사용 MG53 - 중재 세포막 수리의 시각화 생체내에과 체외에서 시스템

이 절차의 전반적인 목표는 동물과 분리된 세포 모두에서 막 복구 능력을 평가하는 것입니다. 분리된 골격근 섬유를 수집하여 FM 1 43 염료를 함유한 배지로 둘러쌉니다. 그런 다음 UV 레이저를 사용하여 세포막의 일부를 조사하고 손상시켜 염료가 세포로 들어갈 수 있도록 합니다.

분리된 세포는 GFP MG 53을 발현하는 플라즈마 DNA로 transfection되며, 이는 세포의 원형질막과 세포질에 국소화됩니다. 그런 다음 마이크로 전극의 끝을 C two C 12 멤브레인에 삽입하여 손상을 유도합니다. 궁극적으로, GFP MG 53의 부상 부위로의 전좌를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법의 시각적 시연은 마이크로 전극 침투 및 근육 섬유 분리 기술을 마스터하는 데 필요한 연습이 필요하기 때문에 중요합니다. 연구실 관리자인 Dr.Lin, 대학원생인 박사후 연구원 Matt Orange, 그리고 우리 학과의 연구 조교수인 Dr.Shaza가 절차를 시연할 것입니다. 먼저 트레이나 파란색 실험용 패드를 러닝머신 아래에 놓고 실험하는 동안 동물의 배설물을 수거합니다.

다음으로 트레드밀 표면의 각도를 설정합니다. 일부 트레드밀에는 경사를 조정하는 통합 장치가 있는 반면 다른 트레드밀에는 다른 수단을 통해 트레드밀을 들어올려야 합니다. 일반적으로 내리막 또는 오르막에서 7도에서 15도 사이의 평평한 표면 또는 각도가 사용됩니다.

전기 그리드를 끄고 벨트 구동 모터를 켠 상태에서 마우스를 트레드밀에 올려 놓아 마우스를 적응시키되 적응 기간 후 15분 동안 움직이지 않으면 동기 부여 전기 그리드를 켭니다. 분당 약 5미터의 초기 속도로 트레드밀을 시작합니다. 속도가 분당 1-2미터씩 증가하면 매분 5분의 워밍업 시간을 가질 수 있습니다.

이 워밍업 기간을 3일에서 10일 동안 매일 반복하여 테스트 중 규정 준수를 높입니다. 급성 피로 운동을 하기 위해. 최대 속도에 도달할 때까지 시간이 지남에 따라 트레드밀의 속도를 높이고 피로 징후를 모니터링하십시오.

동물이 러닝머신에서 시간의 절반 이상을 보내거나 그리드에서 5초 연속으로 보낼 때 지친 것으로 간주됩니다. 소모된 마우스를 제거하고 총 실행 시간을 기록합니다. 지구력 훈련.

실행 프로토콜은 동일한 워밍업 절차로 시작합니다. 그러나 최대 속도는 일반적으로 더 낮고 실행 시간이 상당히 길어질 수 있습니다. 테스트 후 마우스를 집 케이지로 되돌리고 70% 에탄올로 트레드밀을 청소합니다.

추가 분석을 위해 발에서 굴근 digitorum brevis 근육의 표층을 분리합니다. 먼저 발바닥 피부의 정중선에서 아래 근육이 손상되지 않도록 주의하면서 절개합니다. 다음으로 가로로 자르고 피부를 제거합니다.

종골 뼈에 부착된 FDB 근육의 편평한 흰색 힘줄을 확인합니다. 집게를 사용하여 부착 부위에 가까운 힘줄을 분리한 다음 절단합니다. 힘줄을 부드럽게 위로 당기면서 결합 조직을 잘라냅니다.

원위 힘줄이 개별 손가락으로 분기되는 위치를 찾습니다. 근육의 더 깊은 층과 연결되는 힘줄을 자르고 FDB를 제거합니다. FDB 근육 다발을 1ml의 콜라겐분해효소 용액에 넣고 섭씨 37도로 예열합니다.

섭씨 37도의 오비탈 셰이커에 튜브를 수평으로 테이프로 붙이고 200RPM으로 65분 동안 흔듭니다. 충분한 소화는 두려운 외모와 창백한 색으로 표시됩니다. 소화된 다발이 통과할 수 있도록 1밀리리터 피펫 팁의 끝을 자릅니다.

약 600마이크로리터의 2.5가 들어 있는 원심분리기 튜브로 번들을 쉽게 옮길 수 있습니다. 칼슘 티로. 튜브를 부드럽게 뒤집어 다발에서 느슨한 섬유를 흔듭니다.

