Name: 고체 Nanopores와 모니터링 단백질 흡착 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 배우세요 실리콘 나이트라이드 막에 고체 나노포어를 제작하고 저항성 펄스 기법으로 단백질 흡착을 실시간 모니터링하는 방법을. 단일 분자 수준에서 단백질-표면 상호작용을 연구하는 라벨 프리 플랫폼을 제공합니다.

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저자들은 조언 존 Grazul (코넬 대학), 안드레 Marziali (밴쿠버에서 브리티시 컬럼비아 대학)와 빈센트 토바드 - Cossa을 (오타와 대학) 감사드립니다. 이 작품은 미국 국립 과학 재단 (DMR - 0706517와 DMR - 1006332)와 국립 보건원 (R01 - GM088403)에서 부여로 일부 자금이다. 재료 연구 과학 및 공학 센터 (MRSEC) 프로그램 (DMR 0520404) - nanopore 드릴링은 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 지원으로 재료 연구 코넬 센터 (CCMR)의 전자 현미경 시설에서 수행되었다. 실리콘 질화물 점막의 준비는 국립 과학 재단 (부여 항법 - 0335765)에서 지원하는 코넬 NanoScale 시설, 국립 나노기술 인프라 네트워크의 일원에서 실시되었습니다.

1. 실리콘 질화물 점막에서 고체 nanopores의 제조 <ol><li> 200 kV의 가속 전압에 황비홍 Tecnai F20 S / TEM을 가져와. 다른 S / TEM을 사용하는 경우, 가속 전압보다 크거나 200 kV 9이어야합니다 </li><li> TEM 샘플 홀더에 20 nm의 두꺼운 SPI 실리콘 질화물 창 그리드를로드하고 소유자로부터 오염 물질을 제거하는 30 초 동안 산소 플라즈마로 닦아주십시오. </li><li> S / TEM에 샘플을로드하고 아래 펌프로 진공을위한 수 있습니다. S / TEM 진공로 펌핑되면 Ronchigram에서 밝은 사각형를 찾아 밝은 필드 TEM 모드에서 질화 윈도우를 찾으십시오. TEM이 제대로 정렬되어 있는지 확인 후, 정렬 및 샘플을 중점을두고 있습니다. </li><li> 줄기 모드로 S / TEM을 전환합니다. 이미지 샘플를 HAADF (또는 이에 상응하는 금액) 검출기를 사용하여 제대로 정렬되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 낮은 값을 단색을 설정합니다. 단색의 낮은 가치 높은 curren를 허용시추에 사용할 전자 t. S / TEM은 단색이없는 경우이 단계를 무시합니다. </li><li> nanopore를 시추에 적합한 장소 크기를 선택합니다. 이것은 전자 프로브의 직경에 해당합니다. 3 NM 프로브는 5 나노미터 직경 모공을 시추를 위해 잘 작동합니다. 큰 프로브 (5 NM)은 더 빨리 드릴과 큰 기공이 생성됩니다. 작은 프로브 (1 NM)은 작은 구멍을 뚫을하고 만드는 데 시간이 오래 걸립니다. </li><li> 필요한 경우, 줄기 정렬을 조정하십시오. </li><li> 질화 막에 초점 x1.3M의 확대로 가져와. 좋은 초점은 Ronchigram을 모니터링하여 수행할 수 있습니다. </li><li> 샘플의 움직임이있다면, 안정화 샘플 때까지 기다립니다. 이것은 시간까지 걸릴 수 있습니다. 질화물을 손상하지 않는만큼 기다리는 동안 전자 빔을 빈. </li><li> 샘플 전자 프로브를 장소와 드릴을 시작합니다. </li><li> 주기적으로 HAADF 감지기로 스캔하여 샘플을 확인, 모두 nanopore이 dri를 받고 있는지 확인하기 위해lled (그것은 어두운 장소처럼 보이게합니다) 및 샘플에 대한 움직임이 없다는 것을 확인하십시오. 샘플이 약간 나타난다면, nanopore 이상이어야하는 전자 프로브의 위치를​​ 조정합니다. </li><li> 기공이 형성되었을 때 식별할 수 Ronchigram 조심하세요. 때 초점, 질화물 필름은 반짝 이는 외관을하고 있습니다. 이 때 nanopore 양식을 사라집니다. 