Name: 표준 임상 Assays에 의해 탐지의 한도 이하 바이러스성로드와 HIV 감염된 개인의 확장 및 HIV - 1 RNA를 Quantifying (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: 배우세요 저바이러스량 HIV-1 RNA 정량 및 단일 게놈 시퀀싱 방법을 통해 바이러스 역학을 연구하는 기법을. 실시간 PCR과 중심분리를 활용하여 0.3 copies/ml까지 검출 가능합니다.

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저자는 HIV - 1의 많은 연구에 참여한 환자를 인정하고 싶습니다. JMC는 FM 커비 재단의 지원으로 미국 암 협회의 연구 교수되었습니다.

<ol><li>Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O'Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+a+mucosal+challenge+and+prevention+of+AIDS+by+a+multiprotein+DNA%2FMVA+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine.</a> Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).</li>
<li>Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Dynamics+of+Elite+Suppressors+in+HIV-1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Conference+on+Retroviruses+and+Opportunistic+Infections%22%5BJournal%5D)">Viral Dynamics of Elite Suppressors in HIV-1 Infection.</a> Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. , (2008).</li>
<li>Dinoso, J. B., Kim, S. Y., Wiegand, A. M., Palmer, S. E., Gange, S. J., Cranmer, L., O'Shea, A., Callender, M., Spivak, A., Brennan, T., Kearney, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+intensification+does+not+reduce+residual+HIV-1+viremia+in+patients+on+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Treatment intensification does not reduce residual HIV-1 viremia in patients on highly active antiretroviral therapy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9403-9408 (2009).</li>
<li>Doria-Rose, N. A., Klein, R. M., Manion, M. M., O'Dell, S., Phogat, A., Chakrabarti, B., Hallahan, C. W., Migueles, S. A., Wrammert, J., Ahmed, R., Nason, M., Wyatt, R. T., Mascola, J. R., Connors, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+and+phenotype+of+human+immunodeficiency+virus+envelope-specific+B+cells+from+patients+with+broadly+cross-neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Frequency and phenotype of human immunodeficiency virus envelope-specific B cells from patients with broadly cross-neutralizing antibodies.</a> J. Virol. 83, 188-199 (2009).</li>
<li>Dornadula, G., Zhang, H., Uitert, B. V. an, Stern, J., Livornese, L., Ingerman, M. J., Witek, J., Kedanis, R. J., Natkin, J., DeSimone, J., Pomerantz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+HIV-1+RNA+in+blood+plasma+of+patients+taking+suppressive+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Residual HIV-1 RNA in blood plasma of patients taking suppressive highly active antiretroviral therapy.</a> JAMA. 282, 1627-1632 (1999).</li>
<li>Gandhi, R. T., Zheng, L., Bosch, R. J., Chan, E. S., Margolis, D. M., Read, S., Kallungal, B., Palmer, S., Medvik, K., Lederman, M. M., Alatrakchi, N., Jacobson, J. M., Wiegand, A., Kearney, M., Coffin, J. M., Mellors, J. W., Eron, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+raltegravir+intensification+on+low-level+residual+viremia+in+HIV-infected+patients+on+antiretroviral+therapy%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+medicine%22%5BJournal%5D)">The effect of raltegravir intensification on low-level residual viremia in HIV-infected patients on antiretroviral therapy: a randomized controlled trial.</a> PLoS medicine. 7, (2010).</li>
<li>Gay, C., Dibben, O., Anderson, J. A., Stacey, A., Mayo, A. J., Norris, P. J., Kuruc, J. D., Salazar-Gonzalez, J. F., Li, H., Keele, B. F., Hicks, C., Margolis, D., Ferrari, G., Haynes, B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+detection+of+acute+HIV+infection%3A+timing+of+transmission%2C+inflammation+and+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional detection of acute HIV infection: timing of transmission, inflammation and antiretroviral therapy.</a> PLoS One. 6, 19617-19617 (2011).</li>
<li>Hatano, H., Delwart, E. L., Norris, P. J., Lee, T. H., Dunn-Williams, J., Hunt, P. W., Hoh, R., Stramer, S. L., Linnen, J. M., McCune, J. M., Martin, J. N., Busch, M. P., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+persistent+low-level+viremia+in+individuals+who+control+human+immunodeficiency+virus+in+the+absence+of+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Evidence for persistent low-level viremia in individuals who control human immunodeficiency virus in the absence of antiretroviral therapy.</a> J. Virol. 83, 329-335 (2009).</li>
<li>Havlir, D. V., Bassett, R., Levitan, D., Gilbert, P., Tebas, P., Collier, A. C., Hirsch, M. S., Ignacio, C., Condra, J., Gunthard, H. F., Richman, D. D., Wong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+predictive+value+of+intermittent+viremia+with+combination+hiv+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Prevalence and predictive value of intermittent viremia with combination hiv therapy.</a> JAMA. 286, 171-179 (2001).</li>