다음으로, 직경이 근육 다발보다 약간 작도록 30 마이크로 리터 피펫 팁의 끝을 자릅니다. 이 팁을 사용하여 번들을 파이펫으로 끌어당긴 다음 용액에 다시 밀어 넣습니다. 대부분의 파이버가 번들에서 분리될 때까지 이 프로세스를 반복합니다.

튜브를 부드럽게 돌려 분리된 섬유를 혼합합니다. 원하는 양을 제거하고 유리 바닥 델타 T 접시에 떨어뜨립니다. 나머지 섬유는 사용 및 추가 연구를 위해 약 6시간 동안 섭씨 4도에서 보관하십시오.

접시를 5분 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오. 이렇게 하면 섬유가 접시의 유리 바닥에 부착될 수 있습니다. UV 레이저가 장착된 컨포칼 현미경에 유리 바닥 접시를 놓습니다.

100배 이상의 배율에서 위상 현미경 검사에서 섬유를 관찰하여 정상적인 줄무늬 패턴과 직선 막대와 같은 모양이 있는지 확인합니다. FM 1 43 또는 FM 4 64 스티로 회음부 다이를 용액에 첨가하여 최종 농도 2.5 마이크로 몰로 만듭니다. 광섬유를 시야의 왼쪽 상단에서 오른쪽 하단까지 45도 각도로 배치하여 손상을 유발합니다.

원형질막의 5 x 5 픽셀 영역을 조사합니다. 5초 동안 최대 출력으로 설정된 UV 레이저를 사용하여 조사된 영역은 5 x 5 상자의 절반인 원형질막을 섬유 내부에 있어야 하고 나머지는 섬유 외부에 있어야 합니다. 염료가 섬유로 들어가는 이미지를 최대 5분 동안 각각 5초 간격으로 캡처해야 합니다. 접시당 3개의 섬유만 조사할 수 있는데, 이는 형광 염료가 결국 섬유에 내포작용하여 데이터 분석을 복잡하게 만들기 때문입니다.

세 가지 섬유를 사용한 후에는 새로운 요리를 준비해야 합니다. 분석 소프트웨어를 사용하여 섬유 간 비교를 위해 약 200제곱미크론 영역에서 형광 강도의 변화를 계산합니다. 각 프레임 델타 F를 F 0으로 나눈 값에 대해 다음 계산을 수행해야 하며, 여기서 F 0은 첫 번째 캡처된 프레임에서 관심 영역의 평균 형광이고 델타 F는 각 후속 프레임에서 형광의 변화입니다.

표준 방법을 사용하여 GFP MG 53을 발현하는 플라스미드 DNA로 세포를 transfection합니다. 그런 다음 마이크로 피펫을 준비합니다. Pyrex 모세관을 마이크로 피펫에 놓습니다.

사전 설정된 프로그램으로 당기고 당깁니다. 마이크로 피펫을 3축 마이크로 매니퓰레이터 배양액에 부착합니다. 델타 T 접시에서 매체를 제거하고 2.5밀리몰 칼슘 티로 완충액으로 교체합니다.

형질주입된 세포가 들어 있는 접시를 40 x 1.3 NA 오일 이멀젼 대물렌즈가 있는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에 놓습니다. 마이크로 피펫을 세포막에 삽입한 다음 마이크로 피펫을 세포 밖으로 빠르게 수축시켜 급성 생체 손상을 유도합니다. 트로포닌 유도 막 파괴에 대해 프레임당 1.54초 간격으로 연속적인 살아있는 세포 이미지를 수집합니다.

PERFU 0.005%트로포닌을 이미징되는 세포 바로 위에서 분당 약 1밀리리터의 속도로 주입합니다. 트레드밀은 주행 능력의 감소를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있는 MG 53 녹아웃 마우스는 골격근의 손상으로 인해 달리기 능력이 감소했습니다.

UV 레이저로 인한 손상 정도는 보이는 섬유의 멤브레인 복구 용량에 따라 다릅니다. 다음은 일반 마우스에서 부상을 입기 전의 섬유입니다. 이 이미지는 200초 후에 캡처되었으며 약간의 부상을 보여줍니다.

막 복구 능력이 손상된 MG 53 녹아웃 마우스에서 파생된 근육 섬유는 부상 후 더 많은 염료 유입을 나타냅니다. 다음은 손상되지 않은 GFP MG 53 형질 주입된 C two C 12 myo 튜브의 예입니다. 이 이미지의 화살표는 손상 부위를 향해 이동하는 소포를 포함하는 GFP MG 53을 가리킵니다.

이 예에서는 사포닌을 사용하여 원형질막을 손상시켰습니다. 손상 후 GFP MG 53이 세포질에서 세포막으로 전좌되는 것을 주목하십시오. 이 절차를 시도하는 동안 부드러운 saral membranes와 명확한 줄무늬 패턴으로 좋은 근육 섬유를 분리하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 근육과 배양물, 세포의 막 복구 능력을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.