Name: 10 나노 그램 총 RNA의 단일 읽기와 결합하여 최종 mRNA - Seq의 Illumina 도서관 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: 학습하세요 10ng 총 RNA로 Illumina mRNA-Seq 라이브러리를 제작하는 T7 선형 증폭 기법을 활용한 유전자 발현 분석 방법을. 소량 샘플에서도 전체 전사체 프로파일링이 가능합니다.

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이 작품은 연구와 위스콘신 재단의 대학 Morgridge 연구소의 자금 지원에 의해 지원되었다. 우리는 편집 지원 크리스타 이스트만 주셔서 감사합니다.

<ol><li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li>
<li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRT-seq+amplification-free%2C+strand-specific+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li>
<li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+consistent%2C+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li>
<li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li>
<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>mRNA-Seq-8 Sample Prep Kit [Internet]. , Illumina. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn">http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn</a> Forthcoming.</li>
<li>ScriptSeq mRNA-Seq Library Preparation Kit (Illumina -compatible) Epicentre [Internet]. , Epicenter. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epibio.com/item.asp?id=578">http://www.epibio.com/item.asp?id=578</a> Forthcoming.</li>
</ol>

저자는 잣은 세포 역학 국제 (CDI)의 설립자, stockowner, 컨설턴트 및 이사회의 구성원임을 공개. 그는 또한 과학 고문 역할과 전술 II의 줄기 세포 벤처 금융 이익 있습니다.

페어드 엔드(paired end) 라이브러리를 제작하기 위한 기존 프로토콜은 1 μg9에서 2.5 μg10 사이의 총 RNA 시작량이 필요합니다. 본 논문에서는 싱글 리드(single read) 및 페어드 엔드 Illumina 시퀀싱 라이브러리를 모두 준비할 수 있는 선형 T7 증폭 기반(T7LA) 방법을 제시하며, 이 방법을 통해 10 ng의 매우 적은 총 RNA로부터 라이브러리를 생성할 수 있고, 이것이 1000배 더 많은 시작 물질(10 μg 총 RNA)로 제작된 최소 증폭(MinAmp) 라이브러리와 대등한 데이터를 생성함을 보여줍니다. 10 ng 라이브러리는 유사한 총 유전자 수를 식별할 뿐만 아니라, 유사한 유전자 발현 시그니처를 생성합니다(그림 3a 및 b). 또한, T7LA 방법으로 제작된 싱글 리드 및 페어드 엔드 라이브러리는 서로 매우 유사하여(그림 3c), 연구자가 두 프로토콜 중 어느 것으로 제작된 라이브러리에서 생성된 데이터라도 서로 비교할 수 있게 합니다. 이 라이브러리들은 인간 배아 줄기 세포 RNA로부터 준비되었으므로, 라이브러리 내에서 30개의 줄기 세포 특이적 유전자를 검색하였으며, 그 결과 이들 유전자의 거의 대부분(93-100%)이 최소 10 ng의 시작 총 RNA로 제작된 라이브러리에 의해 식별됨을 확인하여(그림 4) 본 프로토콜을 검증하였습니다. 본 프로토콜은 특히 유세포 분석 정렬 세포(flow sorted cells)나 레이저 미세 절제 조직(laser-micro-dissected tissue)과 같이 시작 물질이 제한적인 상황에 처한 연구자들에게 매우 유용할 것으로 믿습니다. 이러한 상황에서 본 프로토콜은 시작 RNA의 양이 최소 3 자릿수(orders of magnitude) 차이 나더라도 대등한 발현 프로파일을 생성하므로, 훨씬 더 많은 시작 양으로 제작된 라이브러리와 비교 가능한 유전자 발현 데이터 생성을 가능하게 할 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 회사 </td><td> 키트 / 시약 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 특별 코멘트 </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> 파쇄 시약 </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> 라이너 아크릴 아미드 </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 키트 </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> 비 DEPC는 nuclease 무료로 물을 처리 </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP 세트 </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> methylated dNTPs </td><td> R0431 </td><td> 단일 읽기 샘플 준비에 대해서만 </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR 클러스터 생성 키트 V5 </td><td> GD - 203-5001 </td><td> 단일 읽기 샘플 준비에 대해서만 </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq 키트 V5 36주기 </td><td> FC - 104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> 칩 Seq 샘플 준비 키트 </td><td> IP - 102-1001 </td&gt; <td> 단일 읽기 샘플 준비에 대해서만. 코 DNA 샘플 준비 마스터 믹스로 교체할 수 있습니다 한 고양이 # E6040S 설정 </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE 클러스터 생성 키트 V5 </td><td> PE - 203-5001 </td><td> 이점 엔드 샘플 준비에 대해서만 </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> 이점 최종 샘플 준비 키트 </td><td> PE - 102-1001 </td><td> 이점 엔드 샘플 준비에 대해서만 </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1킬로바이트 플러스 사다리 </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. 대장균 Rnase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Rnase 아웃 </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 둘째 스트랜드 버퍼 5 배 </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. 대장균의 DNA 효소 </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E - 젤 SYBR 안전 2퍼센트 </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 윗첨자 III (5 배 FS 버퍼와 0.1M DTT 포함) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNA quibit 분석 키트 </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA HS qubit 분석 키트 </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. 대장균 DNA ligase </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> T4의 DNA 중합 효소 </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 울트라 퓨어 Dnase Rnase 물 </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 윗첨자 II 이중 좌초 cDNA 합성 키트 </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 임의 프라이머 (invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> 이점 엔드 샘플 준비에 대해서만 </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer B의 입문서 </td><td> N / A </td><td> 단일 읽어 샘ple 준비에만 </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo DT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 코 </td><td> Not1 소화 키트 </td><td> R0189S </td><td> 단일 읽기 샘플 준비에 대해서만 </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy Minelute 키트 </td><td> 74,204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNEasy 미니 키트 (50) </td><td> 74,104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> 겔 정화 키트 </td><td> 28,604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Dnase 세트 </td><td> 79,254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute 키트 </td><td> 74,204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo 연구 </td><td> DNA 깨끗하고 농축기 (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

