생체은 / etc. 면역 분석법에서와 같이, 솔루션에서 캡쳐한 수 있습니다. IRIS 시스템 끝점 또는 실시간 형식으로 프로브 조건에 걸쳐 이러한 상호 작용의 측정은 각 상호 작용에 대해 수집하는 매우 민감하고 정량적 정보를 얻을 수 있습니다. 여기에 자세한 대표적인 실험들이이 기술에 대해 공부 할 수있는 상호 작용의 유형 중 한 예입니다. 전사 요인, 바이러스성 항원 및 전체 바이러스의 감지는 이전에 다음 ID로 시연과 IRIS 쉽게 처리할 수있는 분석의 유형의 몇 가지 사례를 나타냅니다되었습니다.

<ol><li> 열 재배 이산화 규소, 실리콘 밸리 반도체, 사용자 정의하기 위해 500 nm의 실리콘 웨이퍼 <li> 암모늄 황산 가루, 시그마 - 알드리치 고양이. # A5132 <li> 인산은 생리 (PBS) 10X 준비 집중, 피셔 사이 언티픽 고양이를 버퍼. # BP665 - 1 <li> 인간 혈청 알부민 (안티 HSA)에 항체, 시그마 - 알드리치 고양이. # A0433 <li> 인간 혈청 알부민 (HSA), 시그마 - 알드리치 고양이. # A9511 <li> 아르곤 또는 질소 가스 (초고 순도), Airgas 고양이. # AR UHP300 또는 # NI UHP300 <li> 배양 접시, 60mm X 15mm, 피셔 사이 언티픽 고양이. # 0875713A <li> Scienceware ® 진공 건조기, 시그마 - 알드리치 고양이. # Z119016 <li> Microcentrifuge 튜브, 피셔 사이 언티픽 고양이. # 05-408-120 <li> 96 - 웰 플레이트, 낮은 세포 구속력 Nalgene Nunc 인터내셔널 고양이. # 145399 <li> BioOdyssey 서가 MiniArrayer, 바이오 래드 <li> 트윈 - 20, 시그마 - 알드리치 # P1379 <li> Ethanolamine, 시그마 - 알드리치 # 398136 <li> 히드록 실 아민, 써모 사이 언티픽 고양이. # 26103 <li> 다목적 회전, 써모 사이 언티픽 (반스 테드 국제), 모델 # 2314, 고양이. # 2314Q <li> Retiga 2000R 카메라 QImaging 고양이. # 01 - RET - 2000R - FM - 12 <li> AcuLED 조명 소스, PerkinElmer, 맞춤 주문 <li> 광학 부품 (렌즈, 목표, apertures, 레일, 게시물 등), Thorlabs </ol>

interferometric 반사율 이미징 센서 (iris)를 채용 biomolecular 감지

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

biomolecular 상호 작용의 민감한 측정은 기본적인 생물학, 미생물학, 환경 / 농업 / biodefense 모니터링, nanobiotechnology, 그리고 더 많은 분야와 산업에 사용하고 있습니다. 진단 어플 리케이션을 위해, 모니터링 (감지)의 존재, 부재, 또는 환자 샘플에서 발견된 대상 proteomic 또는 게놈 생체 비정상적인 표현은 치료 접근 또는 치료 효능을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 연구 분야에서 분자 동질성 및 specificities에 대한 정보를 충분히 조사를 받고 시스템을 특성화하는 데 유용합니다. 분자 농도 또는 동질성을 확인하는 고용은 현재 시스템의 대부분은 라벨의 사용에 의존하고 있습니다. 이러한 시스템의 예로는에는 효소 연결된 면역 분석 (엘리사), 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR) 기법, 겔 전기 영동의 assays, 그리고 질량 분석계 (MS)로 immunoassays을 포함합니다. 일반적으로,이 라벨, 형광 방사선, 또는 자연 colorimetric하고 직접 또는 간접적으로 관심의 대상 분자에 붙어있다. 레이블의 사용이 널리 인정 및 일부 혜택을 가지고있다지만, 이러한 상호 작용을 측정하는 새로운 레이블없는 방법의 개발을 자극하는 단점이있다. 이러한 단점은 증가 분석 비용, 시약 수명과 유용성, 스토리지 및 안전 문제 등 실용적인 면을, 라벨의 낭비 시간과 노력, 그리고 라벨 프로세스 또는 라벨 자체로 인해 다른 시약 간의 다양성을 포함합니다. 과학 연구 기초에서 이들 레이블의 사용은 또한 단백질 기능 / 첨부 라벨과 직접 실시간으로 상호 작용을 측정하는 무능력의 존재로 인해 구조에 미치는 영향과 문제로 어려움을 도입할 수 있습니다. 여기서 제시하는 연구를 microarray 의무가있는 새 레이블이없는 광학 바이오 센서의 사용은, Interferometric 반사율 이미징 센서 (IRIS)는 감지 단백질, DNA, antigenic 자료 전체 병원균 (virions) 및 기타 생물 학적 재료, 칭했다. IRIS 시스템은 다른 biomolecular 상호 작용 [1-3]에 대한 높은 감도, 정밀도 및 재현성을 가지고 증명되었습니다. 장점 멀티 플렉스 이미징 용량, 실시간 엔드 측정 기능 및 감소 시약 소비와 분석 시간의 감소와 같은 다른 높은 처리량 속성을 포함합니다. 또한, IRIS 플랫폼은 사용이 간단 저렴한 장비를 필요로하고, 많은 현대 표면 화학 방식과 호환하는 실리콘 기반의 견고한 위상 분석 구성 요소를 사용합니다. 여기, 우리는 프로브 배열의 준비에서 부화 및 끝점 형식으로 결과를 분석 바인딩 대상의 측정에 IRIS 시스템의 사용을 제시한다. 모델 시스템은 HSA - 반해 기판에 (HSA) 인간 혈청 알부민에 대한 구체적인 대상 항체의 캡처됩니다.