<li>Jordan, M. R., Kearney, M., Palmer, S., Shao, W., Maldarelli, F., Coakley, E. P., Chappey, C., Wanke, C., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+PCR%2Fcloning+to+single+genome+sequencing+for+analysis+of+HIV-1+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard PCR/cloning to single genome sequencing for analysis of HIV-1 populations.</a> J Virol Methods. 168, 114-120 (2010).</li>
<li>Kaufmann, D. E., Kavanagh, D. G., Pereyra, F., Zaunders, J. J., Mackey, E. W., Miura, T., Palmer, S., Brockman, M., Rathod, A., Piechocka-Trocha, A., Baker, B., Zhu, B., Gall, S. L. e, Waring, M. T., Ahern, R., Moss, K., Kelleher, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+CTLA-4+by+HIV-specific+CD4%2B+T+cells+correlates+with+disease+progression+and+defines+a+reversible+immune+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of CTLA-4 by HIV-specific CD4+ T cells correlates with disease progression and defines a reversible immune dysfunction.</a> Nat Immunol. 8, 1246-1254 (2007).</li>
<li>Kearney, M., Maldarelli, F., Shao, W., Margolick, J. B., Daar, E. S., Mellors, J. W., Rao, V., Coffin, J. M., Palmer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Population+Genetics+and+Adaptation+in+Newly+Infected+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Population Genetics and Adaptation in Newly Infected Individuals.</a> J. Virol. 83, 2715-2727 (2008).</li>
<li>Kearney, M., Palmer, S., Maldarelli, F., Shao, W., Polis, M. A., Mican, J., Rock-Kress, D., Margolick, J. B., Coffin, J. M., Mellors, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+polymorphism+at+drug+resistance+sites+in+HIV-1+protease+and+reverse+transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Frequent polymorphism at drug resistance sites in HIV-1 protease and reverse transcriptase.</a> AIDS. 22, 497-501 (2008).</li>
<li>Kearney, M., Spindler, J., Shao, W., Maldarelli, F., Palmer, S., Hu, S. L., Lifson, J. D., Kewal Ramani, V. N., Mellors, J. W., Coffin, J. M., Ambrose, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+of+simian+immunodeficiency+virus+encoding+HIV-1+reverse+transcriptase+persists+in+macaques+despite+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity of simian immunodeficiency virus encoding HIV-1 reverse transcriptase persists in macaques despite antiretroviral therapy.</a> Journal of Virology. 85, 1067-1076 (2011).</li>
<li>Keele, B. F., Giorgi, E. E., Salazar-Gonzalez, J. F., Decker, J. M., Pham, K. T., Salazar, M. G., Sun, C., Grayson, T., Wang, S., Li, H., Wei, X., Jiang, C., Kirchherr, J. L., Gao, F., Anderson, J. A., Ping, L. H., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+transmitted+and+early+founder+virus+envelopes+in+primary+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 105-7552 (2008).</li>
<li>Liu, S. L., Rodrigo, A. G., Shankarappa, R. G., Learn, H., Hsu, L., Davidov, O., Zhao, L. P., Mullins, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+quasispecies+and+resampling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV quasispecies and resampling.</a> Science. 273, 415-416 (1996).</li>
<li>Mahalanabis, M., Jayaraman, P., Miura, T., Pereyra, F., Chester, E. M., Richardson, B., Walker, B., Haigwood, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+viral+escape+and+selection+by+autologous+neutralizing+antibodies+in+drug-naive+human+immunodeficiency+virus+controllers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Continuous viral escape and selection by autologous neutralizing antibodies in drug-naive human immunodeficiency virus controllers.</a> J. Virol. 83, 662-672 (2009).</li>
<li>Migueles, S. A., Connors, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+CD4%28%2B%29+and+CD8%28%2B%29+T+Cells+in+Controlling+HIV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Infect.+Dis.+Rep%22%5BJournal%5D)">The Role of CD4(+) and CD8(+) T Cells in Controlling HIV Infection.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 4, 461-467 (2002).</li>
<li>Palmer, S., Kearney, M., Maldarelli, F., Halvas, E. K., Bixby, C. J., Bazmi, H., Rock, D., Falloon, J., Davey, R. T., Dewar, R. L., Metcalf, J. A., Hammer, S., Mellors, J. W., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 406-413 (2005).</li>
<li>Palmer, S., Wiegand, A. P., Maldarelli, F., Bazmi, H., Mican, J. M., Polis, M., Dewar, R. L., Planta, A., Liu, S., Metcalf, J. A., Mellors, J. W., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+real-time+reverse+transcriptase-initiated+PCR+assay+with+single-copy+sensitivity+for+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNA+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 4531-4536 (2003).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

