고체 Nanopores와 모니터링 단백질 흡착

이 절차의 전반적인 목적은 단백질 흡착 연구에 사용할 인공 막에 나노공(nanopores)을 생성하는 것입니다. 이는 스템(stem)을 사용하여 질화물 막에 나노공을 뚫음으로써 수행됩니다. 그 후, 나노공을 챔버에 장착하고 이온 용액으로 습윤시킵니다.

유체가 나노포어의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝까지 연결되어 브리지를 형성함으로써 나노포어가 실험 준비 상태가 됩니다. 여기에 전압을 가하면 이온 전류가 통과하는 것을 관찰할 수 있습니다. 마지막 단계는 나노포어 챔버에 단백질을 첨가하는 것입니다.

최종적으로 나노포어를 가로지르는 이온 전류에서 장시간 지속되는 블로케이드(blockade)가 관찰되는 것은 단백질이 나노포어의 측면에 흡착되었음을 나타냅니다. 안녕하세요, 저는 시라큐스 대학교 물리학과 대학원생 데이브 위키(Dave Wicki)입니다.

이 방법은 무기 표면에서의 단백질 흡착에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 단백질-핵산 상호작용, 단분자 분광학 및 제한된 공간 내의 분자 연구와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 먼저 스템(stem)의 가속 전압을 올리는 것으로 시작하십시오.

다음으로, SPI silicon nitride 윈도우 그리드를 TEM 샘플 홀더에 장착합니다. 잔해물을 제거하기 위해 산소 플라스마로 30초 동안 그리드를 세척합니다. 샘플을 장착하기 전, 샘플 홀더를 TEM에 넣고 진공 펌프가 작동하여 내부 압력이 낮아질 때까지 기다립니다.

명시야(brightfield) TEM 모드를 사용하여 로우 프로그램(raw program) 상의 밝은 정사각형 영역인 질화물 윈도우(nitride window)를 찾으십시오. TEM이 적절하게 정렬되었는지 확인하십시오. 그 다음 샘플을 정렬하고 초점을 맞추십시오.

이제 시스템을 STEM 모드로 설정하고 hot off 검출기를 사용하여 시료를 이미지화하고 정렬 상태를 확인하십시오. 모노크로메이터(monochromator)가 있는 경우, 드릴링에 사용할 수 있는 전자빔 전류를 높이기 위해 낮은 값으로 설정하십시오. 전자 프로브의 직경에 따라 나노포어(Nanopore)를 드릴링하는 데 적합한 스팟 크기(spot size)를 선택하십시오.

스템을 정렬한 상태에서 BROGRAM을 사용하여 필요한 배율로 질화물 막(nitride membrane)에 정확하게 초점을 맞춥니다. 시료의 움직임이 있을 경우, 전자빔을 차단(blank)하고 시료가 안정될 때까지 기다립니다.

이 과정은 최대 1시간이 소요될 수 있습니다. 안정화가 되면 전자 프로브를 샘플 위에 배치하고 나노포어 드릴링을 시작합니다. TM으로 나노포어를 드릴링하려면 인내심 있는 정밀함이 필요합니다.

이는 전자빔 프로브 아래에서 질화물이 점진적으로 소실되는 과정입니다. 전자 프로브를 드릴링 부위 바로 위에 유지하고 나노공이 완전히 드릴링되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 샘플을 TEM에서 제거하기 전에, hot off 검출기로 스캔하여 주기적으로 샘플을 확인하십시오.

시편이 약간 밀려난 경우, 전자 프로브의 위치를 나노포어 위로 조정하십시오. ROI 그램에 초점이 맞으면, 일렁이는 질화물 박막이 사라집니다. 초점이 맞지 않은 상태에서 나노포어가 형성되면, 닳은 손톱 모양의 테두리가 보입니다.

히터를 끈 상태에서 나노공을 이미지화하고 이미지의 강도 프로파일을 작성하십시오. 나노공의 직경은 프로파일에서 가장 어두운 영역을 통해 추정할 수 있습니다. 필요한 경우 전자 프로브를 사용하여 나노공을 확장할 수 있습니다.

요구되는 직경에 도달하면, 모노크로메이터를 표준 설정으로 두고 TEM 모드로 전환하십시오. 명시야 TEM을 사용하여 기공 크기를 확인하십시오.

먼저 탈기된 식염수를 준비합니다. 용액을 진공 상태의 소니케이션 배스에 넣고 20분 동안 처리합니다. 실리콘 질화물이 포함된 취약한 나노포어 칩을 10밀리리터 Pyrex 비커에 조심스럽게 넣습니다. 그런 다음 흄 후드 내의 핫플레이트 위에 비커를 올립니다.

