Interferometric 반사율 이미징 센서 (IRIS)를 채용 Biomolecular 감지

다음 실험의 전반적인 목표는 Iris라고 불리는 민감한 무표지 센싱 플랫폼을 통해 표면에 고정된 항원에 대한 항체의 결합을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 용액으로부터 표적 단백질을 포집하기 위해, 화학적으로 기능화된 균일한 이산화규소 표면 위에 테스트 및 대조군 프로브 어레이를 준비함으로써 달성됩니다. 고정된 프로브는 항체나 항원, DNA 또는 RNA, 혹은 기능화된 폴리머 또는 실란 표면 화학과 호환되는 다른 모든 유형의 거대 분자가 될 수 있습니다.

준비된 마이크로어레이를 표적 단백질이 포함된 샘플과 함께 배양하여, 연구자가 지정한 조건에서 결합이 일어나도록 합니다. 그 다음, 전체 센서 어레이를 서로 다른 파장의 빛으로 이미징합니다. IRIS 시스템을 통해 각 픽셀의 반사 강도를 맞춤형 코딩 알고리즘으로 처리합니다.

각 시험군 또는 대조군 조건에 결합된 바이오 소재의 양을 정량화하기 위해, 본 시스템의 간섭계 기반 무표지 측정법을 통해 복잡한 혼합물 내 항체의 효과적인 검출 및 절대 정량화를 보여주는 배양 후 결과를 얻습니다. 광학 간섭 및 수지 캐비티 장치에 대한 10년 이상의 연구 개발을 바탕으로, 이전의 무표지 바이오센서 시스템에서 겪었던 많은 혼란스러운 문제들을 극복할 수 있는 새로운 방법을 개발했습니다. 데이터 수집 단계에서 정확한 정규화가 필요하며 품질 관리 절차가 준수되어야 하므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이는 정확하고 재현 가능한 데이터 습득을 보장하기 위함입니다.

이산화규소 기판을 자가 흡착성 copo dmma NAS 맵으로 코팅하려면, 먼저 5 mL의 탈이온수에 100 mg의 폴리머를 첨가하여 폴리머 용액을 준비하십시오. 그런 다음, 최종 암모늄 설페이트 농도가 0.92 M이 되도록 40% 포화 암모늄 설페이트 5 mL를 첨가하십시오. 배양 후, 쉐이커 위에서 30분 동안 칩을 폴리머 용액에 담가 두십시오.

칩을 탈이온수로 충분히 헹구고, 아르곤 또는 질소 가스로 건조한 다음, 80 °C에서 15분 동안 베이킹하십시오. 폴리머가 코팅된 기판 칩은 각 프로브를 희석하는 프로브 스포팅 절차 전까지 진공 데시케이터와 같은 건조한 환경에서 최대 2~3개월 동안 보관하십시오. 먼저, 원하는 최종 농도를 얻기 위해 필요한 프로브 스탁 용액과 버퍼의 정확한 부피를 결정하십시오.

전형적인 실험에서는 0.5 mg/mL 농도의 항원 또는 IgG를 phosphate buffered saline에 사용하여, 계산된 양의 각 프로브 스톡 솔루션을 원하는 양의 PBS 버퍼가 들어 있는 소형 eend orph 튜브에 넣고 솔루션들을 혼합합니다. 그런 다음 프로브 솔루션을 스포터의 소스 플레이트로 사용될 96-웰 저단백 결합 플레이트에 피펫팅합니다. 다음으로, 그리드당 각 조건의 반복 횟수를 결정하여 프린팅된 어레이의 스포팅 파라미터를 설정합니다.

그리드는 반복 그리드의 수와 칩 상의 희망 스포팅 위치를 설정합니다. 기판과 소스 플레이트를 스포터에 배치한 다음, 폐액 및 공급 병을 확인하십시오. 프린팅 실행을 시작하십시오.

스포팅이 완료되면, 배양 후 고정 및 불활성화 과정이 진행될 수 있도록 기질을 고습도 환경에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 먼저 칩을 0.1% tween이 포함된 PBS에 넣고 3분 동안 세 차례 반복하여 교반 세척합니다. 그 다음 PBS에서 3분씩 세 번, 그리고 탈이온수에서 3분씩 세 번 배양하여 세척하십시오.

건식 측정을 수행하는 경우, 아르곤 가스로 칩을 완전히 건조합니다. 칩을 pH 7.4로 조정된 50 millimolar 에탄올아민 용액에 담근 후, 셰이커 플레이트 위에서 30분 동안 반응시켜 공중합체 표면에 남아 있는 NHS 그룹을 비활성화합니다. 배양 절차를 시작하기 전, PBS와 탈이온수로 에탄올아민을 충분히 씻어냅니다.

본 시연을 위해 PBS에 적절한 농도의 표적 단백질 용액을 준비하십시오. 500 ng/mL의 anti-human serum albumin이 사용되며, 음성 대조군 배양을 위해 표적이 없는 동일한 부피의 완충액을 포함하십시오. iris 시스템은 조명원, 센서 프로브 어레이를 적절히 조사하기 위한 광학 부품, 반사광 강도를 기록하기 위한 카메라, 그리고 측정을 위해 샘플을 놓는 스테이지와 같은 몇 가지 기본 요소로 구성됩니다.