10 나노 그램 총 rna의 단일 읽기와 결합하여 최종 mrna - seq의 illumina 도서관

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

mRNA - Seq하여 전체 transcriptome 배열은 현재 전세계 유전자 발현, 돌연변이, allele 특정 표현과 다른 게놈 차원의 분석을 수행하기 위해 광범위하게 사용됩니다. mRNA - Seq도 아닌 합성의 genomes의 유전자 발현 분석을위한 게이트가 열립니다. mRNA - Seq는 높은 감도, 넓은 동적 범위를 제공하고 샘플에 성적표 사본 번호를 측정하실 수 있습니다. Illumina의 게놈 분석기는 하나의 긴 읽기 궁극적으로 &quot;이점 엔드&quot;접근 방식이 모두의 끝에 합성 수 있습니다. 대형 상대적으로 짧은 시퀀스 번호 (&gt; 10 7) (&lt;150 BP) 읽기의 순서 수행 대체 스플 라이스 분기점을 추적 가능 , 삽입 및 삭제, 그리고 드 노보 transcriptome 조립하는 데 유용합니다. 연구자들이 직면한 주요 도전 과제 중 하나는 재료를 시작하는 제한된 금액을 말합니다. 예를 들어, 세포가 레이저 마이크로 해부 가능하여 수확 아르 실험 총 RNA m를 시작나노 그램의 대책을 불안. 이러한 샘플에서 mRNA - Seq 라이브러리의 준비는 1, 2를 설명하지만 편견을 소개 중대한 PCR 증폭을 포함하고 있습니다. 최소한의 PCR 증폭 다른 RNA - Seq 라이브러리 구축 절차 3, 4를 발표했지만 전체 RNA를 시작하는 마이크로 그램 금액을 요구했습니다. 여기 우리는 중요한 PCR 증폭을 피할 수 및 총 RNA의 10 나노 그램이 필요 도서관 준비 mRNA - Seq의 시퀀싱을위한 Illumina 게놈 분석기 II 플랫폼을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 그것이 상당한 증폭 바이어스를 도입하지 않고 방향 라이브러리를 제작 게재된 단일 엔드 시퀀싱 5, 이전에 설명한 및 검증되어 있지만, 여기서 우리는 이점 엔드 프로토콜로 사용하기 위해 추가로 그것을 확인합니다. 우리는 선택 &#39;T7 주장, T7 기반 Eberwine 선형 증폭 방법을 사용하여 총 RNA를 시작 polyadenylated 메신저 RNAs를 증폭라 &quot;(T7 선형 증폭). 증폭 폴리 - A mRNAs이 조각되어 최종 시퀀싱 라이브러리를 생성하는 출혈도 잡았 베꼈는데와 어댑터 역방향. 모두 하나의 읽기 및 이점 최종 실행을 위해, 시퀀스는 인간의 transcriptome 6 매핑하고되도록 정규화 여러 실행에서 데이터를 비교할 수 있습니다. 우리는 샘플 7 비교하면 RPKM에 뛰어난 측정합니다 만명 당 성적 단위로 유전자 발현 측정 (TPM)를보고합니다.