HIV - 1 감염을 자연스럽게 제어 감염 조합 antiretroviral 치료에 대한 개인 (카트) 또는 매우 낮은 바이러스성로드, 플라즈마 4, 11, 12, 17, 18 ML 당 일반적으로 한 주변의 복사본을 가지고. 자연 컨트롤과 환자의 바이러스성로드는 종종 개인의 세트 포인트 1, 2, 17 주변 변동. assays의 감도는 여기에 플라즈마의 입력 볼륨에 크게 의존 설명했다. 일반적으로, 우리는 플라즈마 7 ML로 일하고 있지만, 긍정적인 결과는 실제 플라즈마 바이러스 부하에 따라,뿐만 아니라, 플라즈마의 작은 양의에서 얻을 수있다. 여기 설명되어있는 RNA 추출 방법은 노동 집중되는 &quot;홈 BREW&quot;입니다. 우리는이 추출 방법은 매우 안정적이고 RNA 추출에 대한 기존의 상용 키트보다 효과적인 것으로 나타났습니다. 플라즈마의 품질 제품을 얻을 것이 중요합니다. 이전 동결 혈장의 융해 또는 -80도 이상의 온도에서 저장은 RNA에 손상을 제품의 가능성을 줄일 수 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 무작위 hexamers (500 ug / ML) </td><td> Promega </td><td> C118A </td><td></td></tr><tr><td> Taqman 버퍼 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 4,304,441 </td><td></td></tr><tr><td> RNAsin (40 U / UL) </td><td> Promega </td><td> N211B </td><td></td></tr><tr><td> RT 효소 (200 U / UL) </td><td> Strategene </td><td> 600107-51 </td><td></td></tr><tr><td> Amplitaq 골드의 DNA 중합 효소 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 4,311,814 </td><td> 6 팩 </td></tr><tr><td> Amplitaq 10XGold PCR 버퍼 II </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 4,311,814 </td><td> 효소와 함께 제공 </td></tr><tr><td> Magnesiumcloride 25 MM </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 4,311,814 </td><td> 효소와 함께 제공 </td></tr><tr><td> 1M 트리스 - HCL 버퍼, pH를 8.0, 5 MM </td><td> Invitrogen </td><td> AM9855G </td><td></td></tr><tr><td> 윗첨자 III 리버스 transcriptase 효소, 200 U / UL </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-044 </td><td></td></tr><tr><td> 윗첨자 III 10X 버퍼 </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> 효소와 함께 제공 </td></tr><tr><td> DTT 100 MM </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> 효소와 함께 제공 </td></tr><tr><td> 플래티넘 DNA 형성 촉매 DNA 중합 효소 하이 피델리티 5 U / UL </td><td> Invitrogen </td><td> 11304-102 </td><td></td></tr><tr><td> 10X 하이 피델리티 PCR 버퍼 </td><td> Invitrogen </td><td> 11304-102 </td><td> 효소와 함께 제공 </td></tr><tr><td> Proteinase - K 20 MG / ML </td><td> Ambion </td><td> 2546 </td><td></td></tr><tr><td> Guanidinium Thiocyanate 솔루션 6M </td><td> FlukaBiochemica </td><td> 50,983 </td><td></td></tr><tr><td> 글리코겐 20 MG / ML </td><td> 호슈 </td><td> 10901393001 </td><td></td></tr><tr><td> 이소프로판올 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 19,516 </td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 70% </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> E702 - 3 </td><td></td></tr><tr><td> 분자 등급 물 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> dNTPs (25 mmol 각) </td><td> Bioline </td><td> BIO - 39025 </td><td></td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Euipment 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 쉬운 인감 원심 분리기 튜브 (16x73mm) </td><td> Seaton 과학 </td><td> 6041 </td><td></td></tr><tr><td> 화이트 Delrin 크라운 </td><td> Seaton 과학 </td><td> 4020 </td><td> 쉬운 인감 튜브에 대한 모자 </td></tr><tr><td> Optiseal 벨 - 탑 튜브를위한 튜브 랙, 8.9 ML </td><td> 베크 만 </td><td> 361642 </td><td></td></tr><tr><td> 헥스 드라이버 ½ INC 오픈 </td><td> Seaton 과학 </td><td> 4013 </td><td></td></tr><tr><td> 캡 제거 tupe </td><td> Seaton 과학 </td><td> 4014 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ML serological pipettes </td><td> Costar </td><td> 4051 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetboy </td><td> 어떤 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 ML 전송 pipettes </td><td> ISC Bioexpress </td><td> P - 5005-7 </td><td></td></tr><tr><td> 5.8 ML Dispossable 전송 pipettes, 괜찮아요 팁 </td><td> VWR </td><td> 14670-329 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML 원심 분리기 튜브 </td><td> 매 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 ML의 원심 분리기 튜브 </td><td> 어떤 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 트리스 버퍼 식염 정제 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T5030 - 100TAB </td><td></td></tr><tr><td> 초원 심 분리기 및 로터 </td><td> Sorval </td><td> 90SE 및 T - 1270 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 웰 플레이트 PCR </td><td> Biorad </td><td> HSS - 9601 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ML 시약 저장조 </td><td> Costar </td><td> 4870 </td><td></td></tr><tr><td> Microamp 광학 96 - 웰 플레이트 반응 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> N801 - 0560 </td><td></td></tr><tr><td> 광학 플레이트 커버 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 4,333,183 </td><td></td></tr><tr><td> MicroAmp 광학 압축 패드 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 4,312,639 </td><td></td></tr><tr><td> Microseal영화 </td><td> Biorad </td><td> MSA - 5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2 ML의 원심 분리기 튜브 </td><td> 어떤 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1퍼센트 아가로 오스 젤 (E - 젤, invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> G - 7008-01 </td><td></td></tr><tr><td> E -베이스 (Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> EB - M03 </td><td></td></tr></tbody></table> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 컬렉션 튜브 모든 브랜드

