조직 표면 Tensiometry에 의해 집계 응집력의 측정

본 절차에서는 응집체와 같은 3D 조직의 세포 내 결합 강도를 측정하는 방법을 보여줍니다. 첫 번째 단계는 구형의 조직 유사 응집체를 생성하고 이를 조직 배양액이 채워진 페트리 접시로 옮기는 것입니다. 다음으로 개별 응집체를 파스퇴르 피펫으로 흡입하여 텐시오미터 챔버의 하단 압축 플레이트에 적재합니다.

그런 다음 상부 압축판을 니켈-크롬 와이어에 연결하여 전자 저울과 연결하고, F zero라고 하는 0점 기준 무게를 설정합니다. 하부 압축판을 올려 골재가 상부 및 하부 압축판 사이에 압축될 때 실험이 시작되며, 골재가 형상 및 힘의 평형 상태인 FEQ에 도달하면 종료됩니다. 절차의 마지막 단계는 이미지를 캡처하고, 골재의 기하학적 구조와 저항력을 측정하여 이러한 측정값을 영-라플라스(Young-Laplace) 방정식에 입력하는 것입니다.

최종적으로, 응집체 확산 분석 또는 세포 분류 분석을 통해 각각 조직 응집력의 변화와 이것이 종양 확산이나 서로 다른 세포 집단 간의 공간적 배치에 어떻게 영향을 미치는지 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 따라서 이 방법은 종양 생물학, 배아 발달 및 조직 공학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 종양 응집력이 악성 침윤에 어떤 영향을 미치는지, 또는 원장 형성 과정 중 배엽의 층상화가 어떻게 이루어지는지와 같은 질문들입니다.

또는 어떻게 하면 실제로 응집력을 설계하여 체외(in vitro)에서 기능적인 장기 유사 구조를 생성할 수 있을까요? 살아있는 세포 배양과 관련된 실험적 조작은 지정된 층류 후드(lamina flow hood) 내에서 무균 상태로 수행해야 합니다. 전 과정에서 멸균 용액과 멸균 실험 기구를 사용해야 합니다. 이 실험을 시작하려면, 90% 합류도(confluency)에서 부착 세포를 수확하십시오.

먼저, 배양액을 흡입하여 제거하고 세포 시트를 PBS로 두 번 헹굽니다. 그런 다음 PBS를 흡입하여 제거하고 0.05%trypsin-EDTA 용액 2 mL를 단층 세포 위에 피펫으로 분주합니다. 플레이트를 37 °C 조직 배양 인큐베이터에 넣고 세포가 떨어질 때까지 배양합니다.

다음으로, 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내고 2 mL의 완전 배지를 첨가하여 효소 처리를 중단시킵니다. 5 mL 피펫을 사용하여 세포가 완전히 부유될 때까지 혼합물을 파이펫팅합니다. 그 후 세포 현탁액을 15 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다.

10 mg/mL DNA 용액 40 µL를 세포 현탁액에 피펫팅하고 상온에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후, 세포 현탁액을 짧게 볼텍싱한 다음 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그 후, 펠렛을 1 mL의 완전 배지로 재현탁하고 원심분리를 반복하여 세척합니다.

펠렛을 1 mL의 완전 배지에 현탁한 후, 세포 수를 측정하고 필요시 완전 배지를 사용하여 세포 현탁액의 농도를 6 × 10⁶ cells/mL로 조정하십시오. 세포 현탁액 3 mL를 10 mL 라운드 바텀 플라스크에 옮기고, 37 °C, 5% CO₂ 조건의 진탕 항온수조에서 120 rpm으로 4시간 동안 배양하여 세포가 서로 붙어 작은 클러스터를 형성함으로써 이온화로부터 회복될 때까지 기다립니다.

다음으로, 세포를 유리 라운드 바텀 원심분리 튜브로 옮기고 200 ×g에서 4분 동안 원심분리하여 원심분리 후 얇은 층이 형성되도록 합니다. 가스 교환이 가능하도록 튜브 캡을 느슨하게 조인 후, 튜브를 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 24시간 동안 배양하면 시트가 응집됩니다.