초점이 약간 Ronchigram을 주는게 하나가 nanopore과 관련된 프레 넬 무늬를 볼 수 있습니다. </li><li> HAADF와 nanopore의 이미지를 가져가라. </li><li> nanopore 이미지의 강도 프로파일을 마십시오. nanopore의 직경은 프로필의 어두운 지역에 따라 예상하실 수 있습니다. </li><li> nanopore의 확대는 구멍의 가장자리를 따라 전자 프로브를 이동하여 수행할 수 있습니다. </li><li> nanopore 원하는 직경되면, TEM 모드로 S / TEM을 넣어. </li><li> 크기를 확인 밝은 필드 TEM을 사용하여 자사의 표준 설정 및 이미지 nanopore에 단색 가져와 <strong&gt; (그림 1). </li></ol> 2. 고체 nanopore의 젖음 <ol><li> 1 M KCl, 10 MM의 칼륨 인산, 산도 7.4를 포함하는 데 가스 드 이온화 물. 이것은 진공에서 솔루션을 가하고 20 분 동안 목욕 sonicator에서 그들을 배치하여이 작업을 수행할 수 있습니다. </li><li> 10 ML Pyrex의 비커에 nanopore 포함된 실리콘 질화물 칩을 놓습니다. 매우 섬세으로 질화물 창문을 깨지 않도록주의를 가져가라. 연기 후드의 열판에서 비커를 놓고 100 ° C.로 설정 </li><li> 좋은 치료를 사용하여 피라 솔루션 nanopore 칩을를 청소합니다. 먼저 유리 피펫을 사용하여 컨테이너 3 ML의 황산을 추가합니다. 다음, 신중하게 피라 솔루션 14하도록 황산 1 ML의 과산화수소를 추가합니다. 모든 예방 조치를하시기 바랍니다. </li><li> nanopore 칩이 10 분 피라 솔루션에 흠뻑 젖어 수 있습니다. </li><li> 유리 피펫을 사용하여 비커에서 피라 솔루션을 제거합니다. 적절한 스토리지 콘센트에 놓으십시오. </li><li> Fi 인터넷 접속깨끗한 유리 피펫을 사용하여 드 - 기름, 드 이온화 물로 비커는거야. 빈 비커의 물을 최소한 5 번 반복합니다. </li><li> 깨끗한 핀셋으로 nanopore 칩을 제거하고 빛을 흡입하여 건조 </li><li> 즉시, 챔버 (그림 2A, 2B)로 nanopore 칩을 밀봉. 칩은 O - 링이나 실리콘 밀봉제하여 챔버의 안전있을 수 있습니다. </li><li> KCl 용액으로 챔버를 채우 </li><li> 챔버 (그림 2B)로 자세 / AgCl 전극을 연결합니다. 전극 밤새 표백에 실버 와이어를 몸으로 만든 수 있습니다. </li><li> 전극에 걸쳐 transmembrane 잠재력을 적용하고 전압 클램프 모드에서 축삭 200B 패치 - 클램프 증폭기를 사용하여 현재 응답을 모니터링합니다. </li><li> 측정에서 I / V (전류 전압) 커브를 만듭니다. 1 M KCl (그림 3)를 사용하면 I / V 곡선 높은 리니어해야합니다. nanopore의 전도성는 직경에 해당한다. nanopore가 표시되지 않는 경우선형 I / V 곡선, 전도성이 너무 낮은, 또는 nanopore의 오픈 현재는 (그림 4A) 안정 아니라, 그것은 nanopore 제대로 침수되지 않고 피라의 세척을 반복해야한다는 것을 의미합니다. </li></ol> 3. 모니터링 단백질 흡착 <ol><li> 이것은 단백질 샘플을 부족 버퍼 조건과 전류를 모니터링하는 단일 nanopore 막 또는 nanopores의 병렬 배열 (아래 참조)로 제어 실험을 수행하기 위해 매우 중요합니다. 우리는 다음 두 단계를 권장합니다 (I) 고순도 수준 버퍼의 사용 (순결을&gt; 99.9 %, 크로마 토그래피 - 학년 수준), 그리고 (ii) 상호 작용 고체 nanopore와 버퍼의 사용하지 않는 단일 채널 이벤트를 생산하고 있습니다. 또한, 우리는 표준 단백질 화학 절차를 사용하여 고순도의 단백질 샘플을 문의하시기 바랍니다. 단백질 시료의 순도는 나트륨 dodecyl 황산염 - polyacrylamide (SDS - PAGE) 겔 분석 및 고해상도 mA로 확인한다SS 분광법 15. </li><li> 챔버의 접지 목욕으로 연구하려는 단백질의 정화 샘플을 추가합니다. 목욕을 통해 확산하는 샘플 시간을 허용합니다. 측정할 수있다 단백질의 전형적인 농도 μm의 범위 7,15-21에 NM의 수만 있습니다. </li><li> 연구되고있는 단백질의 총 요금의 그 극성 맞은 transmembrane 잠재적인 전압 바이어스를 적용합니다. 예를 들어, BSA는 산도 7.4에서 효과 NET 부정적인 요금을 가지고 있으며, 따라서 긍정적인 전압 바이어스를 적용한다. 적용된 전압은 반대 세력에 의해 주도 될 맞은편 요금 nanopore 인테리어와 단백질 내의 잠재적인 그라데이션을 만듭니다. nanopore에 단백질을 차로 전압 극성은 측정 신호를 생성합니다. </li><li> 200 MV의 진도의 적용 가능성은 대부분의 단백질 analytes을 관찰하기 위해 충분히 커야합니다. 