고체 Nanopores와 모니터링 단백질 흡착

이 절차의 전반적인 목표는 단백질 흡수 연구에 사용하기 위해 인공 멤브레인에 나노 기공을 만드는 것입니다. 이것은 줄기를 사용하여 질화물 막에 나노 기공을 드릴링함으로써 이루어집니다. 그런 다음 나노 기공을 챔버에 적재하고 이온 용액으로 적십니다.

액체가 nanopore의 1개의 측에서 다른 측에 nanopore를 실험 위해 준비되어 있게 하기 위하여 교량을 형성하도록. 전압이 그 위에 가해지고 이온 전류가 통과하는 것을 관찰할 수 있습니다. 마지막 단계는 나노포어 챔버에 단백질을 추가하는 것입니다.

궁극적으로 nanopore를 가로지르는 이온 전류에 있는 long-lived 봉쇄를 관찰하는 것은 Nanopore의 측에 단백질의 흡수를 계시합니다. 안녕하세요, 저는 데이브 위키입니다. 저는 시라큐스 대학교 물리학과 대학원생입니다.

이 방법은 무기 표면에서 단백질의 흡수에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한 단백질, 핵산 상호 작용, 분광학을 위한 단일 분자 및 제한된 공간의 분자 연구와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 스템을 가속 전압으로 올리는 것으로 시작합니다.

다음으로 SPI 질화규소 윈도우 그리드를 TEM 시료 홀더에 로드합니다. 산소 플라즈마로 그리드를 30초 동안 청소하여 이물질을 제거합니다. 샘플을 로드하기 전에 샘플 홀더를 TEM에 로드하고 진공이 펌핑 다운되도록 합니다.

명시야 TEM 모드를 사용하여 원시 로그램의 밝은 사각형인 질화물 창을 찾습니다. TEM이 올바르게 정렬되었는지 확인합니다. 그런 다음 샘플을 정렬하고 초점을 맞춥니다.

이제 시스템을 STEM 모드로 전환하고 핫 오프 검출기를 사용하여 샘플을 이미지화하고 정렬을 확인합니다. 모노크로메이터가 있는 경우 낮은 값으로 설정하여 드릴링에 사용할 수 있는 더 높은 전자 전류를 허용합니다. 전자 프로브의 직경에 따라 Nanopore를 드릴링할 적절한 스폿 크기를 선택합니다.

줄기를 정렬합니다. BROGRAM을 사용하여 필요한 배율에서 질화물 멤브레인에 완벽하게 초점을 맞춥니다. 샘플의 움직임이 있으면 전자빔을 블랭크하고 샘플이 안정화될 때까지 기다립니다.

이 작업은 최대 한 시간이 걸릴 수 있습니다. 일단 안정되면, 전자 탐침을 표본에 놓고 nanopore를 교련하기 시작하십시오. TM으로 나노포어를 드릴링하려면 환자의 불륜이 필요합니다.

질화물이 전자빔 프로브 아래에서 점차적으로 소멸되는 과정입니다. 전자 프로브를 시추 부위 바로 위에 유지하고 나노포어가 완전히 시추되었는지 확인하는 것이 중요합니다. s를 제거하기 전에ampTEM에서 le, 주기적으로 s를 확인하십시오.amp핫 오프 감지기로 스캔하여 le.

샘플이 약간 드리프트하면 전자 프로브의 위치를 나노포어 위로 조정하십시오. ROI 그램에 초점을 맞추면 반짝이는 질화물 필름이 사라집니다. 나노포어가 roky gram이 초점에서 벗어난 상태로 형성되면 해체 손톱 가장자리가 보입니다.

뜨거움을 가진 nanopore를 심상하고 심상의 강렬 단면도를 만드십시오. 나노기공의 직경은 프로파일의 가장 어두운 영역으로 추정할 수 있습니다. 전자 프로브는 필요한 경우 나노 기공을 확대하는 데 사용할 수 있습니다.

필요한 직경을 가질 때. 표준 설정에서 모노크로메이터를 사용하여 TEM 모드로 전환합니다. 명시야 TEM을 사용하여 기공 크기를 확인합니다.

degas di saline을 준비하는 것으로 시작하십시오. 용액을 진공 상태에서 넣고 20분 동안 초음파 처리한 후 질화규소 칩이 포함된 깨지기 쉬운 나노포어를 10ml 파이렉스 부리에 섬세하게 넣습니다. 그런 다음 흄 후드에 비커를 핫 플레이트에 놓습니다.