표준 임상 assays에 의해 탐지의 한도 이하 바이러스성로드와 hiv 감염된 개인의 확장 및 hiv - 1 rna를 quantifying

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

바이러스 유전자를 확장 및 표준 assays에 의해 검출 한계 (아래 50-75 사본 / ML) 아래 바이러스성로드와 HIV - 1 감염 개인의 HIV - 1 RNA를 quantifying 것은 환자의 바이러스성 역학 및 바이러스 호스트 상호 작용에 대한 통찰력을 얻기 위해 필요한 사람 자연 감염과 조합 antiretroviral 치료 (카트)에있는 사람을 제어합니다. 여기 하나의 게놈 시퀀싱 (SGS 프로토콜) 13, 19 및 정확하게 낮은 바이러스성로드 (단일 복사본 분석 (SCA) 프로토콜) 12, 20 환자에서 HIV - 1 RNA를 수치로 바이러스 genomes를 증폭하는 방법에 대해 설명합니다. 단일 복사본 분석이 감도는 플라즈마가 assayed되는 볼륨에 따라과 실시간 PCR 분석이다. 단일 바이러스 게놈은 플라즈마 7 ML에 감지되면 RNA 사본 번호는 0.3 복사 / ML 것으로보고됩니다. 분석은 RNA 추출의 효율성을위한 내부 통제 테스트를 가지고 있으며, DNA 또는 오염 가능성 증폭을위한 제어합니다. 환자 표본 세중의 단위로 측정됩니다. 단일 게놈 시퀀싱 분석 (SGS), 현재 널리 사용하고 이외의 노동 집약적인 3, 7, 12, 14, 15로 간주는 끝점이 cDNA 제품이 96 자 이상 전염됩니다 희석하는, 제한 희석 분석입니다 판. Poisson 분포에 따르면, 적은 우물의 1 / 3 이상이 제품을 줄 때, 하나의 cDNA 분자에서 증폭의 PCR 제품되는 결과의 80 % 기회가 있습니다. SGS는 resampling의 대상이되지 및 PCR - 도입된 재조합 19 적이어서하지 복제를 통해 장점이 있습니다. 그러나, SCA와 SGS의 증폭 성공 프라이머 설계에 따라 달라집니다. 두 assays는 HIV - 1 subtype B에 대한 개발되었다지만, 변화 primers, 프로브 및 표준에 의해 다른 subtypes와 게놈의 다른 지역에 적용할 수 있습니다.