이벤트 기준 (그림 4B)에서 과도 전류 deflections로 나타납니다.어떤 신호가 관찰되지 않은 경우, 챔버에있는 단백질의 농도를 증가시킵니다. 높은 전압 잡음 비율로 신호를 향상시킬 수 있습니다. 질화물 nanopores은 몇 볼트를 견딜 수 있습니다. </li><li> 단백질 adsorptions은 nanopore (그림 4c) 현재 기준에서 오래 살았 변화로 나타납니다. </li></ol> 4. nanopores의 작용화 가능성 실리콘 질화물 22,23에 기능성 그룹을 적용하기위한 여러 가지 방법이 존재. 필요한 경우 대부분의 질화물 필름은 외부와 오존에 노출에 얇은 산화 층을하면 추가 산화물 레이어를 만들 수 있습니다. 다른 organosilanes는 같은 레이어에 사용하고 자기 조립하실 수 있습니다. 특히 관심 유기 표면 범위의 검사 수 있도록,자가 - 조립 및 (즉, 카르복실산 및 aldehydes) 추가로 수정할 수있는, aminosilane입니다. nanopore은 피라로 씻은과 chambe에 확보되고 나면R, 아민은 0.5 M TBACl (tetrabutylammonium) 및 용제로 사용되는 무수 MeOH (메탄올)의 지원 전해액으로 챔버 목욕에 직접 추가할 수 있습니다. Monolayer 형성은 400 MV 전압 바이어스와 전류 드롭 23 측정의 응용 프로그램에서 모니터링할 수 있습니다. 5. 명백한 처음 주문 반응 속도 상수의 결정 및 병렬 nanopore 배열을 사용하여 상수 Langmuir 흡착 흡수 및 탈착에 대한 5.1 명백한 첫번째 주문 반응 속도 상수 우리는이 방법론의 긍정적인 측면은 단일 분자 수준에서 개별 adsorptions를 관찰하는 능력이라고 강조. 무기 표면에 단백질 흡착의 단일 분자 측정은 고체 nanopores의 평행 배열을 채용하여 최대 크기를 조정하실 수 있습니다. nanopores의 병렬 배열 때문에 신뢰할 수있는 통계를 얻을 검정 많은 모공에 대한 필요가 필요합니다S. 이를 위해 nanopore 배열의 사용은 개인 adsorptions의 모니터링뿐만 아니라 추가 분석을 위해 여러 이벤트의 측정을 허용합니다. 실리콘 질화물의 nanopores의 배열은 단순히 예제에서는 여러 구멍을 드릴링하여 위의 프로토콜에 의해 형성 수 있습니다. 각 nanopore 비슷한 크기해야합니다. 좁은 또는 7X7의 nanopores의 배열은 충분한해야합니다. 챔버의 단백질 analyte의 추가되면, 현재는 다음과 같은 표정으로 기하 급수 방식으로 부패합니다 제가 T = I ∞ - (나 ∞ - 난 0) EXP (- K &#39;T) 여기, T, 실험 시간 t에서 전류를 나타냅니다. 저는 0 nanopore 배열을 통해 원래의 전류 전달합니다. 나는 ∞ (즉, 무한대) 포화 수준에서 현재를 나타냅니다. K &#39;는 명백한 처음 주문 반응 속도입니다 상수, 어떤은 일에서 확인할 수 있습니다E는 실험 곡선 맞습니다. 큰 K &#39;는 빠른 흡착 속도로 해석될 수있다. 비율 I ∞ / I 0도, 표준 채도 현재 전화를 0과 1 사이의 무차 번호입니다. 이 매개 변수는 adsorbed 단백질 analytes에 의해 인원을 측정하기위한 한 방법입니다. 따라서, 각각의 독특한 실험 조건은 두 개의 특정 출력 매개 변수 I ∞ / I 0 K &#39;와 관련된한다. 이것은 명백한 첫 주문 흡착 속도 상수와 표준 해류가 nanopores 내에서 단백질에 의해 소비 효과적인 시간에 의해 영향을 언급해야합니다. 이번 대량 수성 단계 24 단백질 analytes의 농도에 따라 달라집니다. 따라서 이러한 숫자의 추가 보정 nanopore 인테리어 내의 단백질에 의해 소비를 효과적으로 시간에 따라 구현해야합니다. 우리는 FAS의 주파수를 측정하는 것이 좋습니다T (translocation) 행사와 평균하여 곱한 이러한 이벤트의 시간을 머물러. 이것은 단위 시간 당 nanopore 내부 내에서 동안 단백질의 평균 시간을 줄 것이다. 탈착의 상수 요금은뿐만 아니라 nanopores의 병렬 배열을 사용하여 결정하실 수 있습니다. 즉시 현재의 수준 채도를 (I ∞)에 도달로 전압이 반대한다, 더 이상 단백질이 nanopores에 갇혀되지 않습니다. 개별 단백질의 탈착은 큰 값으로 기록된 전류의 변화에​​ 의해 동반됩니다. 속도 상수는 다음 현재 수준에있는 상승에서 추출됩니다. 