피라냐 용액으로 나노포어 칩을 매우 조심스럽게 청소합니다. 먼저 유리 피펫을 사용하여 용기에 3ml의 황산을 추가합니다. 둘째, 황산에 1ml의 높은 과산화수소를 조심스럽게 첨가합니다.

모든 예방 조치를 취하십시오. 나노포어 칩을 10분 동안 담가둡니다. 그런 다음 유리 피펫을 사용하여 비커에서 피라냐 용액을 제거하고 적절하게 폐기합니다.

다음으로 비커에 Degas 탈이온수를 채웁니다. 깨끗한 유리 피펫을 사용하여 비커의 물을 비우고 이 세척을 최소 5회 반복합니다. 깨끗한 핀셋으로 나노 기공 칩을 제거하고 광 흡입으로 건조시킵니다.

건조되면 즉시 나노포어 칩을 챔버에 밀봉합니다. 칩은 O-링 또는 실리콘 실런트로 챔버에 고정될 수 있습니다. 챔버를 염화칼륨 용액으로 채웁니다.

은, 은염화은 전극을 챔버에 연결합니다. 전극은 은선을 표백제에 밤새 담가 만들 수 있습니다. 전극 전체에 막관통 전위를 적용하고 패치 클램프 증폭기를 사용하여 전류 응답을 모니터링합니다.

전압 클램프 모드에서는 측정값으로부터 전류 전압 곡선을 구성합니다. 곡선은 매우 선형적이어야 합니다. 1개의 몰 염화칼륨을 사용할 때, nanopore의 전도도는 그것의 직경에 해당해야 합니다.

나노포어가 선형 IV 곡선을 나타내지 않으면 컨덕턴스가 너무 낮거나 나노포어의 개방 전류가 안정적이지 않은 것입니다. 이는 나노포어가 제대로 결합되지 않았으며 piha 세척을 반복해야 함을 나타냅니다. 액체가 nanopore 안쪽에 있다는 것을 확인하는 것은 근본적입니다.

이 단계가 제대로 수행되지 않으면 나노기공을 통한 이온 전류가 매우 큰 노이즈를 나타내고 나노기공으로의 단백질 분할이 크게 감소합니다. 관심 단백질의 정제된 샘플을 챔버의 접지된 수조에 추가하는 것으로 시작합니다. 샘플이 완전히 확산될 때까지 기다립니다.

연구 중인 단백질의 총 전하와 반대 극성을 가진 막관통 전위 전압 바이어스를 적용합니다. 200밀리볼트의 적용된 전위는 관찰할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다. 대부분의 단백질 분석물 이벤트는 베이스라인에서 일시적인 전류 편향으로 나타납니다.

신호가 관찰되지 않으면 챔버 내 단백질의 농도를 높이십시오. 전압이 높을수록 신호 대 잡음비와 질화물이 향상됩니다. 나노 기공은 수 볼트를 견딜 수 있습니다.

단백질 흡수는 Nanopore의 기준선 전류에서 수명이 긴 변화로 나타날 것입니다. 고체 상태 나노 기공에 대한 일반적인 결과는 다음과 같습니다. 개방 기공 전류는 매우 안정적이어야 합니다.

나노포어의 IV 특성은 고도로 선형적이어야 합니다. 1몰 염화칼륨, 10몰 인산칼륨 pH 7.4에서 IV 곡선에 대한 선형 맞춤의 기울기는 나노포어의 단일 전도도를 제공합니다. 컨덕턴스는 나노포어 직경과 직접적인 관계가 있으며 방정식과 일치해야 합니다.

이 값은 30% 이내와 일치해야 합니다.값이 너무 작으면 모공이 단백질 첨가와 결합되지 않았을 가능성이 있습니다. 급격한 사건이 뒤따라야 합니다: 단백질 흡수는 오래 지속되는 전류 감소입니다. 일부 단백질은 매우 불안정하며 기공 내부 내에서 구조적 변형을 겪습니다.

이 경우 수명이 긴 전압 강하는 급격한 변동을 동반합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 주사 투과 전자 현미경을 사용하여 고체 상태 나노기공을 제조하는 방법과 이러한 준비된 SA 단백질 흡수를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 피라냐 용액으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행할 때 항상 장갑, 실험실 가운 및 화학 앞치마를 착용하고 흄 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.