플라즈마 및 시퀀싱에서 HIV - 1 RNA 수준을 Quantifying하면 단일 HIV - 1 검출 한계 (50-75 사본 / ML) 아래 바이러스성로드와 개인의 genomes가 어렵습니다. 여기 우리는 안정적으로 0.3 복사 / ML에 HIV - 1 RNA를 측정하고 매우 낮은 바이러스성로드와 샘플에서 단일 게놈 시퀀싱에 의해 바이러스 genomes를 증폭하는 방법을 실시간 PCR 분석을 사용하여 플라즈마 바이러스 RNA를 추출하고 계량하는 방법에 대해 설명합니다.

표준 임상 Assays에 의해 탐지의 한도 이하 바이러스성로드와 HIV 감염된 개인의 확장 및 HIV - 1 RNA를 Quantifying

표준 분석법의 검출 한계 미만( ... 미만)의 바이러스 부하를 가진 HIV-1 감염자에서 바이러스 유전자의 증폭 및 HIV-1 RNA의 정량 분석

본 영상에서는 혈장 ml당 바이러스 수치가 50 copy 미만인 개체로부터 단일 HIV 게놈을 정량화하고 시퀀싱하는 방법을 시연합니다. 먼저, 7 ml의 혈장이 담긴 튜브를 원심 분리하여 펠렛화합니다. 그 후 바이러스 RNA를 추출하여 HIV 1의 수치를 정량화합니다.RNA를 역전사한 후, 표준물질 및 대조군과 함께 96-웰 플레이트에 로딩하여 정량적 실시간 PCR을 수행하는 단일 복제법(single copy assay)을 실시합니다. 그 다음 혈장 투입량을 바탕으로 바이러스혈증 수준을 계산합니다. 바이러스 집단을 특성화하기 위해 밀리리터당 최소 0.3 copies까지 검출할 수 있습니다.바이러스 RNA로부터 전사된 cDNA를 96-웰 플레이트에 분주하여 종점 희석(endpoint dilution)에 도달하게 하는 단일 게놈 시퀀싱 분석을 수행합니다. 그 후, 바이러스 게놈을 증폭시키기 위해 네스티드 PCR(nested PCR)을 수행합니다. 특정 샘플에 대해 PCR 반응의 30% 이하가 양성인 경우, 단일 사본의 cDNA가 증폭된 것으로 판단합니다.그 후 해당 샘플들을 시퀀싱하여 개별 바이러스 게놈의 뉴클레오타이드 서열을 밝힙니다. 이러한 기술의 높은 민감도 덕분에 표준 분석법으로는 HIV RNA를 검출할 수 없는 환자들의 상태를 모니터링하고 자연 제어 기전을 이해할 수 있습니다. 본 연구에서는 서로 다른 프라이머와 내부 표준물을 사용하여 HIV를 연구하기 위해 이 방법들을 사용하였으나, 동일한 방법을 다른 바이러스 연구에도 적용할 수 있습니다.일반적으로 이 방법은 대량의 혈장으로부터 바이러스를 분리하는 것이 어렵고, 위양성을 방지하기 위해 DNA가 없는 환경이 필요하므로 까다롭습니다. 환자의 혈장 샘플에서 RNA를 추출하여 이 절차를 시작하십시오. 7 mL의 혈장을 깨끗한 15 mL 튜브로 옮깁니다.단일 복제수 분석(single copy assay)을 위해 RNA를 추출해야 하는 경우, 이 단계에서 RCAs 바이러스 30,000 copies가 포함된 내부 비리온 대조군(internal virion control) 200 µL를 첨가합니다. 다음으로, RNA 정량 분석을 방해할 수 있는 지질 및 세포 파편을 제거하기 위해 혈장을 2,600 ×g에서 15분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리가 끝나면, 세포 파편이나 지질이 닿지 않도록 주의하며 내수성 마커를 사용하여 settin easy seal 원심 분리 튜브의 한쪽 면에 표시를 합니다. 피펫을 사용하여 혈장을 표시된 settin eae 튜브로 옮깁니다.그런 다음 투입된 혈장의 부피를 기록합니다. 나사산 넥 하단까지 튜브를 tris buffered saline으로 채웁니다. 기포가 없는지 확인하십시오.튜브의 캡을 닫습니다. 표시가 바깥쪽을 향하도록 샘플을 사전 냉각된 초원심분리기 로터에 배치합니다. 4 °C에서 170,000 ×g로 30분 동안 원심분리합니다.원심분리 후 펠렛(pellet)은 보이지 않을 것입니다. 상층액을 제거한 다음, 바이러스 펠렛에 분자 생물학 등급의 물 90 µL와 단백질 ACE K 10 µL를 추가합니다. 이어서, 튜브를 기울여 펠렛이 단백질 ACE K와 물 혼합액에 잠기도록 합니다.튜브를 55 °C 항온수조에 넣고 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 튜브를 짧게 원심분리하여 시료를 튜브 바닥으로 모읍니다. 그런 다음 20 mg/mL glycogen 10 µL와 6 M guanidinium thiocyanate 용액 315 µL를 첨가한 후 볼텍싱합니다.