여기 T7 RNA 선형 증폭을 기반으로 유전자 발현 분석을 위해 모두 하나의 읽기 및 이점 엔드 Illumina mRNA - Seq 시퀀싱 라이브러리의 준비를위한 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 총 RNA를 시작하는 10 나노 그램이 필요하고 전체 성적표를 나타내는 매우 일관된 라이브러리를 생성합니다.

10 나노 그램 총 RNA의 단일 읽기와 결합하여 최종 mRNA - Seq의 Illumina 도서관

mRNA-Seq을 이용한 전전사체 시퀀싱(Whole transcriptome sequencing)은 현재 전역적 유전자 발현, 돌연변이, 대립유전자 특이적 발현 및 기타...를 분석하는 데 광범위하게 사용되고 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 소량의 시작 물질로부터 Illumina mRNA 서열 라이브러리를 생성하는 것입니다. 절차의 첫 번째 단계는 total RNA를 DTT seven 프라이머로 역전사하여 cDNA를 생성하는 것입니다. 이 cDNA는 인비트로 전사(in vitro transcription)를 통한 RNA 증폭에 사용됩니다. 이어서, 증폭된 RNA를 무작위 단편화(random fragmentation)합니다.단편화된 RNA를 역전사하여 cDNA를 생성하며, 이는 어댑터 결합, 크기 선택 및 PCR 증폭 과정을 거칩니다. 최종적으로, 이 프로토콜은 유전자 복제 수를 측정하여 시료의 유전자 발현 프로파일을 보여줍니다. 이 기술의 주요 장점은 시작 물질로 단 10 nanograms의 총 RNA만 필요하다는 점입니다.이는 다른 기존 프로토콜에서 요구되는 양보다 수십 배 더 적은 양입니다. 더욱이, 이 방법은 이렇게 적은 양의 초기 RNA로부터 페어드-엔드(paired-end) 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 이러한 방법은 레이저 캡처 미세 절제(laser capture microdissection)나 유세포 분석(flow cytometry)을 통해 얻은 세포군과 같이 확보하기 어려운 세포군으로부터 유전자 발현 프로파일을 결정할 수 있게 함으로써, 과학자들이 생물학의 새로운 질문들을 탐구할 수 있도록 해줄 것입니다.우리는 인간 양막 줄기세포에서 분화된 매우 적은 수의 세포로부터 유전자 발현 프로파일을 분석해야 했을 때 이 방법을 개발하게 되었습니다. RNA 양이 매우 적어 쉽게 분해될 수 있으므로, RNA 처리 단계는 습득하기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 실험 절차의 시연은 제 실험실의 Angela Elwell, Jennifer Bolen, Baal Kimm Wynn이 진행하겠습니다.싱글 리드(single read) 및 페어드 엔드(paired end) 시퀀싱 라이브러리를 병렬로 준비하는 방법은 이 흐름도에 표시된 것과 같이 다단계 절차로 이루어집니다. 먼저, 관심 있는 세포 또는 조직에서 총 RNA를 분리하여 이중 가닥 cDNA를 준비합니다. 그 후 T7 기반의 ewin 선형 증폭법을 사용하여 cDNA로부터 폴리아데닐화된 메신저 RNA를 선택적으로 증폭합니다. 다음으로, 증폭된 poly A를 무작위로 단편화합니다.분절된 RNA를 정제한 후, 이를 cDNA로 역전사합니다. cDNA의 말단을 수선하고 DNA 분절의 3' 말단에 A 염기를 추가합니다. 그 후, DNA에 어댑터를 결합하고 NotI 제한효소로 절단합니다. 싱글 리드 라이브러리(single Reed Library)의 경우, 겔 정제를 통해 DNA 라이브러리를 분리한 다음 PCR로 증폭하여 Illumina 어댑터를 결합합니다.마지막으로, DNA 라이브러리의 정량이 완료되면 시퀀싱을 진행할 준비가 됩니다. 본 영상에서는 이 프로토콜 내의 선택된 절차들만 시연하겠습니다. 단편화된 polyA mRNA의 cDNA로의 역전사는 1차 가닥 및 2차 가닥 합성을 포함합니다.싱글 리드 라이브러리를 위한 1차 가닥 합성을 위해, PCR 튜브에 다음 시약들을 첨가하십시오. 조각난 poly mRNA 10 µL와 Not1 랜덤 nonamer 프라이머 1 µL를 넣습니다. Not1 nonamer 프라이머의 서열은 여기에 표시되어 있습니다. 녹색으로 표시된 5' 말단 근접 서열이 Not1 제한효소 인식 부위입니다.파란색으로 표시된 서열은 chip sequence kit의 illumina adapter B 서열의 역상보 서열입니다. 