피라냐 용액을 사용하여 Nanopore 칩을 매우 주의 깊게 세척합니다. 먼저, 유리 피펫을 사용하여 용기에 황산 3 mL를 넣습니다. 그 다음, 황산에 고농도 과산화수소 1 mL를 조심스럽게 첨가합니다.

모든 예방 조치를 취하십시오. 나노포어 칩을 10분 동안 담가 둡니다. 그 다음 유리 피펫을 사용하여 비커에서 피라냐 용액을 제거하고 적절하게 폐기하십시오.

다음으로, 비커에 탈기된 탈이온수를 채웁니다. 깨끗한 유리 피펫을 사용하여 비커의 물을 비우고, 이 세척 과정을 최소 5회 반복합니다. 깨끗한 핀셋으로 나노포어 칩을 꺼내어 가벼운 흡입으로 건조시킵니다.

건조되면 즉시 나노포어 칩을 챔버 안에 밀봉합니다. 칩은 O-링이나 실리콘 밀봉제로 챔버에 고정할 수 있습니다. 챔버를 염화칼륨 용액으로 채웁니다.

은/염화은(silver/silver chloride) 전극을 챔버에 연결합니다. 전극은 은선을 표백제에 하룻밤 동안 담가서 제작할 수 있습니다. 전극 사이에 막 전위(transmembrane potential)를 인가하고 패치 클램프 증폭기(patch clamp amplifier)를 사용하여 전류 반응을 모니터링합니다.

전압 클램프 모드에서, 측정값을 통해 전류-전압 곡선을 작성합니다. 곡선은 매우 선형적이어야 합니다. 1 M potassium chloride를 사용할 때, 나노포어의 전도도는 그 직경에 상응해야 합니다.

나노포어가 선형 IV 곡선을 나타내지 않는 경우, 전도도가 너무 낮거나 나노포어의 오픈 전류(open current)가 안정적이지 않은 것입니다. 이는 나노포어가 제대로 접합되지 않았음을 나타내며, piha 세척 과정을 반복해야 합니다. 나노포어 내부에 유체가 채워져 있는지 확인하는 것이 필수적입니다.

이 단계가 제대로 수행되지 않으면 나노포어를 통한 이온 전류에 매우 큰 노이즈가 발생하며, 나노포어 내로의 단백질 분배가 급격히 감소하게 됩니다. 먼저 정제된 목적 단백질 샘플을 챔버의 접지조(grounded bath)에 첨가하십시오. 샘플이 충분히 확산될 때까지 기다립니다.

연구 대상 단백질의 전체 전하와 반대 극성의 막전위 전압 바이어스를 인가하십시오. 200 millivolts의 인가 전압이면 관찰하기에 충분할 것입니다. 대부분의 단백질 분석물 이벤트는 기선으로부터 일시적인 전류 편향으로 나타납니다.

신호가 관찰되지 않는 경우, 챔버 내 단백질 농도를 높이십시오. 전압을 높이면 신호 대 잡음비와 나이트라이드가 개선됩니다. 나노포어는 수 볼트의 전압을 견딜 수 있습니다.

단백질 흡착은 나노포어의 기저 전류에서 지속적인 변화로 나타납니다. 고체 상태 나노포어의 일반적인 결과는 다음과 같습니다. 개방된 포어의 전류는 매우 안정적이어야 합니다.

나노포어의 IV 특성은 매우 선형적이어야 합니다. 1 M 염화칼륨과 10 M 인산칼륨 pH 7.4 용액에서 IV 곡선의 선형 피팅 기울기는 나노포어의 단일 전도도를 제공합니다. 전도도는 나노포어 직경과 직접적인 관계가 있으며 해당 방정식과 일치해야 합니다.

이 값은 30% 이내로 일치해야 합니다. 값이 너무 작으면 단백질 첨가 시 기공이 결합되지 않았을 가능성이 큽니다. 단백질 흡착은 지속적인 전류 감소로 나타나며, 이후 빠른 이벤트들이 이어져야 합니다. 일부 단백질은 매우 불안정하여 기공 내부에서 구조적 변형을 일으킵니다.

이 경우, 장시간 지속되는 전압 강하와 함께 급격한 변동이 동반될 것입니다. 이 영상을 시청한 후에는 주사 투과 전자 현미경을 사용하여 고체 상태 나노포어를 제조하고, 이를 사용하여 SA 단백질 흡착을 구현하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 피라냐 용액을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행할 때는 항상 흄 후드 내에서 장갑, 실험복 및 화학용 앞치마를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.