튜브의 내용물을 495 µL의 molecular grade isopropanol이 들어 있는 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮긴 후 10초 동안 볼텍싱합니다. 그다음 실온에서 21,000 ×g로 30분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한 뒤, 튜브에 500 µL의 70% ethanol을 넣고 10초 동안 볼텍싱하고 실온에서 21,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 대용량 전이 피펫을 사용하여 에탄올을 제거하고 다시 한번 스핀 다운하여 잔류 에탄올을 모두 제거한 후, 펠릿을 10분 동안 공기 건조합니다.단일 복제 분석(single copy assay)을 수행할 경우, 펠릿을 55 µL의 RNA buffer에 녹인 후 튜브를 얼음에 보관하십시오. 단일 게놈 시퀀싱을 수행할 경우에는 RNA를 pH 8.0의 40 µL tris hydrochloride에 녹이고, 튜브를 상온에 두어 단일 복제 분석을 수행하십시오.HIV one 및 RCAs 표준 곡선은 RNA 버퍼 내에서 HIV one 및 RCAs RNA 전사물을 하프 로그 연속 희석하여 준비합니다. 1.5 mL 튜브에 라벨을 붙인 후, 각 튜브에 54 µL의 RNA 버퍼를 첨가합니다. 그다음 HIV one은 10 µL당 0.3 RNA copy로, RCAs는 10 µL당 100 RNA copy로 희석합니다.각 희석 단계 사이마다 볼텍싱하여 혼합하십시오. 각 튜브에 54 µL의 RNA 버퍼를 첨가한 후, 첫 번째 튜브에 전사체 25 µL를 넣는 것으로 시작하십시오. 볼텍스 펄스 후 스핀 다운하고, 이를 다음 튜브로 순차적으로 옮기는 과정을 마지막으로 라벨링된 튜브까지 반복하십시오.희석액이 준비되면, cDNA 합성을 위해 역전사효소 또는 RT 칵테일을 혼합합니다. DNA로부터의 증폭을 제어하기 위한 8개의 역전사효소 미첨가(NRT) 대조군 반응을 포함하여, 총 96회의 RT-PCR 반응에 충분한 양을 제조합니다. 다음으로, 표준물질과 대조군을 포함한 8개의 환자 샘플을 담을 광학 96웰 플레이트를 준비합니다.NRT로 지정된 8개 웰에 NRT 반응 혼합물 20 µL를 넣고, 나머지 88개 웰에는 RT 반응 혼합물 20 µL를 넣습니다. 플레이트에 RT 및 NRT 혼합물을 추가한 후, 음성 대조군으로 표시된 웰에 물 10 µL를 넣습니다. 그다음, HIV로 표시된 웰에 동봉된 서면 프로토콜에 명시된 농도의 HIV 전사체 10 µL를 넣고, RCA로 표시된 2개 웰에도 동일하게 추가합니다.플레이트의 샘플로 표시된 인접한 3개 웰로 구성된 8개 세트에 원하는 농도의 RCA 전사물을 10 µL씩 첨가하고, 언급된 샘플을 10 µL씩 첨가합니다. 또한, NRT로 표시된 8개 웰과 내부 대조군(internal control)으로 표시된 웰에 이 샘플을 10 µL씩 첨가합니다. 완료 후 샘플 5 µL와 물 5 µL를 넣습니다.96웰 플레이트는 이 그림에 표시된 대로 구성합니다. 플레이트를 밀봉하고 서모사이클러(thermocycler)를 사용하여 다음과 같이 실행합니다: 25 °C에서 15분, 42 °C에서 40분, 85 °C에서 10분, 25 °C에서 30분 후 5 °C에서 유지합니다.cDNA가 합성되는 동안 HIV 및 RCA용 PCR 마스터 믹스를 준비하십시오. cDNA 합성이 완료되면, 플레이트를 cDNA 취급 전용 구역인 클린룸 외부로 옮기십시오.본 그림에서 녹색으로 표시된 각 웰에 QPCR용 H-I-V-P-C-R 마스터 믹스 20 µL를 첨가하십시오. 그런 다음 본 그림에서 회색으로 표시된 웰에 RCAs PCR 마스터 믹스 20 µL를 첨가하십시오. 원심분리를 위해 플레이트를 2,600 ×g에서 스핀하십시오.플레이트를 실시간 PCR 기기에 넣고 다음 조건으로 QPCR을 수행합니다: 95 °C에서 10분간 처리합니다. 그 후 95 °C에서 15초, 60 °C에서 1분씩 45 사이클을 반복합니다. 결과가 도출되면, 단일 게놈 시퀀싱을 수행하기 위해 RCA와 HIV에 대해 각각 별도의 분석이 필요합니다.pH 8.0의 tris hydrochloride에 부유된 RNA를 템플릿으로 사용하여 cDNA를 합성하는 것으로 시작합니다. 먼저 96-well PCR 플레이트에 10 mM dNTPs 5 µL, 2 mM 유전자 특이적 프라이머(pol 또는 en 중 하나) 5 µL, 그리고 추출된 RNA 40 µL를 혼합합니다. BioRad의 microseal-A film으로 플레이트를 밀봉합니다.