상수 5.2 Langmuir 흡착 nanopores의 무기 표면에 단백질 analytes의 흡수는 수성 단계에있는 단백질 농도에 따라 좌우됩니다. 이러한 현상은 이미 단일 분자 수준 13 관찰되었습니다. θ가 나타내는 경우<html> 의 표준 포화 전류 (I ∞ I / 0), 다음 전형적인 Langmuir 등온 방정식은 다음과 같은 표현식에 의해 주어집니다 : <img alt="그림 5.2" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig5_2.jpg" /> C는 수성 단계에있는 단백질 농도입니다. α는 흡착은 Langmuir 상수입니다. 흡착의 바인딩 에너지의 증가와 온도의 감소와 함께이 지속적으로 증가합니다. θ 데이터 요소의 컬렉션은 수성 단계에서 다양한 단백질 농도에서 실시 병렬 배열로 측정을 채용합니다. 데이터가 장착되어 Langmuir 흡착 상수의 크기를 확인하는 다른 기술과 함께 분석해야합니다. 또한, 전체 원자의 분자 역학 시뮬레이션 25,26도 얻은 실험 데이터의 해석을하는 데 도움 수도 있습니다. 제목 &quot;&gt; 6. 대표 결과 고체 nanopores에 대한 일반적인 결과는 다음과 같은 것입니다. 열린 기공 전류는 그림에서 본대로, 매우 안정되어야합니다. 4A. nanopore의 I / V 특성은 1 M KCl로 그림에서 본 10 인산 칼륨, 산도 7.4에서 높은 리니어해야합니다. 2. I / V 곡선에 맞게 직선의 기울기는 nanopore의 하나의 전도성을 제공할 것입니다. 전도성은 nanopore 직경에 직접 관계를 가지고 있으며 방정식과 일치해야합니다 : <img alt="그림 방정식" src="/files/ftp_upload/3560/3560figeqn.jpg" /> , G는 nanopore의 전도성이고, D는 직경이며, 전의 길이이고, σ는 챔버 14 솔루션의 전도성입니다. 이 값은 30 % 이내로 일치해야합니다. 너무 작은 경우, 기공 가능성이 침수되지 않습니다. 단백질의 추가로 급속한 이벤트가 그림에서 본대로, 상황이 발생한다. 4B. 제자EIN 흡착은 그림에 표시되는 긴 현재 드롭됩니다. 4c. 어떤 단백질은 매우 불안 정한와 기공 내부 내의 구조적 변화를 받아야하고 있습니다. 이 경우 긴 전압 강하가 빠른 변동 동반됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig1.jpg" /> 그림 1. Tecnai F20 S / TEM을 사용하여 가공 고체 nanopore. 기공 20 NM의 직경에 줄기 모드로 뚫고되었습니다. 이미지는 밝고 필드 TEM 모드에서 찍은 거예요. 질소는 30 nm의 두께가되었다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig2.jpg" /> 그림 2. 상공 회의소는 주택에 대한 저항 - 펄스 측정에서 하나의 고체 nanopore를 사용합니다.) 상공 회의소 및 무료 서 질화 창 (TEM 그리드)와 실리콘 칩. nanopore가로드되기 전에 질화로 뚫고있다. 레드 O - 링은 좋은의를 구성하는 데 사용됩니다이온 솔루션 두 가지 온천을 구분하는 칩에 대해 eal. nanopore에 관한 솔루션 욕조와 전극의 배치를 보여주는 챔버 B) 도식. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig3.jpg" /> 그림 3. 다양한 직경의 고체 nanopores에 대한 일반적인 I / V 흔적이. 단일 채널 전기 트레이스가 1 M KCl, 20 MM 트리스, pH를 8.5에서 촬영되었습니다. Nanopores 30 NM 두꺼운 실리콘 질화물에서 뚫고 있었다. 참고 질화물 두께는 nanopore의 하나의 전도성에 영향을 미칠 것입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig4.jpg" /> 그림 4. 단일 채널 전류 성분과 단백질 흡착의 감지를 측정했습니다.) 10 나노미터 직경 nanopore의 오픈 현재를 보여주는 단일 채널 전기 추적. B) 현재 deflections은 남북으로 (BSA) 소 혈청 알부민의 파티션 대표nanopore의 ior. C) BSA의 흡착은 질화 표면에. 모든 흔적은 1 M KCl, 10 MM의 칼륨 인산, 산도 7.4 같은 nanopore에서 있습니다. 적용 transmembrane 잠재력은 40 뮤직 비디오했고 BSA 120 NM의 농도에 근거 챔버 목욕에 추가되었습니다.