24시간 후, 원심분리 튜브를 부드럽게 흔들어 시트를 떼어냅니다. 그다음 배양 튜브의 내용물을 작은 멸균 유리 조직 배양 접시에 붓습니다. 마이크로 메스를 사용하여 세포 시트를 다양한 크기의 조각으로 자른 후, 이 조각들을 3 mL의 조직 배양 배지가 담긴 10 mL 라운드 바텀 플라스크로 옮깁니다.

단편들을 37 °C의 진탕 항온수조에서 120 rpm, 5% CO₂ 조건으로 2~3일 동안 또는 구형이 될 때까지 배양합니다. 응집체 형성은 현적법(hanging drop method)을 사용하여 수행할 수도 있습니다. 이전에 발표된 프로토콜에 따르면, 조직 표면 장력계(tissue surface TENSIOMETER 또는 TST) 설정은 압축 셀이 포함된 메인 장력계 챔버, 챔버의 온도를 유지하기 위한 항온수조, CCD 카메라가 부착된 해부 현미경, 전원 공급 장치가 연결된 정밀 전자 저울 및 차트 기록계로 구성됩니다.

TST의 압축 셀은 외부 챔버와 내부 챔버의 두 개의 챔버로 구성됩니다. 내부 챔버에는 poly two hydroxyethyl methacrylate가 코팅된 상부 압축 플레이트와 하부 압축 플레이트가 들어 있습니다. 먼저, 순환수 펌프를 37 °C로 설정하고 파이프가 외부 챔버의 포트에 연결되어 있는지 확인하십시오.

그 다음, 압축을 시작하기 위해 골재를 들어 올리는 데 사용되는 하단 어셈블리를 내부 챔버 바닥에 나사로 고정합니다. 이어서, 먼저 15 inch 길이의 니켈 크롬 와이어를 레토르트 스탠드에 매달고 끝부분에 작은 바인더 클립을 고정한 뒤, 화염으로 곧게 편 와이어를 준비합니다. 그런 다음 분젠 버너를 와이어의 길이를 따라 위아래로 움직여 와이어가 붉게 달아오를 때까지 가열합니다.

와이어 클리퍼를 사용하여 곧게 펴진 와이어를 적절한 길이로 자릅니다. 그다음 면도날 두 개를 사용하여 와이어의 끝에서 약 1/4인치 지점을 구부려 작은 갈고리 모양으로 만듭니다. 마지막으로, 37°C에서 24시간 동안 배양하여 탈기시킨 이산화탄소 독립 조직 배양 배지를 TST의 내부 챔버에 채웁니다.

피펫을 사용하여 하단 압축 플레이트에 형성되었을 수 있는 기포를 제거하십시오. 이제 TST 장치가 응집체 압축 실험을 수행할 준비가 되었습니다. APA 피펫을 사용하여 배양 플레이트에서 200 내지 300 microns 크기의 세포 응집체를 흡입하십시오.

그런 다음 응집체를 TST 장치의 내부 챔버에 있는 하단 압축판 위로 조심스럽게 밀어냅니다. 작은 헤어 루프가 장착된 모세관을 사용하여 응집체를 살짝 밀어 하단 압축판의 중앙에 최대한 가깝게 배치합니다. 플레이트 어셈블리의 니켈 크롬 와이어를 can venton Model 2000 기록 전자기 저울의 저울 팔에 연결합니다.

상단 및 하단 압축판이 서로 평행하고 수직으로 일직선이 될 때까지 밸런스의 위치를 조정합니다. 상단 판이 안착될 때까지 기다립니다. 그 후, 차트 기록기를 설정된 기준 무게로 영점 조절합니다.

CCD 카메라가 장착된 해부 현미경을 사용하여 압축되지 않은 응집체의 이미지를 캡처합니다. 다음으로, 내부 코어 장치의 높이를 조절하여 원하는 압축 정도를 제어한 후, 응집체가 상단 압축판에 밀착되어 압축될 때까지 하단 압축판을 올립니다. CCD 카메라가 장착된 해부 현미경을 사용하여 압축 과정을 모니터링하고, 여기에 표시된 것과 같은 응집체의 이미지를 캡처합니다.