혼합물을 thermocycler에서 70 °C로 5분 동안 배양한 후 즉시 얼음 위에서 냉각하십시오. 혼합물을 얼음 위에 유지하면서 superscript three kit의 시약인 5 x first strand buffer 4 µL, DTT 2 µL, DNTP mixture 1.5 µL를 첨가하십시오. DNTP mixture에서는 DCTP 대신 5-methyl-dCTP를 사용하십시오. 튜브를 thermocycler에 넣고 42 °C에서 2분 동안 유지한 다음, superscript three reverse transcriptase 1 µL를 첨가하고 42 °C에서 1시간 동안 배양하십시오.다음으로, para 말단 라이브러리의 1차 가닥 합성을 위한 반응을 준비합니다. PCR 튜브에 10 µL의 분절된 poly NNA와 1 µL의 random hexamer primer를 첨가합니다. 서모사이클러에서 65 °C로 5분 동안 배양한 후, 즉시 얼음 위에서 냉각시킵니다.튜브를 얼음 위에 둔 상태에서, superscript three First strand kit의 다음 시약들을 첨가합니다: 5x first strand buffer 4 µL, DTT 2 µL 및 DN NTPs 1.5 L. 서모사이클러(thermocycler)에서 45 °C로 1분간 반응시킵니다. 그 후 superscript three, reverse transcriptase 1 µL를 첨가하고 45 °C에서 1시간 동안 반응시킵니다.두 반응 모두 2차 가닥 합성을 위한 준비가 완료되었습니다. 얼음 위에서 각 혼합물에 superscript two 키트의 다음 시약들을 추가합니다: free water 91 µL, 5x second strand buffer 30 µL, DN NTPs 3 µL, e coli DNA Ligase 1 µL, e coli DNA polymerase 4 µL 및 E coli RNase H 1 µL. 각 튜브를 뒤집어 섞은 다음, 짧게 원심 분리하고 16 °C에서 2시간 동안 배양합니다.싱글 리드 라이브러리(single read library)를 위한 cDNA의 말단 수선(end repair)을 위해, 40 µL의 정제된 cDNA에 다음과 같은 시약들을 첨가합니다: 10 mM ATP가 포함된 T4 DNA ligase 버퍼 5 µL, dNTP Mix 2 µL, T4 DNA polymerase 1 µL, Klenow enzyme 1 µL, 그리고 T4 PNK 1 µL. 페어드 엔드 라이브러리(paired end library)의 경우, 30 µL의 정제된 cDNA에 RNase-free water 45 µL를 첨가합니다.10 mM ATP가 포함된 T4 DNA ligase 버퍼 10 µL, 10 mM dNTP 믹스 4 µL, T4 DNA polymerase 5 µL, Klenow 효소 1 µL 및 T4 PNK 5 µL를 넣습니다. 말단 수선(end repair) 후, 두 튜브를 써모사이클러(thermocycler)에서 20 °C로 30분 동안 배양합니다.이 프로토콜의 다음 단계는 싱글 리드 라이브러리를 위해 DNA 단편의 3' 말단에 아데닌 염기를 추가하는 것입니다. DNA 샘플 34 µL, klino 버퍼 5 µL, DATP 10 µL 및 klino exo 1 µL를 혼합하여 반응액을 준비하십시오. 페어드 엔드 라이브러리의 경우, DNA 샘플 32 µL와 clin out 버퍼 5 µL를 혼합하여 반응액을 준비하십시오.10 µL의 DATP와 3 µL의 clin out exo를 넣고, 어댑터 결합(adapter ligation) 반응을 설정하기 전 두 반응 혼합물을 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 어댑터를 얼음 위에서 해동하고, 싱글 리드 라이브러리(single read library)를 위해 1:20 비율로 희석합니다. Illumina chip sequence sample prep kit를 사용하여 10 µL의 DNA 샘플, 1 µL의 어댑터 올리고 믹스(adapter oligo mix), 15 µL의 2X DNA Ligase 버퍼, 4 µL의 DNA Ligase가 포함된 반응 혼합물을 준비하고 15분 동안 배양합니다.상온에서 paired end 라이브러리를 위해, Illumina paired end sample prep kit를 사용하여 다음과 같이 반응물을 준비합니다. DNA 샘플 10 µL, PE adapter oligo mix 10 µL, 2X DNA ligase buffer 25 µL 및 DNA Ligase 5 µL를 혼합하고 20 °C에서 15분 동안 배양합니다. 