그런가에 대한 정량, 높은 처리량, 실시간 및 레이블이없는 biomolecular 감지 (DNA, 단백질 등)<sub&gt; 2</sub&gt; 표면은 LED 조명에 의존하고 간단한 interferometric 기술, 최소한의 광학 부품, 그리고 카메라를 사용하여 얻을 수 있습니다. Interferometric 반사율 이미징 센서 (IRIS)는 형식을 microarray로 저렴, 사용하기 간단하고, 의무가 있습니다.

Interferometric 반사율 이미징 센서 (IRIS)를 채용 Biomolecular 감지

생체 분자 상호작용의 민감한 측정은 기초 생물학 및 미생물학을 포함한 많은 분야와 산업에서 활용되고 있으며, ...

다음 실험의 전반적인 목표는 Iris라고 불리는 민감한 무표지 센싱 플랫폼을 통해 표면에 고정된 항원에 대한 항체의 결합을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 용액으로부터 표적 단백질을 포집하기 위해, 화학적으로 기능화된 균일한 이산화규소 표면 위에 테스트 및 대조군 프로브 어레이를 준비함으로써 달성됩니다. 고정된 프로브는 항체나 항원, DNA 또는 RNA, 혹은 기능화된 폴리머 또는 실란 표면 화학과 호환되는 다른 모든 유형의 거대 분자가 될 수 있습니다.준비된 마이크로어레이를 표적 단백질이 포함된 샘플과 함께 배양하여, 연구자가 지정한 조건에서 결합이 일어나도록 합니다. 그 다음, 전체 센서 어레이를 서로 다른 파장의 빛으로 이미징합니다. IRIS 시스템을 통해 각 픽셀의 반사 강도를 맞춤형 코딩 알고리즘으로 처리합니다.각 시험군 또는 대조군 조건에 결합된 바이오 소재의 양을 정량화하기 위해, 본 시스템의 간섭계 기반 무표지 측정법을 통해 복잡한 혼합물 내 항체의 효과적인 검출 및 절대 정량화를 보여주는 배양 후 결과를 얻습니다. 광학 간섭 및 수지 캐비티 장치에 대한 10년 이상의 연구 개발을 바탕으로, 이전의 무표지 바이오센서 시스템에서 겪었던 많은 혼란스러운 문제들을 극복할 수 있는 새로운 방법을 개발했습니다. 데이터 수집 단계에서 정확한 정규화가 필요하며 품질 관리 절차가 준수되어야 하므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이는 정확하고 재현 가능한 데이터 습득을 보장하기 위함입니다.이산화규소 기판을 자가 흡착성 copo dmma NAS 맵으로 코팅하려면, 먼저 5 mL의 탈이온수에 100 mg의 폴리머를 첨가하여 폴리머 용액을 준비하십시오. 그런 다음, 최종 암모늄 설페이트 농도가 0.92 M이 되도록 40% 포화 암모늄 설페이트 5 mL를 첨가하십시오. 배양 후, 쉐이커 위에서 30분 동안 칩을 폴리머 용액에 담가 두십시오.칩을 탈이온수로 충분히 헹구고, 아르곤 또는 질소 가스로 건조한 다음, 80 °C에서 15분 동안 베이킹하십시오. 폴리머가 코팅된 기판 칩은 각 프로브를 희석하는 프로브 스포팅 절차 전까지 진공 데시케이터와 같은 건조한 환경에서 최대 2~3개월 동안 보관하십시오. 먼저, 원하는 최종 농도를 얻기 위해 필요한 프로브 스탁 용액과 버퍼의 정확한 부피를 결정하십시오.전형적인 실험에서는 0.5 mg/mL 농도의 항원 또는 IgG를 phosphate buffered saline에 사용하여, 계산된 양의 각 프로브 스톡 솔루션을 원하는 양의 PBS 버퍼가 들어 있는 소형 eend orph 튜브에 넣고 솔루션들을 혼합합니다. 그런 다음 프로브 솔루션을 스포터의 소스 플레이트로 사용될 96-웰 저단백 결합 플레이트에 피펫팅합니다. 