조직 표면 Tensiometry에 의해 집계 응집력의 측정

이 절차는 응집체와 같은 3D 조직에서 세포 내 응집력의 강도를 측정하는 방법을 보여줍니다. 첫 번째 단계는 응집체와 같은 구형 조직을 생성하고 이를 조직 배양 배지로 채워진 페트리 접시로 옮기는 것입니다. 다음으로, 개별 응집체를 파스타 피펫으로 흡인하고 장력계 챔버의 하부 압축판에 로드합니다.

그런 다음 상부 압축판은 니켈 크롬 와이어에 연결되어 전기 저울에 연결하고 F 0이라고 하는 0 기준선 가중치를 설정합니다. 실험은 골재가 하부 압축판과 상부 압축판 사이에서 압축될 때까지 하부 압축판을 올리는 것으로 시작되며 응집체가 형상 및 힘 평형 또는 FEQ에 도달하면 종료됩니다. 절차의 마지막 단계는 이미지를 캡처하고, 응집체 형상과 저항력을 측정하고, 이러한 측정값을 젊은 LA 장소 방정식에 입력하는 것입니다.

궁극적으로, 조직 응집력의 변화와 이것이 각각 응집체 확산 분석 또는 세포 분류 분석을 통해 서로 다른 세포 집단 간의 종양 분산 또는 공간적 위치에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 따라서 이 방법은 종양 생물학, 배아 발달 및 조직 공학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 종양 응집력은 어떻게 악성 침입에 영향을 미치는가, 위장 중 세균층의 성층화에 어떤 영향을 미치는가?

응집력을 설계하여 구조와 같은 기능적 기관을 생성할 수 있습니까?시험관 내 살아있는 세포의 배양과 관련된 실험적 조작은 지정된 층류 후드에서 무균 조건에서 수행되어야 합니다. 멸균 용액과 멸균 LabWare를 전체적으로 사용해야 합니다. 이 실험을 시작하려면 90%co fluency에서 부착 세포를 수확합니다.

먼저 배양 배지를 흡인하고 PBS로 세포 시트를 두 번 헹굽니다. 그런 다음 PBS를 흡인하고 EDTA 용액에서 0.05% 트립 2밀리리터를 단층에 피펫팅합니다. 플레이트를 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에 넣고 세포가 분리될 때까지 배양합니다.

다음으로, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 2ml의 완전한 배지를 추가하여 진행을 중지합니다. 5ml 피펫을 사용하여 세포가 완전히 현탁액이 될 때까지 혼합물을 트라이 레이트합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

밀리리터당 10밀리그램의 DNA 용액 40마이크로리터를 세포 현탁액에 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다.배양 후 세포 현탁액을 잠시 와류로 회전시킨 다음 5분 동안 200배 중력에서 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 sup, natant를 흡인하고 폐기합니다. 그런 다음 Reese, 완전한 매체 1ml에 펠릿을 현탁시키고 원심분리를 반복하여 Reese를 세척합니다.

펠릿을 1ml의 완전한 배지에 현탁시킨 다음 세포 계수를 수행하고 필요한 경우 세포 현탁액의 농도를 1회로 조정합니다. 밀리리터당 6개의 셀을 완전한 중간 피펫으로 중앙에 놓습니다. 3밀리리터의 세포 현탁액을 10밀리리터의 둥근 바닥 플라스크에 넣고 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 4시간 동안 세포가 서로 달라붙어 작은 클러스터를 형성하는 것으로 표시된 대로 이온화에서 회복될 때까지 분당 120회 회전하면서 흔들리는 수조를 배양합니다.

다음으로, 세포를 유리로 된 둥근 바닥 원심분리기 튜브에 옮기고 200배 중력에서 4분 동안 원심분리하여 원심분리 후 얇은 시트를 형성합니다. 가스가 교환될 수 있도록 튜브의 캡을 풀고 튜브를 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 24 시간 동안 배양하면 시트가 응집되어야합니다.