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</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

고체 표면에 27-29로 단백질의 자연 흡착는 biochip 응용 프로그램 및 기능 하이브리드의 biomaterials의 새로운 클래스의 디자인 분야의 숫자에 근본적으로 중요합니다. 이전 연구는 고체 표면에 adsorbed 단백질이 측면이나 이동성을 크게 탈착 속도를 표시하지 않는 것으로 나타났습니다, 따라서 단백질 흡착은 일반적으로 돌이킬 수와 특이 현상이 프로세스를 30-32로 간주됩니다. 고체 표면에 단백질 흡착은 고체 - 액체 인터페이스 13 단백질과 반응 그룹의 사이드 체인 간의 정전 기적 ​​및 소수성 세력 등 여러 가지 요인에 의한 것으로 생각됩니다. 단백질 흡착 과정은 이러한 석영 크리스탈 microbalance 28,29, 전자 현미경, 33,34 타원 편광 반사 측정법 35 형광 라벨링, 36 plana로 접근의 숫자에 의...

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Tecnai F20 S / TEM </td><td> 페이 </td><td></td><td> S / TEM은 가속 전압 ≥ 200kV 및 현장 방출 소스를 필요로합니다. </td></tr><tr><td> TEM 20 NM 두꺼운 실리콘 질화 막 창 </td><td> SPI </td><td> 4163SN - BA </td><td></td></tr><tr><td> 축삭 Axopatch 200B 패치 - 클램프 증폭기 </td><td> 분자 장치 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 축삭 Digidata 1440A </td><td> 분자 장치 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10 소프트웨어를 pCLAMP </td><td> 분자 장치 </td><td></td><td> 전기 생리학 데이터 수집 및 분석 소프트웨어 </td></tr><tr><td> 황산 </td><td> Fisher 과학 </td><td> A300 </td><td></td></tr><tr><td> 과산화수소 </td><td> 피셔 과학 </td><td> H325 </td><td></td></tr><tr><td> 실리콘 O - 링 </td><td> McMaster - 카 </td><td> 003 S70 </td><td> 또한 PDMS를 사용하여 </td></tr><tr><td> 실버 와이어 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 348,759 </td><td> 전극에 대한 </td></tr><tr><td> SPC 기술, D 하위 연락처, 핀 </td><td> 뉴어크 </td><td> 9K4978 </td><td> 전극에 대한 </td></tr><tr><td> 염화칼륨 </td><td> 시그마 </td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td> 인산 칼륨 이염 </td><td> 시그마 </td><td> P2222 </td><td></td></tr><tr><td> 인산 칼륨 일염기의 </td><td> 시그마 </td><td> P5379 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS </td><td> 다우 코닝 </td><td></td><td> Sylgar 184 Elastomer가 설정할 수 있습니다. 챔버를 만들기위한. </td></tr><tr><td> Kwik - 캐스트 밀봉제 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> KWIK - CAST </td><td> 빠른 행동 실리콘 밀봉제 </td></tr><tr><td> 핫 플레이트 </td><td> 피셔 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 패러데이 케이지 </td><td></td><td></td><td></td></tr></table>

고체 nanopores와 모니터링 단백질 흡착

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

고체 nanopores은 지역 구조와 유연성 핵산 1-6, 단백질 7 전개, 그리고 다른 리간드 8 바인딩 선호도를 조사하는 단일 분자 수준에서 측정을 수행하는 데 사용되었습니다. 9-12 저항 펄스 기술로 이러한 nanopores을 결합함으로써, 그러한 측정은 다양한 조건 하에서와 라벨 3에 대한 필요없이 할 수 있습니다. 저항 펄스 기술에서는 이온 소금 솔루션은 nanopore의 양쪽에 도입입니다. 따라서, 이온은 지속적으로 현재의 결과, 적용 transmembrane 잠재력에 의해 챔버의 한쪽에서 다른 구동됩니다. nanopore에 analyte의 파티션은 단일 분자 정보를 추출하는 분석할 수이 현재에 잘 정의된 편향을 발생합니다. 이 기법을 사용하여 nanopore 벽에 단일 단백질의 흡착은 다양한 범위의 아래에 모니터할 수 있습니다조건 13. microfluidic 장치의 크기 축소로, 하나의 단백질과 함께 이러한 시스템의 상호 작용이 우려되고 있기 때문에 단백질 흡착은 중요성이 높아지고있다. 이 프로토콜은 쉽게 nanopore 드릴링 의무가 다른 박막, 또는 작용 질화 표면에 확장될 수 있습니다 질화물 필름에 바인딩 단백질에 대한 신속한 분석을 설명합니다. 단백질의 다양한 솔루션 및 denaturing 조건 하에서 광범위한 탐험 수 있습니다. 또한이 프로토콜은 nanopore 분광법을 사용하여보다 기본적인 문제를 탐구하는 데 사용할 수 있습니다.