다음으로, 그리드당 각 조건의 반복 횟수를 결정하여 프린팅된 어레이의 스포팅 파라미터를 설정합니다.그리드는 반복 그리드의 수와 칩 상의 희망 스포팅 위치를 설정합니다. 기판과 소스 플레이트를 스포터에 배치한 다음, 폐액 및 공급 병을 확인하십시오. 프린팅 실행을 시작하십시오.스포팅이 완료되면, 배양 후 고정 및 불활성화 과정이 진행될 수 있도록 기질을 고습도 환경에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 먼저 칩을 0.1% tween이 포함된 PBS에 넣고 3분 동안 세 차례 반복하여 교반 세척합니다. 그 다음 PBS에서 3분씩 세 번, 그리고 탈이온수에서 3분씩 세 번 배양하여 세척하십시오.건식 측정을 수행하는 경우, 아르곤 가스로 칩을 완전히 건조합니다. 칩을 pH 7.4로 조정된 50 millimolar 에탄올아민 용액에 담근 후, 셰이커 플레이트 위에서 30분 동안 반응시켜 공중합체 표면에 남아 있는 NHS 그룹을 비활성화합니다. 배양 절차를 시작하기 전, PBS와 탈이온수로 에탄올아민을 충분히 씻어냅니다.본 시연을 위해 PBS에 적절한 농도의 표적 단백질 용액을 준비하십시오. 500 ng/mL의 anti-human serum albumin이 사용되며, 음성 대조군 배양을 위해 표적이 없는 동일한 부피의 완충액을 포함하십시오. iris 시스템은 조명원, 센서 프로브 어레이를 적절히 조사하기 위한 광학 부품, 반사광 강도를 기록하기 위한 카메라, 그리고 측정을 위해 샘플을 놓는 스테이지와 같은 몇 가지 기본 요소로 구성됩니다.스캔을 수행하기 전, 이후에 수집되는 모든 데이터를 정규화하기 위해 아무것도 처리하지 않은 깨끗한 실리콘 칩의 실리콘 미러 스캔부터 시작하십시오. 실험을 위한 파라미터를 조정하여 아이리스 시스템을 준비합니다. 여기에는 카메라가 기록하는 빛 강도의 히스토그램을 측정하고, 최적의 강도를 얻기 위해 노출 시간을 설정하는 과정이 포함됩니다.정규화 스캔 후, 준비된 프로브 어레이를 iris 시스템에 장착하고 이전과 동일하게 설정을 수행하며, 기판 표면이 정확하게 이미지화되도록 초점을 맞춥니다. 반사광 강도의 기록된 히스토그램을 검사하여 샘플 스테이지가 수평인지 확인하십시오. 마지막으로, 데이터를 저장할 파일 이름을 선택합니다.소프트웨어를 초기화하여 어레이를 스캔합니다. 이때 표면을 다양한 파장으로 여러 번 조사하고 수집된 이미지들을 평균화합니다. 초기 광학 높이의 기준점(teach spot)이 결정되면, 초기 스캔 후 배양 과정에서 표면의 질량 변화를 적절히 분석할 수 있게 됩니다. 칩을 미리 준비된 배양 용액에 담그고 쉐이커 플레이트 위에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 시간은 식생 수준, 검출하려는 표적의 농도 및 표적-프로브 쌍의 친화도에 따라 상당히 달라질 수 있습니다.배양 후, 이전에 수행한 것과 동일하게 세척 과정을 반복합니다. iris 시스템을 사용하여 동일한 pro array를 스캔함으로써 배양 전과 비교하기 위한 배양 후 이미지를 얻습니다. 필요한 경우, 서로 다른 배양 단계에 대해 이 과정을 반복할 수 있습니다.예를 들어, 2차 항체를 사용하는 샌드위치 분석 형식의 경우, 상용 소프트웨어를 사용하여 각 아이리스 스캔(iris scan)에서 수집된 이미지를 피팅함으로써 광학적 두께 형성을 포함하는 프로브 이미지를 생성합니다. 배양 전후의 이미지를 빼줌으로써 결합 여부에 대한 빠른 정성 분석을 수행할 수 있습니다. 결합은 질량 변화가 관찰된 지점에서 강도 변화로 나타납니다.