스캔을 수행하기 전, 이후에 수집되는 모든 데이터를 정규화하기 위해 아무것도 처리하지 않은 깨끗한 실리콘 칩의 실리콘 미러 스캔부터 시작하십시오. 실험을 위한 파라미터를 조정하여 아이리스 시스템을 준비합니다. 여기에는 카메라가 기록하는 빛 강도의 히스토그램을 측정하고, 최적의 강도를 얻기 위해 노출 시간을 설정하는 과정이 포함됩니다.

정규화 스캔 후, 준비된 프로브 어레이를 iris 시스템에 장착하고 이전과 동일하게 설정을 수행하며, 기판 표면이 정확하게 이미지화되도록 초점을 맞춥니다. 반사광 강도의 기록된 히스토그램을 검사하여 샘플 스테이지가 수평인지 확인하십시오. 마지막으로, 데이터를 저장할 파일 이름을 선택합니다.

소프트웨어를 초기화하여 어레이를 스캔합니다. 이때 표면을 다양한 파장으로 여러 번 조사하고 수집된 이미지들을 평균화합니다. 초기 광학 높이의 기준점(teach spot)이 결정되면, 초기 스캔 후 배양 과정에서 표면의 질량 변화를 적절히 분석할 수 있게 됩니다. 칩을 미리 준비된 배양 용액에 담그고 쉐이커 플레이트 위에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 시간은 식생 수준, 검출하려는 표적의 농도 및 표적-프로브 쌍의 친화도에 따라 상당히 달라질 수 있습니다.

배양 후, 이전에 수행한 것과 동일하게 세척 과정을 반복합니다. iris 시스템을 사용하여 동일한 pro array를 스캔함으로써 배양 전과 비교하기 위한 배양 후 이미지를 얻습니다. 필요한 경우, 서로 다른 배양 단계에 대해 이 과정을 반복할 수 있습니다.

예를 들어, 2차 항체를 사용하는 샌드위치 분석 형식의 경우, 상용 소프트웨어를 사용하여 각 아이리스 스캔(iris scan)에서 수집된 이미지를 피팅함으로써 광학적 두께 형성을 포함하는 프로브 이미지를 생성합니다. 배양 전후의 이미지를 빼줌으로써 결합 여부에 대한 빠른 정성 분석을 수행할 수 있습니다. 결합은 질량 변화가 관찰된 지점에서 강도 변화로 나타납니다.

정량적 분석을 위해, 스팟 내의 각 픽셀과 스팟 외부의 환형 영역(annulus)에 대한 광학 두께 정보의 평균값을 구해 배경 대비 각 스팟의 질량 밀도를 결정합니다. 그런 다음, 여기에 표시된 이 두 영역을 직접 비교합니다. 예시로, 대표적인 항체 어레이가 점적된 층상 실리콘 및 이산화규소 아이리스 기판의 모식도입니다.

각 항체 앙상블은 서로 다른 단백질을 표적으로 하여 서로 다른 에피토프에 특이성을 갖도록 반복적으로 스팟팅됩니다. 두 종류의 서로 다른 전체 바이러스와 하나의 바이러스 단백질이 예시로 제시되어 있습니다. 표적들. 음성 대조군 항체는 분석법에 따라 비특이적일 수도 있고 또는 바이러스 특이적일 수도 있습니다.

여기 HSA와 토끼 IgG 대조군 스팟이 점적된 어레이에 인간 혈청 알부민 특이적 항체가 결합한 정성적 결과의 예시가 나타나 있습니다. 배양 전후 이미지의 광학적 두께를 피팅하고 결정한 후, 결합 어레이에 대한 차이 영상을 생성하여 결합 여부를 빠르게 평가할 수 있습니다. 더 정량적인 분석 결과, 500 nanograms per milliliter 농도의 anti HSA 배양 시 HSA 스팟과 토끼 IgG 스팟에서 각각 2.05 nanometer와 0.13 nanometer의 평균 광학 높이 변화가 관찰되었습니다.

이 막대 그래프는 iris 측정을 통해 얻을 수 있는 정량적 데이터의 예를 나타냅니다. 이 예시에서는 단백질 농도와 이중 가닥 결합체(all ligament) 길이에 따른 FUR 단백질 결합 의존성이 제시되어 있습니다. 이 막대 그래프는 초기 고정된 결합체 프로브의 높이와 결합을 위한 배양 후의 절대 광학 높이 측정값을 보여줍니다.

fur 단백질의 농도를 5, 100, 200 nM로 높였을 때 DNA 프로브와의 결합이 증가하였습니다. 여기에서는 이중 가닥 DNA 리간드당 계산된 fur 단백질 이량체 결합량이 나타나 있습니다. fur 단백질 농도가 200 nM일 때 이량체 결합이 유의미하게 증가하였으며, 이는 높은 수준의 비특이적 리간드 상호작용 또는 다중 이량체의 응집과 같은 다른 fur 단백질 결합 메커니즘이 존재함을 시사합니다.

이 절차를 수행할 때, 적절한 산화막 두께를 가진 깨끗하고 균일한 기판으로 시작하는 것과 핀셋을 사용하여 시료를 조심스럽게 취급함으로써 청결하게 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 적절하게 보관되어 기능이 확인된 시약을 사용하는 것이 매우 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 이산화규소 표면에 기능성 프로브 어레이를 제작하여 무표지 방식으로 생체 분자의 작용을 측정하는 방법과 간섭 반사 이미지 센서(iris)를 이용한 데이터 수집 및 분석 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.