무기 표면에 단백질이 아닌 구체적인 흡착을 모니터링하는 고체 nanopores를 사용하는 방법을 설명합니다. 방법은 실시간과 단일 분자 수준에서 탐색할 수 흡착 수있게 저항 펄스의 원칙을 사용합니다. 하나의 단백질 흡착 과정 멀리 평형에서이기 때문에, 우리는 양적 단백질 흡착의 상수 명백한 처음 주문 반응 속도의 결정뿐만 아니라 및 Langmuir 흡착 상수 사용, 합성 nanopores의 병렬 배열의 고용을 제안합니다.

고체 Nanopores와 모니터링 단백질 흡착

고체 나노포어는 핵산의 국소 구조와 유연성을 조사하기 위해 단분자 수준에서 측정을 수행하는 데 사용되어 왔습니다...

이 절차의 전반적인 목적은 단백질 흡착 연구에 사용할 인공 막에 나노공(nanopores)을 생성하는 것입니다. 이는 스템(stem)을 사용하여 질화물 막에 나노공을 뚫음으로써 수행됩니다. 그 후, 나노공을 챔버에 장착하고 이온 용액으로 습윤시킵니다.유체가 나노포어의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝까지 연결되어 브리지를 형성함으로써 나노포어가 실험 준비 상태가 됩니다. 여기에 전압을 가하면 이온 전류가 통과하는 것을 관찰할 수 있습니다. 마지막 단계는 나노포어 챔버에 단백질을 첨가하는 것입니다.최종적으로 나노포어를 가로지르는 이온 전류에서 장시간 지속되는 블로케이드(blockade)가 관찰되는 것은 단백질이 나노포어의 측면에 흡착되었음을 나타냅니다. 안녕하세요, 저는 시라큐스 대학교 물리학과 대학원생 데이브 위키(Dave Wicki)입니다.이 방법은 무기 표면에서의 단백질 흡착에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 단백질-핵산 상호작용, 단분자 분광학 및 제한된 공간 내의 분자 연구와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 먼저 스템(stem)의 가속 전압을 올리는 것으로 시작하십시오.다음으로, SPI silicon nitride 윈도우 그리드를 TEM 샘플 홀더에 장착합니다. 잔해물을 제거하기 위해 산소 플라스마로 30초 동안 그리드를 세척합니다. 샘플을 장착하기 전, 샘플 홀더를 TEM에 넣고 진공 펌프가 작동하여 내부 압력이 낮아질 때까지 기다립니다.명시야(brightfield) TEM 모드를 사용하여 로우 프로그램(raw program) 상의 밝은 정사각형 영역인 질화물 윈도우(nitride window)를 찾으십시오. TEM이 적절하게 정렬되었는지 확인하십시오. 그 다음 샘플을 정렬하고 초점을 맞추십시오.이제 시스템을 STEM 모드로 설정하고 hot off 검출기를 사용하여 시료를 이미지화하고 정렬 상태를 확인하십시오. 모노크로메이터(monochromator)가 있는 경우, 드릴링에 사용할 수 있는 전자빔 전류를 높이기 위해 낮은 값으로 설정하십시오. 전자 프로브의 직경에 따라 나노포어(Nanopore)를 드릴링하는 데 적합한 스팟 크기(spot size)를 선택하십시오.스템을 정렬한 상태에서 BROGRAM을 사용하여 필요한 배율로 질화물 막(nitride membrane)에 정확하게 초점을 맞춥니다. 시료의 움직임이 있을 경우, 전자빔을 차단(blank)하고 시료가 안정될 때까지 기다립니다.이 과정은 최대 1시간이 소요될 수 있습니다. 안정화가 되면 전자 프로브를 샘플 위에 배치하고 나노포어 드릴링을 시작합니다. TM으로 나노포어를 드릴링하려면 인내심 있는 정밀함이 필요합니다.이는 전자빔 프로브 아래에서 질화물이 점진적으로 소실되는 과정입니다. 전자 프로브를 드릴링 부위 바로 위에 유지하고 나노공이 완전히 드릴링되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 샘플을 TEM에서 제거하기 전에, hot off 검출기로 스캔하여 주기적으로 샘플을 확인하십시오.시편이 약간 밀려난 경우, 전자 프로브의 위치를 나노포어 위로 조정하십시오. ROI 그램에 초점이 맞으면, 일렁이는 질화물 박막이 사라집니다. 초점이 맞지 않은 상태에서 나노포어가 형성되면, 닳은 손톱 모양의 테두리가 보입니다.히터를 끈 상태에서 나노공을 이미지화하고 이미지의 강도 프로파일을 작성하십시오. 나노공의 직경은 프로파일에서 가장 어두운 영역을 통해 추정할 수 있습니다. 필요한 경우 전자 프로브를 사용하여 나노공을 확장할 수 있습니다.요구되는 직경에 도달하면, 모노크로메이터를 표준 설정으로 두고 TEM 모드로 전환하십시오. 명시야 TEM을 사용하여 기공 크기를 확인하십시오.