24시간 후 원심분리기 튜브를 부드럽게 부풀어 시트를 제거합니다. 그런 다음 배양 튜브의 내용물을 작은 멸균 유리 조직 배양 접시에 붓습니다. 마이크로 메스를 사용하여 세포 시트를 다양한 크기의 조각으로 자른 다음 조각을 3ml의 조직 배양 배지가 있는 10ml 둥근 바닥 플라스크로 옮깁니다.

섭씨 37도의 진탕에서 5% 이산화탄소 농도에서 분당 120회 회전하면서 2-3일 동안 또는 구형이 될 때까지 파편을 배양합니다. 응집체 형성은 또한 행잉 드롭(hanging drop) 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 이전에 발표된 프로토콜에 따르면 조직 표면 장력계 또는 TST 설정은 압축 셀을 포함하는 주 장력계 챔버, 챔버의 온도를 유지하기 위한 수조, CCD 카메라가 부착된 해부 현미경, 전원 공급 장치가 있는 자동차 전기 저울 및 차트 레코더

TST의 압축 셀은 외부 챔버와 내부 챔버의 두 개의 챔버로 구성됩니다. 내부 챔버에는 폴리 2 하이드록시에틸 메타크릴레이트 코팅된 상부 압축판과 하부 압축판이 있습니다. 먼저 순환수 펌프를 섭씨 37도로 설정하고 파이프가 외부 챔버의 포트에 연결되어 있는지 확인합니다.

그런 다음 내부 챔버의 바닥으로 압축을 시작하기 위해 골재를 들어 올리는 데 사용되는 하단 어셈블리를 조입니다. 다음으로, 먼저 레토르트 스탠드에 15인치 길이의 와이어를 걸고 끝에 작은 바인더 클립을 고정하여 화염 직선 니켈 크롬 와이어의 길이를 준비합니다. 그런 다음 와이어가 빨간색으로 빛날 때까지 번트와 버너를 와이어 길이만큼 위아래로 실행합니다.

와이어 클리퍼를 사용하여 곧게 펴진 와이어를 적절한 길이로 자릅니다. 그런 다음 두 개의 면도날을 사용하여 끝에서 약 1/4인치 떨어진 곳에서 와이어를 구부려 작은 고리를 만듭니다. 마지막으로, TST의 내부 챔버를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하여 가스를 제거한 이산화탄소 독립 조직 배양 배지로 채웁니다.

하부 압축 플레이트에 형성되었을 수 있는 기포를 대체하기 위해 피펫을 사용합니다. 이제 TST 장치가 응집체 압축 실험을 할 준비가 되었습니다. APA 피펫을 사용하여 배양 플레이트에서 200 - 300 미크론의 세포 응집체를 흡인합니다.

그런 다음 TST 장치의 내부 챔버에 있는 하단 압축판으로 골재를 부드럽게 배출합니다. 작은 헤어 루프가 있는 모세관으로 부드럽게 밀어 골재를 하단 압축판의 중앙에 최대한 가깝게 배치합니다. 니켈 크롬 와이어를 플레이트 어셈블리를 캔 venton 모델 2000 기록 전기 저울의 밸런스 암에 연결합니다.

상부 및 하부 압축판이 평행이 되고 서로 바로 위에 올 때까지 저울의 위치를 조정합니다. 상판이 가라앉을 때까지 기다립니다. 그런 다음 차트 레코더를 설정된 기준선 가중치로 영점 조정합니다.

CCD 카메라가 장착된 해부 현미경을 사용하여 압축되지 않은 응집체의 이미지를 캡처합니다. 다음으로, 원하는 압축 정도를 제어하기 위해 내부 코어 장치의 높이를 조정한 다음 골재가 상부 압축판에 대해 압축될 때까지 하부 압축판을 올립니다. CCD 카메라가 장착된 해부 현미경을 사용하여 압축을 모니터링하고 여기에 표시된 것과 같은 골재의 이미지를 캡처합니다.