그런 다음 반응물을 65 °C에서 10분 동안 배양하여 RNA 혼합물을 변성시킵니다. RNA가 변성되는 동안 RT 반응 혼합물을 조제하십시오.이는 단일 복제 분석(single copy assay)에 사용되는 것과 다른 RT 반응 혼합물임에 유의하십시오. 변성 단계 후에 PCR 플레이트를 얼음(ICE) 위에 놓아 RNA를 변성된 상태로 유지합니다. 그런 다음, 새로 제조한 RT 반응 혼합물 50 microliters를 각 시료에 첨가하고, 열 순환기(thermocycler)에서 45 degrees Celsius로 50분, 85 degrees Celsius로 10분, 그리고 4 degrees Celsius로 유지(hold)하는 설정으로 PCR 플레이트를 작동시킵니다.이 단계에서는 RNA가 cDNA로 역전사되는 동시에 cDNA가 합성됩니다. P6-RT 또는 envelope PCR 프라이머를 사용하여 PCR 반응 혼합물을 준비하십시오. 이는 단일 복제수 분석(single copy assay)에 사용되는 PCR 반응 혼합물과는 다르다는 점에 유의하십시오. 새로 준비한 96웰 PCR 플레이트의 73개 웰(샘플 70개 및 음성 대조군 3개 포함) 각각에 갓 제조한 PCR 반응 혼합물을 8.0 µL씩 분주합니다.CD NA 합성이 완료되면, 플레이트를 CD NA 취급을 위해 지정된 클린룸 외부 구역으로 옮깁니다. 다음으로, CD NA 샘플에 pH 8.0의 tris hydrochloride 40 µL를 첨가하여 최종 부피를 140 µL로 맞춥니다. 그 후, 70개의 웰 각각에 샘플 2.0 µL를 넣고, 음성 대조군 각각에 물 2.0 µL를 넣습니다. PCR 플레이트를 밀봉하고 여기에 표시된 프로그램을 사용하여 PCR을 수행합니다.다음으로, 함께 제공된 서면 지침에 따라 nested PCR을 수행하십시오. PCR이 끝나면 샘플을 1% agarose gel에서 전기영동하십시오. 결과를 확인하십시오.웰의 30% 이하가 양성인 경우, PCR 산물의 대부분은 단일 cDNA 분자의 결과입니다. 이 비디오에서 설명한 대로 단일 카피 분석을 수행했습니다. 이 그림은 일부 엘리트 컨트롤러의 qPCR 결과를 보여줍니다.여기서 볼 수 있듯이, 시료와 희석된 HIV 표준물질의 증폭 곡선이 정확하게 나타납니다. 동그라미로 표시된 7번 시료를 제외한 대부분의 시료에서 내부 비리온 표준물질의 회수량이 1500 copies 이상으로 확인되었습니다. 효율적인 RNA 추출을 확인시켜 주는 빨간색으로 강조된 결과는 3번 시료의 결과입니다.세 개의 웰 내 카피 수는 각각 0개, 1개, 0개였습니다. 주황색으로 표시된 NRT 대조군과 노란색으로 표시된 음성 대조군 모두 음성으로 나타나, 다른 샘플이나 DNA에 의한 오염으로 인해 증폭 결과가 왜곡되지 않았음을 확인했습니다. 양성 및 음성 대조군이 모두 통과함에 따라 이제 카피 수를 계산할 수 있습니다. 평균 카피 수 0.3에 계수 5.5를 곱하여 RNA 용출액 내의 총 카피 수를 구하면, 0.3 곱하기 5.5는 1.65가 됩니다. 이를 분석한 혈장의 총 부피인 7.3 milliliters로 나누면, HIV 1 RNA 수치는 ml당 0.2 copies가 됩니다.단일 게놈 시퀀싱 분석은 비디오에 설명된 대로 수행되었습니다. 이 그림은 연구 대상인 HIV-1 비억제자 중 한 명의 AROS 겔을 보여줍니다. 웰 H1과 H2의 음성 대조군은 모두 음성으로 나타났습니다.웰의 3분의 1 미만에서 증폭이 일어났으므로 이는 종말 희석(endpoint dilution)임을 보장하며, 이러한 증폭의 대부분은 단일 복제본의 CDNA로부터 기인합니다. SGS에서 얻은 서열의 정렬 결과가 여기에 표시되어 있습니다. 모호한 부위가 없으므로, 대량의 혈장으로부터 RNA 추출을 시도하는 동안 증폭이 단일 복제본의 CDNA로부터 이루어졌음을 보장합니다.분석법 개발 이후, 분석 효율을 저해할 수 있는 세포 및 지질을 제거하기 위해 사전 원심분리(pre spin)를 수행하는 것이 중요합니다. 이 기술은 표준 분석법의 검출 한계 미만인 바이러스 부하를 가진 다양한 환자군에서 바이러스 역학을 조사하는 데 사용되어 왔습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Provided는 열 순환기 또는 현미경 및 스테이지 히터를 사용하여 DNA 샘플의 초기 농도를 정량화하기 위한 실시간 재조합효소 중합효소 증폭 분석을 개발하기 위한 프로토콜입니다. 또한 내부 양성 대조군의 개발도 설명되어 있습니다. 원시 실시간 형광 데이터를 처리하기 위한 스크립트가 제공됩니다.