각 배양이 완료되면 XMO 컬럼을 사용하여 두 ligation 반응물을 정제합니다.싱글 리드 라이브러리는 44 µL의 물로 용출하고, 페어드 엔드 라이브러리는 6 µL의 elution buffer로 용출한 후, 다시 5 µL의 eb로 추가 용출합니다. 싱글 리드 라이브러리에 대해서만 Not1 제한효소 소화를 수행합니다. 37 °C에서 2시간부터 하룻밤 동안 반응시킨 후, ZY IMO 컬럼을 사용하여 반응물을 정제합니다.6 µL의 buffer eb를 사용하여 싱글 리드 라이브러리를 용출시킨 후, 5 µL의 eb로 2차 희석합니다. 어댑터가 연결된 두 라이브러리의 DNA는 이제 크기 선택(size selection)을 할 준비가 되었습니다. 어댑터가 연결된 DNA의 크기 선택 과정은 Vitrogen 사의 2% cyber safe EE를 사용하여 수행하며, 이 과정을 시작하기 위해 program zero pre-run을 2분 동안 실행합니다.프리런(pre-run) 후, 1 KB plus 래더와 2D NA 시료를 10 µL씩 로딩하십시오. 빈 레인에는 10 µL의 증류수를 채운 뒤, One egel 2% 프로그램을 사용하여 28분 동안 전기영동을 수행하십시오.전기영동이 완료되면 새 면도날을 사용하여 200에서 300 base pair 범위의 겔 슬라이스를 선택합니다. 다양한 라이브러리를 통해 확인된 유전자의 수를 평가하였으며, 이 표는 클러스터 수에 대한 정보를 보여줍니다. 단일 리드 및 페어드 엔드 라이브러리 모두에 대하여 확인된 유전자의 오류율과 단일 리드 및 페어드 엔드 라이브러리의 정렬 백분율을 나타냅니다.10 ng T7 LA 라이브러리는 TPM이 10 이상인 10 µg 비증폭 라이브러리와 거의 동일한 수의 유전자를 식별했습니다. 단일 리드 라이브러리의 경우, 10 ng T7 LA 라이브러리는 패러다임 라이브러리에 대해 10 µg 비증폭 라이브러리가 식별한 8,500개 유전자의 100%를 식별했습니다. 10 ng T7 LA 라이브러리는 10 µg 비증폭 라이브러리가 식별한 유전자의 86%를 식별했습니다.10 ng 미만으로 제작된 라이브러리는 가능한 많은 유전자를 식별하지 못했습니다. 예를 들어, 단일 리드 프로토콜에서 1 ng T seven LA 라이브러리는 10 µg min amp 라이브러리로 식별된 유전자의 약 50%만을 식별했습니다. 따라서 T seven LA 프로토콜에 사용할 총 RNA의 최소량은 housekeeping 유전자의 매핑을 위해 10 ng으로 제한해야 합니다.GA DH는 최소 10 nanograms의 시작 RNA로 제작된 모든 T seven LA 라이브러리가 극단적인 5' 엑손을 포함한 모든 엑손을 식별했음을 보여줍니다. 단일 리드 라이브러리에 대한 왼쪽의 스케일 바는 총 350회의 리드를 나타냅니다. DEN 라이브러리에 대한 중앙의 스케일 바는 총 5,000회의 리드를 나타냅니다.10 ng T7 LA 싱글 리드 및 페어드 엔드 라이브러리를 min amp 라이브러리와 비교한 결과 높은 유사성이 나타났습니다. 10 ng T7 LA 싱글 리드 라이브러리와 10 µg min amp 라이브러리 간의 Spearman 상관계수는 0.90이었으며, PEREN 10 ng T7 LA 라이브러리와 10 µg min amp 라이브러리 간의 상관계수는 0.95였습니다. 또한, 10 ng 총 RNA로 제작한 두 가지 싱글 리드 및 PEREN 라이브러리를 비교하였으며, 매우 높은 상관계수를 통해 T7 LA 프로토콜을 사용하여 제작된 두 유형의 라이브러리가 매우 유사한 유전자 발현 시그니처를 생성한다는 것을 확인하였습니다.마지막으로, 이 라이브러리들은 인간 배아 줄기세포 RNA 30개 줄기세포로부터 제작되었으므로, 라이브러리 내에서 특정 유전자들을 검색하였습니다. 이러한 유전자들 대부분이 최소 10 nanograms의 초기 총 RNA로 제작된 라이브러리에서 확인되었으며, 이를 통해 본 프로토콜이 검증되었습니다. 이 프로토콜을 수행하는 동안, 분해를 방지하기 위해 소량의 RNA 샘플을 매우 주의 깊게 다루는 것이 중요합니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 매우 적은 양의 출발 물질로부터 Illumina, Mr.Aeq single read 및 Paradigm 라이브러리를 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

