Name: En tiempo real de imágenes digitales de los leucocitos del endotelio interacción en el daño por isquemia-reperfusión (IRI) del músculo cremáster Rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 7 s
Description: Aprende microscopía intravital digital para estudiar interacciones leucocito-endoteliales en lesión por isquemia-reperfusión del músculo cremáster de rata. Este protocolo permite visualizar procesos inflamatorios en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por una beca de la &quot;Deutsche Forschungsgemeinschaft&quot; a SU Eisenhardt (IE 866/1-1).

<ol><li>Cetin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+fucoidin+%28a+neutrophil+rolling+inhibitor%29+on+ischemia+reperfusion+injury%3A+experimental+study+in+rat+epigastric+island+flaps%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Plast.+Surg%22%5BJournal%5D)">Protective effect of fucoidin (a neutrophil rolling inhibitor) on ischemia reperfusion injury: experimental study in rat epigastric island flaps.</a> Ann. Plast. Surg. 47, 540-546 (2001).</li>
<li>Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+xanthine+oxidase+and+granulocytes+in+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury.</a> Am. J. Physiol. 255, H1269-H1275 (1988).</li>
<li>Lazarus, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mast+cells+in+ischaemia-reperfusion+injury+in+murine+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The role of mast cells in ischaemia-reperfusion injury in murine skeletal muscle.</a> J Pathol. 191, 443-448 (2000).</li>
<li>van den Heuvel, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Ischaemia-reperfusion+injury+in+flap+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plast.+Reconstr.+Aesthet.+Surg%22%5BJournal%5D)">Review: Ischaemia-reperfusion injury in flap surgery.</a> J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 62, 721-726 (2009).</li>
<li>Rosen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+lectins+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell surface lectins in the immune system.</a> Semin. Immunol. 5, 237-247 (1993).</li>
<li>van der Flier, A., Sonnenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+interactions+of+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Function and interactions of integrins.</a> Cell Tissue Res. 305, 285-298 (2001).</li>
<li>Panes, J., Perry, M., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+adhesion%3A+avenues+for+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell adhesion: avenues for therapeutic intervention.</a> Br. J. Pharmacol. 126, 537-550 (1999).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+of+the+renal+microvascular+endothelium+alters+barrier+function+after+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Injury of the renal microvascular endothelium alters barrier function after ischemia.</a> Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 285, 191-198 (2003).</li>
<li>Serracino-Inglott, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+nitric+oxide+synthase+expression+during+hepatic+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Differential nitric oxide synthase expression during hepatic ischemia-reperfusion.</a> Am. J. Surg. 185, 589-595 (2003).</li>
<li>Eppinger, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediators+of+ischemia-reperfusion+injury+of+rat+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mediators of ischemia-reperfusion injury of rat lung.</a> Am J Pathol. 150, 1773-1784 (1997).</li>
<li>Dumont, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+apoptotic+cell-membrane+changes+at+the+single-cell+level+in+the+beating+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of apoptotic cell-membrane changes at the single-cell level in the beating murine heart.</a> Nat Med. 7, 1352-1355 (2001).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Woeste, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octreotide+attenuates+impaired+microcirculation+in+postischemic+pancreatitis+when+administered+before+induction+of+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Octreotide attenuates impaired microcirculation in postischemic pancreatitis when administered before induction of ischemia.</a> Transplantation. 86, 961-967 (2008).</li>