형상이 완성될 때까지 압축 전 과정 동안 스트립 차트 기록계(strip chart recorder)를 사용하여 겉보기 상부 압축판 중량 변화를 지속적으로 기록하십시오. 평형 상태는 캔 밸런스 전압 출력값이 일정하게 유지되는 것으로 나타납니다. 다시 한번 CCD 카메라가 장착된 해부 현미경을 사용하여 압축된 골재의 이미지를 캡처하십시오.

이 이미지는 응집체 기하학적 구조를 측정하는 데 사용됩니다. 이미지를 캡처한 후, 압축판을 내려 응집체를 감압함으로써 평형 상태에서의 압축력을 측정하십시오. 차트 기록기의 추적선을 응집체를 감압하기 직전에 측정된 힘과 설정된 제로 베이스라인 사이의 차이로 읽으십시오. 이번에는 다른 압축도를 사용하여 동일한 과정을 반복함으로써 힘의 평형을 결정하십시오.

힘 평형 상태에서의 압축력과 기하학적 구조를 측정하고, 이를 형상 평형 측정값과 함께 Young-Laplace 방정식에 적용하여 겉보기 조직 표면 장력의 수치를 산출합니다. 서면 프로토콜의 지침에 따라, 이 표는 쥐 전립선, 섬유아세포 및 평활근 세포 응집체의 조직 표면 장력 측정값과 응집체 액상성 확인 결과를 보여줍니다. 쥐 전립선 섬유아세포 응집체의 표면 장력은 22.8 ± 1.1 dyn/cm입니다.

또한, 대응표본 T-검정으로 비교했을 때 1차 압축 후와 2차 압축 후에 측정된 평균 표면 장력 값은 통계적으로 동일했습니다. 우리는 또한 표 1에 나타낸 바와 같이, 이 응집체들이 탄성 고체처럼 거동할 때 따르는 후크의 법칙(hook's law)을 따르지 않는지 확인하기 위해 Sigma 1 대비 sigma 2의 비율과 F1 대비 F 2의 비율을 비교했습니다. sigma 2와 Sigma 1의 비율은 실제로 1에 근접합니다.

또한, F2와 F1의 비율은 σ2와 σ1의 비율보다 유의하게 컸습니다. 이는 이러한 응집체가 훅의 법칙(hook's law)을 따르지 않으며 실제로 액체처럼 행동한다는 것을 더욱 뒷받침합니다. 이와 대조적으로 표 1에서 알 수 있듯이, 쥐 전립선 평활근 세포의 σ2와 σ1의 비율은 1보다 유의하게 컸으며 F2와 F1의 비율과 통계적으로 차이가 없었습니다. 액체와 같은 행동을 추가로 증명하기 위해, 여기에서 볼 수 있듯이 표면 장력과 응집체 부피 사이의 관계를 조사했습니다. 빨간색 회귀선으로 표시된 것처럼 RPF 세포의 경우 부피는 σ와 무관한 반면, 파란색 회귀선으로 표시된 쥐 전립선 평활근 세포의 경우 σ가 부피에 어느 정도 의존하는 것으로 보입니다.

이러한 데이터는 쥐 전립선 섬유아세포 응집체가 액체와 유사한 방식으로 행동하는 반면, 쥐 전립선 평활근 세포의 응집체는 탄성 고체에 더 가깝게 행동한다는 점을 추가적으로 확인시켜 줍니다. 따라서 이 기술은 개발 이후, 양서류, 제브라피쉬, 조류 및 인간 모델을 포함한 다양한 동물 모델에서 배아 배엽 발달 중 서로 다른 세포 유형 간의 구획과 경계를 설정하고, 종양 기질 세포 간의 상호작용 및 췌장 섬 세포 재배열 과정에서 조직 응집력이 수행하는 역할을 탐구하고자 하는 배아 발달, 악성 침습 및 조직 공학 분야 연구자들에게 길을 열어주었습니다.