먼저 탈기된 식염수를 준비합니다. 용액을 진공 상태의 소니케이션 배스에 넣고 20분 동안 처리합니다. 실리콘 질화물이 포함된 취약한 나노포어 칩을 10밀리리터 Pyrex 비커에 조심스럽게 넣습니다. 그런 다음 흄 후드 내의 핫플레이트 위에 비커를 올립니다.피라냐 용액을 사용하여 Nanopore 칩을 매우 주의 깊게 세척합니다. 먼저, 유리 피펫을 사용하여 용기에 황산 3 mL를 넣습니다. 그 다음, 황산에 고농도 과산화수소 1 mL를 조심스럽게 첨가합니다.모든 예방 조치를 취하십시오. 나노포어 칩을 10분 동안 담가 둡니다. 그 다음 유리 피펫을 사용하여 비커에서 피라냐 용액을 제거하고 적절하게 폐기하십시오.다음으로, 비커에 탈기된 탈이온수를 채웁니다. 깨끗한 유리 피펫을 사용하여 비커의 물을 비우고, 이 세척 과정을 최소 5회 반복합니다. 깨끗한 핀셋으로 나노포어 칩을 꺼내어 가벼운 흡입으로 건조시킵니다.건조되면 즉시 나노포어 칩을 챔버 안에 밀봉합니다. 칩은 O-링이나 실리콘 밀봉제로 챔버에 고정할 수 있습니다. 챔버를 염화칼륨 용액으로 채웁니다.은/염화은(silver/silver chloride) 전극을 챔버에 연결합니다. 전극은 은선을 표백제에 하룻밤 동안 담가서 제작할 수 있습니다. 전극 사이에 막 전위(transmembrane potential)를 인가하고 패치 클램프 증폭기(patch clamp amplifier)를 사용하여 전류 반응을 모니터링합니다.전압 클램프 모드에서, 측정값을 통해 전류-전압 곡선을 작성합니다. 곡선은 매우 선형적이어야 합니다. 1 M potassium chloride를 사용할 때, 나노포어의 전도도는 그 직경에 상응해야 합니다.나노포어가 선형 IV 곡선을 나타내지 않는 경우, 전도도가 너무 낮거나 나노포어의 오픈 전류(open current)가 안정적이지 않은 것입니다. 이는 나노포어가 제대로 접합되지 않았음을 나타내며, piha 세척 과정을 반복해야 합니다. 나노포어 내부에 유체가 채워져 있는지 확인하는 것이 필수적입니다.이 단계가 제대로 수행되지 않으면 나노포어를 통한 이온 전류에 매우 큰 노이즈가 발생하며, 나노포어 내로의 단백질 분배가 급격히 감소하게 됩니다. 먼저 정제된 목적 단백질 샘플을 챔버의 접지조(grounded bath)에 첨가하십시오. 샘플이 충분히 확산될 때까지 기다립니다.연구 대상 단백질의 전체 전하와 반대 극성의 막전위 전압 바이어스를 인가하십시오. 200 millivolts의 인가 전압이면 관찰하기에 충분할 것입니다. 대부분의 단백질 분석물 이벤트는 기선으로부터 일시적인 전류 편향으로 나타납니다.신호가 관찰되지 않는 경우, 챔버 내 단백질 농도를 높이십시오. 전압을 높이면 신호 대 잡음비와 나이트라이드가 개선됩니다. 나노포어는 수 볼트의 전압을 견딜 수 있습니다.단백질 흡착은 나노포어의 기저 전류에서 지속적인 변화로 나타납니다. 고체 상태 나노포어의 일반적인 결과는 다음과 같습니다. 개방된 포어의 전류는 매우 안정적이어야 합니다.나노포어의 IV 특성은 매우 선형적이어야 합니다. 1 M 염화칼륨과 10 M 인산칼륨 pH 7.4 용액에서 IV 곡선의 선형 피팅 기울기는 나노포어의 단일 전도도를 제공합니다. 전도도는 나노포어 직경과 직접적인 관계가 있으며 해당 방정식과 일치해야 합니다.이 값은 30% 이내로 일치해야 합니다. 값이 너무 작으면 단백질 첨가 시 기공이 결합되지 않았을 가능성이 큽니다. 단백질 흡착은 지속적인 전류 감소로 나타나며, 이후 빠른 이벤트들이 이어져야 합니다. 일부 단백질은 매우 불안정하여 기공 내부에서 구조적 변형을 일으킵니다.이 경우, 장시간 지속되는 전압 강하와 함께 급격한 변동이 동반될 것입니다. 이 영상을 시청한 후에는 주사 투과 전자 현미경을 사용하여 고체 상태 나노포어를 제조하고, 이를 사용하여 SA 단백질 흡착을 구현하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 피라냐 용액을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행할 때는 항상 흄 후드 내에서 장갑, 실험복 및 화학용 앞치마를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 센서 칩을 사용하여 두 분자 간의 상호 작용을 연구하기 위한 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술에 대해 설명합니다. 공명 각도의 변화와 반사광의 강도는 두 분자의 결합 및 해리의 함수로 감지되며, 이는 두 분자 간의 상호 작용에 대한 정보를 제공합니다.