모양이 달성될 때까지 압축 전반에 걸쳐 스트립 차트 레코더에 명백한 상부 압축 플레이트 중량 변화를 지속적으로 기록합니다. 평형은 캔 밸런스 전압 출력의 평준화로 표시됩니다. 다시 한 번, CCD 카메라가 장착된 해부 현미경을 사용하여 압축된 응집체의 이미지를 캡처합니다.

이 이미지는 골재 형상을 측정하는 데 사용됩니다.이미지를 캡처한 후 압축판을 내려 골재를 감압하고 평형 상태에서 압축력을 측정합니다. 차트 레코더 추적을 집계 감압 직전에 측정된 힘과 설정된 0 기준선 간의 차이로 읽습니다. 이번에는 힘의 평형을 결정하기 위해 다른 정도의 압축을 사용하여 프로세스를 반복합니다.

힘 평형에서 압축력과 기하학을 측정하고 이러한 측정값을 형상 평형 측정과 함께 Young laplace 방정식에 적용하여 겉보기 조직 표면 장력의 수치를 생성합니다. 서면 프로토콜의 지침에 따라 이 표는 쥐 전립선, 섬유아세포 및 평활근 세포의 응집체에 대한 조직 표면 장력 측정 및 응집 유동성 확인을 보여줍니다. 쥐 전립선 섬유아세포 세포의 응집체는 센티미터당 22.8 플러스 마이너스 1.1 딘의 표면 장력을 가지고 있습니다.

또한, 압축 1 후와 압축 2 후에 측정된 평균 표면 장력 값은 쌍체 T 검정으로 비교할 때 통계적으로 동일했습니다. 또한 시그마 2와 시그마 1의 비율, F1에 비해 F 2의 비율을 비교하여 이러한 응집체가 표 1에서 보여준 것처럼 탄성 고체로 거동하는 것처럼 후크의 법칙을 따르지 않는지 확인했습니다. 시그마 1에 대한 시그마 2의 비율은 실제로 1에 가깝습니다.

더욱이, F1에 대한 F 2의 비율은 시그마 2에 대한 시그마 2보다 유의하게 컸다. 1개는 또한 이러한 응집체가 훅의 법칙을 따르지 않고 실제로 액체로 작용한다는 것을 확인하며, 표 1에서 명백히 알 수 있듯이, 쥐의 전립선 평활근 세포의 시그마 1에 비해 시그마 2의 비율은 1보다 유의하게 크며 F2 이상의 비율과 통계적으로 다르지 않았으며, F1.To 또한 액체와 같은 행동을 보여주고, 우리는 여기에서 볼 수 있듯이 표면 장력과 골재 부피 사이의 관계를 탐구했습니다. 부피는 빨간색 회귀선으로 표시된 것처럼 RPF 세포에 대한 시그마와 무관한 반면, 파란색 회귀선으로 표시된 것처럼 쥐 전립선 평활근 세포에 대한 부피에 대한 시그마의 일부 의존성이 있는 것으로 보입니다.

이러한 데이터는 쥐의 전립선 섬유아세포 응집체가 액체와 같은 방식으로 행동하는 반면, 쥐의 전립선 평활근 세포의 응집체는 탄성 고체로 더 많이 행동하는 것으로 보인다는 것을 추가로 확인합니다. 따라서 개발 후 이 기술은 배아 발달, 악성 침입 및 조직 공학 분야의 연구자들이 배아 생식층 발달 중, 양서류를 포함한 다양한 동물 모델에서 종양 기질 세포 상호 작용 및 췌장 구멍 세포 재배열 중에 서로 다른 세포 유형 간의 구획 및 경계를 설정하는 조직 응집력의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. Telio, Sine 조류 및 인간 모델.