<li>Schultz, J. E., Hsu, A. K., Gross, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+mimics+the+cardioprotective+effect+of+ischemic+preconditioning+via+a+glibenclamide-sensitive+mechanism+in+the+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Morphine mimics the cardioprotective effect of ischemic preconditioning via a glibenclamide-sensitive mechanism in the rat heart.</a> Circ. Res. 78, 1100-1104 (1996).</li>
<li>Dobschuetz, E. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+intravital+fluorescence+microscopy--a+novel+method+for+the+assessment+of+microvascular+permeability+in+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic intravital fluorescence microscopy--a novel method for the assessment of microvascular permeability in acute pancreatitis.</a> Microvasc Res. 67, 55-63 (2004).</li>
<li>Vutskits, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+effects+of+methylene+blue+on+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Adverse effects of methylene blue on the central nervous system.</a> Anesthesiology. 108, 684-692 (2008).</li>
<li>Takasu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+time+with+combined+early+blood+transfusion+and+fluid+administration+in+uncontrolled+hemorrhagic+shock+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Trauma%22%5BJournal%5D)">Improved survival time with combined early blood transfusion and fluid administration in uncontrolled hemorrhagic shock in rats.</a> J. Trauma. 8, 312-316 (2010).</li>
<li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+arteriolar%2C+regional%2C+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, 34-41 (1985).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mouse+Cremaster+Muscle+Preparation+for+Intravital+Imaging+of+the+Microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2874(2011).</li>
<li>Kanwar, S., Hickey, M. J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postischemic+inflammation%3A+a+role+for+mast+cells+in+intestine+but+not+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Postischemic inflammation: a role for mast cells in intestine but not in skeletal muscle.</a> Am. J. Physiol. 275, 212-218 (1998).</li>
<li>Leoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflamed+phenotype+of+the+mesenteric+microcirculation+of+melanocortin+type+3+receptor-null+mice+after+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Inflamed phenotype of the mesenteric microcirculation of melanocortin type 3 receptor-null mice after ischemia-reperfusion.</a> FASEB J. 22, 4228-4238 (2008).</li>
<li>Simoncini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+oestrogen+receptor+with+the+regulatory+subunit+of+phosphatidylinositol-3-OH+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction of oestrogen receptor with the regulatory subunit of phosphatidylinositol-3-OH kinase.</a> Nature. 407, 538-541 (2000).</li>
<li>Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ. Res. 103, 1128-1138 (2008).</li>
<li>Mori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+induced+microvascular+responses+in+LDL-receptor+-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion induced microvascular responses in LDL-receptor -/- mice.</a> Am. J. Physiol. 276, H1647-H1654 (1999).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Molecular+Changes+Induced+by+Ischemia%2FReperfusion+in+Human+Free+Muscle+Flap+Tissue+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Plast.+Surg%22%5BJournal%5D)">Monitoring Molecular Changes Induced by Ischemia/Reperfusion in Human Free Muscle Flap Tissue Samples.</a> Ann. Plast. Surg. , (2011).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+activation-specific+human+anti-%7Balpha%7DM%7Bbeta%7D2+single-chain+antibodies+as+potential+diagnostic+tools+and+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of activation-specific human anti-{alpha}M{beta}2 single-chain antibodies as potential diagnostic tools and therapeutic agents.</a> Blood. 109, 3521-3528 (2007).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+pentameric+to+monomeric+C-reactive+protein+on+activated+platelets+localizes+inflammation+to+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Dissociation of pentameric to monomeric C-reactive protein on activated platelets localizes inflammation to atherosclerotic plaques.</a> Circ Res. 105, 128-137 (2009).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-reactive+protein%3A+how+conformational+changes+influence+inflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C-reactive protein: how conformational changes influence inflammatory properties.</a> Cell Cycle. 8, 3885-3892 (2009).</li>