센서 칩을 사용한 생체 분자 상호 작용을 연구하기 위한 표면 플라즈몬 공명

생명 전좌 실험 용액에 고체 상태의 나노 기공을 제조하는 방법이 제시된다. 높은 전기장의 짧은 펄스를인가함으로써, 나노 기공 직경이 나노 미터 이하로 제어 정밀도로 확대 될 수 있고 그 전기적 잡음 특성이 크게 개선되었다. 이 절차는 실험 조건 하에서 표준 실험실 장비를 사용하여 반응계 내에서 수행된다.

크기를 미세 조정 및 고체 나노 세공의 잡음을 최소화

표면 플라스 몬 공명 (SPR)은 실시간으로 생체 분자 상호 작용을 검출하기위한 라벨없는 방법이다. 여기서, 막 단백질을위한 프로토콜 : 기술의 장단점을 논의하는 동안 수용체 상호 작용 실험은 설명한다.

막 단백질의 실시간 측정 : 수용체 상호 작용은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)

제시된 프로토콜은 공극 스패닝 무용매 지질 이중층을 사용하여 단일 수송체 수준에서 막 단백질 매개 수송을 분석하는 방법을 설명합니다. 이는 대단히 병렬적인 데이터 수집 및 분석과 결합된 대량 생산된 나노포어 어레이 칩을 생성함으로써 달성되며, 향후 멤브레인 단백질 이펙터 스크리닝의 확립을 가능하게 합니다.

멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다

여기에서는 개개의 나노 입자의 제타 포텐셜을 결정하는데 사용될 수있다 입자 전위 속도의 측정을 통해 나노 입자의 표면 화학을 특징 저항 펄스 감지 기술에 통합 된 폴리 우레탄 동조 나노 기공을 사용한다.

조정 나노 기공을 통해 나노 입자 전좌 속도를 통해 제타 전위의 측정 : 예를 들어 DNA 변성 입자를 사용하여

플라즈몬 핀셋을 통합 마이크로 칩 제조 공정은 여기에 표시됩니다. 마이크로 칩은 최대 트래핑 힘을 측정하기 위해 갇힌 입자의 영상을 가능하게한다.

모니터링 환경에서 플라즈몬 트랩 및 나노 입자의 릴리스

프로 테아 제는 기본적인 생물학 과정 및 암과 같은 복잡 한 질병의 dysregulated 프로 테아 제 활동 드라이브 진행에 관련 된 단단히 규제 효소. 이 방법의이 목표 호스트 소변에서 감지 하 고 질병을 차별 분열 신호를 생산 하 여 효소 활동에서 vivo에서 측정 하는 nanosensors를 만드는 것입니다.

Nanosensors 프로 테아 제 활동에 감지 비보에 비 침 투 적인 진단에 대 한

여기서, 우리는 생물학적 나노기공 기반 전자 플랫폼을 사용하여 단일 분자 한계에서 이산 금속 산소 클러스터, 폴리옥소메탈레이트(POMs)를 검출하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 이러한 분자의 연구에 사용되는 전통적인 분석 화학 도구에 대한 보완적인 접근법을 제공합니다.

단일 금속 나노 입자의 고분해능 물리적 특성화

여기, 선물이 폐쇄 형 무선 nanopore 전극의 제조 및 단일 나노 입자 충돌의 후속 전기 측정에 대 한 프로토콜.

단일 나노 입자 분석에 대 한 폐쇄-타입 무선 Nanopore 전극

생체 분자 - 무기 고체 상 상호 작용을 이해하기위한 첫 번째 단계는 흡착 등온을 확립하여 평가 될 수있는 근본적인 물리 화학 상수를 드러내는 것입니다. 액체 상에서 의 흡착은 운동학, 표면 용량, pH 및 경쟁 흡착에 의해 제한되며, 흡착 실험을 설정하기 전에 모두 신중하게 고려해야합니다.

고갈 방법을 사용하여 유기 나노 입자를 분산 된 용액에 대한 짧은 펩타이드 흡착 연구

플라즈몬 나노핀셋은 금 나노 구조에서 국부적인 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 나노미터 규모의 광학 필드 내에서 단백질을 포함한 단일 나노 입자를 가둡니다. 산란 신호의 변화는 단백질의 존재와 구조적 역학을 드러내므로 형광단 변형이나 표면 테더링 없이 모니터링할 수 있습니다.

플라즈모닉 나노핀셋을 사용한 단일 비변형 단백질의 구조적 역학 모니터링

배우세요 실리콘 나이트라이드 막에 고체 나노포어를 제작하고 저항성 펄스 기법으로 단백질 흡착을 실시간 모니터링하는 방법을. 단일 분자 수준에서 단백질-표면 상호작용을 연구하는 라벨 프리 플랫폼을 제공합니다.

고체 Nanopores와 모니터링 단백질 흡착

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