정량적 분석을 위해, 스팟 내의 각 픽셀과 스팟 외부의 환형 영역(annulus)에 대한 광학 두께 정보의 평균값을 구해 배경 대비 각 스팟의 질량 밀도를 결정합니다. 그런 다음, 여기에 표시된 이 두 영역을 직접 비교합니다. 예시로, 대표적인 항체 어레이가 점적된 층상 실리콘 및 이산화규소 아이리스 기판의 모식도입니다.각 항체 앙상블은 서로 다른 단백질을 표적으로 하여 서로 다른 에피토프에 특이성을 갖도록 반복적으로 스팟팅됩니다. 두 종류의 서로 다른 전체 바이러스와 하나의 바이러스 단백질이 예시로 제시되어 있습니다. 표적들. 음성 대조군 항체는 분석법에 따라 비특이적일 수도 있고 또는 바이러스 특이적일 수도 있습니다.여기 HSA와 토끼 IgG 대조군 스팟이 점적된 어레이에 인간 혈청 알부민 특이적 항체가 결합한 정성적 결과의 예시가 나타나 있습니다. 배양 전후 이미지의 광학적 두께를 피팅하고 결정한 후, 결합 어레이에 대한 차이 영상을 생성하여 결합 여부를 빠르게 평가할 수 있습니다. 더 정량적인 분석 결과, 500 nanograms per milliliter 농도의 anti HSA 배양 시 HSA 스팟과 토끼 IgG 스팟에서 각각 2.05 nanometer와 0.13 nanometer의 평균 광학 높이 변화가 관찰되었습니다.이 막대 그래프는 iris 측정을 통해 얻을 수 있는 정량적 데이터의 예를 나타냅니다. 이 예시에서는 단백질 농도와 이중 가닥 결합체(all ligament) 길이에 따른 FUR 단백질 결합 의존성이 제시되어 있습니다. 이 막대 그래프는 초기 고정된 결합체 프로브의 높이와 결합을 위한 배양 후의 절대 광학 높이 측정값을 보여줍니다.fur 단백질의 농도를 5, 100, 200 nM로 높였을 때 DNA 프로브와의 결합이 증가하였습니다. 여기에서는 이중 가닥 DNA 리간드당 계산된 fur 단백질 이량체 결합량이 나타나 있습니다. fur 단백질 농도가 200 nM일 때 이량체 결합이 유의미하게 증가하였으며, 이는 높은 수준의 비특이적 리간드 상호작용 또는 다중 이량체의 응집과 같은 다른 fur 단백질 결합 메커니즘이 존재함을 시사합니다.이 절차를 수행할 때, 적절한 산화막 두께를 가진 깨끗하고 균일한 기판으로 시작하는 것과 핀셋을 사용하여 시료를 조심스럽게 취급함으로써 청결하게 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 적절하게 보관되어 기능이 확인된 시약을 사용하는 것이 매우 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 이산화규소 표면에 기능성 프로브 어레이를 제작하여 무표지 방식으로 생체 분자의 작용을 측정하는 방법과 간섭 반사 이미지 센서(iris)를 이용한 데이터 수집 및 분석 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

이 동영상에서는 리간드와 표적 분석물 간의 분자간 상호 작용을 실시간으로 검출하는 BLI(Biolayer Interferometry) 기술을 시연합니다. BLI는 용액 내 분석물과 상호 작용할 때 바이오센서 표면의 고정된 리간드 층에서 반사된 백색광의 간섭 패턴 변화를 측정합니다.

리간드와 분석물 간의 상호 작용을 감지하기 위한 Biolayer Interferometry 기술

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Interferometric 반사율 이미징 센서 (IRIS)를 채용 Biomolecular 감지

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