<li>Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGranger%2C+DN+%22Physiology+and+pathophysiology+of+leukocyte+adhesion%22">Physiology and pathophysiology of leukocyte adhesion</a>. , Oxford University Press. New York. 520(1995).</li>
<li>Baatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+white+blood+cell+staining+by+intravascular+administration+of+rhodamine+6G%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Microcirc.+Clin.+Exp%22%5BJournal%5D)">Kinetics of white blood cell staining by intravascular administration of rhodamine 6G.</a> Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 15, 85-91 (1995).</li>
<li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).</li>
<li>Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fluorescent+dyes+on+selectin+and+integrin-mediated+stages+of+adhesion+and+migration+of+flowing+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes.</a> J. Immunol. Methods. 239, 109-119 (2000).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Leucocitos del endotelio interacción, la producción de especies reactivas del oxígeno y la activación del sistema del complemento son las principales características de la disfunción del tejido inducido por el IRI. 26 La microcirculación del tejido afectado es considerado como el sitio integral para el inicio inflamatoria. Aparte de los experimentos ex vivo, como los ensayos de la cámara de flujo 27, 28, es obligatorio proporcionar modelos bien establecidos de imagen intravital para seguir...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del equipo: </td><td> Empresa: </td><td> Artículo número: </td><td> Comentarios: </td></tr><tr><td> Forene 100% (V / V) </td><td> Abad </td><td> B506 </td><td> API de isoflurano </td></tr><tr><td> Terylene sutura </td><td> Serag Weissner </td><td> OC108000 </td><td></td></tr><tr><td> Portex Bellas Diámetro tubo de polietileno </td><td> Smiths Medical </td><td> 800/100/100 </td><td> 0,28 mm de diámetro interior </td></tr><tr><td> 0,9% de solución salina </td><td> Fresinus Kabi </td><td> 808771 </td><td></td></tr><tr><td> -A cambio de punta de lujo kit de cauterio </td><td> Bovie Medical </td><td> Del1 </td><td></td></tr><tr><td> Abbocath-T 14G </td><td> Venisystems </td><td> G713- A01 </td><td> utilizado como tubo de lente </td></tr><tr><td> Servo 900C Ventilador </td><td> Maquet </td><td></td><td> utilizada como ventialtor animales </td></tr><tr><td> Transductor de presión lógico </td><td> Smiths Medical </td><td> MX1960 </td><td></td></tr><tr><td> Sirecust 404 Monitor de </td><td> Siemens </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ABL 700 Analizador de mesa </td><td> Radiómetro </td><td></td><td> para la medición de gases en sangre </td></tr><tr><td> Almohadilla eléctrica </td><td> Effenberger </td><td> 8319 </td><td></td></tr><tr><td> Aluminio fase </td><td> ALFUN </td><td> AW7022 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio quirúrgico OPMI 6-SDFC </td><td> Carl Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microcirugía de los instrumentos de laboratorio de set </td><td> S &amp; T </td><td> 767 </td><td></td></tr><tr><td> Biemer clip de buques </td><td> Diener </td><td> 64.562 </td><td></td></tr><tr><td> La aplicación de fórceps </td><td> Diener </td><td> 64.568 </td><td> para el clip de buques Biemer </td></tr><tr><td> Rodamina 6G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R4127 </td><td></td></tr><tr><td> Vaselina blanca DAB </td><td> Winthrop </td><td> 2726853 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td></td><td></td><td> 32x32 mm </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Configuración intravital </td></tr><tr><td> Zeis Axio Scope A-1 MAT </td><td> Carl Zeis </td><td> 490036 </td><td> microscopio de epifluorescencia </td></tr><tr><td> 470 nm LED </td><td> Carl Zeis </td><td> 423052 </td><td> fuente de luz fluorescente </td></tr><tr><td> 2 Sistema de Colibri </td><td> Carl Zeis </td><td> 423052 </td><td></td></tr><tr><td> W Plan-Apochromat 20x / 1,0 DIC </td><td> Carl Zeis </td><td> 421452 </td><td> objetivo de inmersión en el agua </td></tr><tr><td> AxioCam MRM Rev. 3 FireWire </td><td> Carl Zeis </td><td> 426509 </td><td> cámara digital de alta resolución </td></tr><tr><td> Axio LE software de la visión </td><td> Carl Zeis </td><td> 410130 </td><td> utilizar para análisis fuera de línea </td></tr></tbody></table>