single-read-paired-end-mrna-seq-illumina-libraries-from-10-nanograms

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

MicroRNA(miRNA)는 널리 보존된 조절 분자 부류입니다. 여기에서는 두 가지 강력한 ligation 단계와 high-throughput sequencing에 의존하는 miRNA 클로닝 방법에 대해 설명합니다. 당사의 방법은 miRNA의 정확한 게놈 전체 정량을 가능하게 합니다.

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

이 프로토콜에서는 작은 RNA 도서관 건설 및 다음 세대 시퀀싱에 대 한 세포 배양에서 세포 외 microRNAs 정화 하는 방법을 보여 줍니다. 다양 한 품질 관리 검사점 작업 exRNAs 같은 낮은 입력된 샘플을 할 때 기대 하는 것을 이해 하는 독자 수 있도록 기술 된다.

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

나노 기 공 시퀀싱은 원격 지에서 비용 효과적인 시퀀싱을 허용 하는 새로운 기술 이며 리소스 부족 설정입니다. 여기서, 우리는 이러한 조건과 호환 되는 전 혈에서 mRNAs의 시퀀싱을 위한 프로토콜을 제시 한다.

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

우리는 표준 방법 보다는 더 적은 편견을 가진 상세한 작은 RNA 라이브러리 배상 프로토콜 및 2'-O-메틸 RNA를 위한 증가한 감도를 제시합니다. 이 프로토콜은 비용을 절감하기 위해 수제 시약을 사용하거나 편의를 위해 키트를 사용하여 따를 수 있습니다.

작은 RNA-seq 개선: 2'-O-메틸 RNA의 더 적은 편견 및 더 나은 검출

우리는 초기 마우스 배아에 있는 microRNAs를 프로파일링하기 위한 기술을 기술합니다. 이 프로토콜은 낮은 세포 입력 및 작은 RNA 농축의 도전을 극복합니다. 이 분석은 초기 마우스 배아의 상이한 세포 계보에서 시간이 지남에 따라 miRNA 발현의 변화를 분석하기 위하여 이용될 수 있다.

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

여기에서 우리는 박테리아에 있는 RIBO-seq를 위한 견본 수집 및 준비의 단계를 기술합니다. 이러한 지침에 따라 준비된 라이브러리의 시퀀싱은 포괄적인 생물정보 분석을 위한 충분한 데이터를 생성합니다. 우리가 제시하는 프로토콜은 간단하고 표준 실험실 장비를 사용하며 리시스에서 라이브러리 획득까지 7 일이 걸립니다.

박테리아의 RIBO-seq: NGS 시퀀싱을 위한 샘플 수집 및 라이브러리 준비 프로토콜

절대 정량 RNA 염기서열분석(AQRNA-seq)은 생물학적 혼합물에서 모든 소형 RNA의 환경을 정량화하기 위해 개발된 기술입니다. 여기에서는 AQRNA-seq의 라이브러리 준비 및 데이터 처리 단계를 모두 시연하여 기아 유발 휴면 기간 동안 Mycobacterium bovis BCG의 전달 RNA(tRNA) 풀의 변화를 정량화합니다.

small RNA 정량을 위한 AQRNA-seq

Metagenomic 도서관 대규모 화면

바이오 - 래드 총 RNA 키트를 사용 Neuroprecursor 셀에서 RNA 추출

학습하세요 10ng 총 RNA로 Illumina mRNA-Seq 라이브러리를 제작하는 T7 선형 증폭 기법을 활용한 유전자 발현 분석 방법을. 소량 샘플에서도 전체 전사체 프로파일링이 가능합니다.

10 나노 그램 총 RNA의 단일 읽기와 결합하여 최종 mRNA - Seq의 Illumina 도서관

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