내부 양성 대조군과 양적 재조합 효소 중합 효소 증폭 분석 개발

우리는 여기에서 정량적 PCR에 의해 검출 된 전혈로부터 HIV 프로 바이러스 DNA의 단순하고 신속한 종이 기반의 DNA 추출 방법을 설명한다. 이 프로토콜의 다른 유전자 마커의 검출 또는 다른 증폭 방법을 이용하여 사용하기 위해 확장 될 수있다.

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

HIV-1 복제 주기의 통합 후 단계를 표적으로 하는 RNA 분자의 효능 및 독성을 평가하는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 방법은 새로운 분자를 스크리닝하고 기존 분자의 형식을 최적화하는 데 유용합니다.

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

설명한 quantitate 96 유전자의 표현 하는 방법론 이며 단일 셀 전 비보, 차동의 식별을 위해 허용 하 여 18 표면 단백질 유전자와 감염 되지 않은 세포에 상대적으로 바이러스에 감염 된 세포에 있는 단백질을 표현. 우리는 접근 연구 SIV에 감염 된 CD4+ T 적용 붉은 털 원숭이에서 분리 하는 세포.

단일 셀 정량 mRNA와 유인원 면역 결핍 바이러스에 감염 된 CD4에 표면 단백질 표정+ T 세포 격리에서 붉은 털 원숭이

전체 길이 개별 proviral 시퀀싱 (뒤집기) 증폭 및 단일 전체 길이 (손상 및 결함) HIV-1 proviruses 근처의 시퀀싱에 대 한 효율적이 고 높은 처리량 방법 제공 하 고 그들의 잠재력의 결정에 대 한 허용 복제-역량입니다. 튀기기 잠재 HIV-1 저수지 시퀀싱 하도록 분석 하는 이전 실험의 한계를 극복 한다.

다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭

반전 녹음 방송 (실시간 정량)와 함께 하는 실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응 분석은 RNA 바이러스 감염의 수준을 측정 하 널리 사용 되었습니다. 여기는 직접 실시간 정량 분석 결과, 뎅기열 바이러스를 포함 하 여 여러 RNA 바이러스의 정량화에 대 한 개발 하는 RNA 정화 단계를 필요 하지 않는 선물이.

실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응에 의해 감염 된 세포의 문화 상쾌한에 뎅 그 열 바이러스 RNA를 측정

여기 우리는 초기 3'-테르미니의 공평한 결정 뿐만 아니라 단일 가닥 DNA 분자의 mutational 프로필을 제공 하는 깊은 시퀀싱 방법을 제시. 주요 응용 프로그램은 초기 retroviral 보완 DNAs (cDNAs) retroviral 반전 녹음 방송 과정 중에 생성 된 중간체의 특성 이다.

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여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

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배우세요 저바이러스량 HIV-1 RNA 정량 및 단일 게놈 시퀀싱 방법을 통해 바이러스 역학을 연구하는 기법을. 실시간 PCR과 중심분리를 활용하여 0.3 copies/ml까지 검출 가능합니다.

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