en tiempo real de imágenes digitales de los leucocitos del endotelio interacción en el daño por isquemia-reperfusión (iri) del músculo cremáster rata

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

La isquemia-reperfusión (IRI) ha sido implicado en una gran variedad de condiciones patológicas tales como accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, isquemia intestinal, así como seguir. Trasplante y cirugía cardiovascular una reperfusión del tejido previamente isquémico, aunque es esencial para la prevención de la irreversible las lesiones de tejidos, provoca inflamación excesiva del tejido afectado. Adyacente a la producción de especies reactivas del oxígeno, la activación del sistema del complemento y el aumento de la permeabilidad microvascular, la activación de los leucocitos es uno de los principales actores en la cascada patológica de la lesión tisular inflamatoria durante la reperfusión. 2, 3 activación de leucocitos es un proceso de varias fases que consiste de material, la adhesión firme y la transmigración y está mediada por una compleja interacción entre las moléculas de adhesión en respuesta a factores quimiotácticos como factores del complemento, quimiocinas, o el factor activador de plaquetas. 4 &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Mientras rodadura de leucocitos en las vénulas postcapilares está predominantemente mediado por la interacción de selectinas 5 con sus ligandos de venta libre, la adhesión firme de los leucocitos al endotelio es selectina-controlado a través de la unión a las moléculas de adhesión intercelular (ICAM) y celulares vasculares las moléculas de adhesión (VCAM). 6, 7 Estándar de oro para el estudio in vivo de leucocitos del endotelio interacción es la técnica de microscopía intravital, describió por primera vez en 1968. 8 Aunque varios modelos de IRI (isquemia-reperfusión) se han descrito para diversos órganos, 9-12 sólo unos pocos son adecuadas para la visualización directa de reclutamiento de leucocitos en el lecho microvascular en un alto nivel de calidad de imagen. 8 Estamos aquí, promover el digital de microscopía intravital epifluorescencia de la vénula postcapilares en la microcirculación cremastéricode la rata 13 como un método práctico para analizar cualitativa y cuantitativamente el reclutamiento de leucocitos por el IRI de investigación en el tejido muscular estriado y proporcionar un manual detallado para llevar a cabo la técnica. Nos ilustran aún más las trampas más comunes y proporcionar consejos útiles que deberían permitir al lector a apreciar de verdad, y con seguridad realizar el método. En un paso a paso el protocolo que describen cómo empezar con anestesia respiración controlada bajo vigilancia suficiente para evitar que el animal anestesiado con firmeza durante períodos más largos de tiempo. A continuación, describen la preparación cremastérico como una delgada lámina plana para la resolución óptica excepcional y proporcionar un protocolo para obtener imágenes de leucocitos en el IRI que ha sido bien establecido en nuestros laboratorios.

Digital microscopía intravital epifluorescencia de vénulas post-capilares de la microcirculación cremastérico es un método conveniente para obtener información sobre la interacción leucocito-endotelio<em&gt; En vivo</em&gt; En la lesión por isquemia-reperfusión (IRI) de músculo estriado. Estamos aquí proporcionar un protocolo detallado para realizar con seguridad la técnica y discutir sus aplicaciones y limitaciones.

En tiempo real de imágenes digitales de los leucocitos del endotelio interacción en el daño por isquemia-reperfusión (IRI) del músculo cremáster Rata

La lesión por isquemia-reperfusión (IRI) se ha implicado en una amplia gama de afecciones patológicas, tales como el accidente cerebrovascular, el infarto de miocardio...

La microscopía intravital de la microcirculación del tejido CRE es un método conveniente para obtener información sobre la isquemia y la lesión por reperfusión del tejido muscular estriado. En un protocolo paso a paso, mostramos cómo comenzar con una anestesia controlada por respiración bajo una monitorización adecuada mediante la cannulación arterial para mantener al animal firmemente anestesiado durante períodos prolongados. Ilustramos cómo realizar la cannulación de la vena yugular y luego describimos la preparación del tejido CRE como una lámina delgada y plana que ofrece una resolución óptica excepcional.Proporcionamos un protocolo para la obtención de imágenes de leucocitos en lesión por isquemia-reperfusión que ha sido bien establecido en nuestros laboratorios. Este modelo puede utilizarse para analizar la activación de leucocitos en isquemia. Investigación sobre lesión por reperfusión.Se ha implicado a la lesión por fusión isquémica en un amplio espectro de condiciones patológicas, como el infarto de miocardio, la isquemia intestinal, así como en el período posterior a trasplantes y cirugías cardiovasculares. La hiperperfusión del tejido previamente isquémico, aunque esencial para prevenir lesiones tisulares irreversibles, provoca una inflamación excesiva del tejido afectado, adyacente a la producción de especies reactivas de oxígeno, la activación del sistema del complemento y un aumento de la permeabilidad microvascular. La activación de los leucocitos es uno de los principales actores en la cascada patológica del daño tisular inflamatorio durante la reperfusión.Aquí promovemos la microscopía intravital del sector postcapilar como un método conveniente para analizar la activación de leucocitos en la lesión por isquemia-reperfusión. Además, ilustramos errores comunes y ofrecemos consejos útiles que deberían permitir al lector comprender cabalmente y realizar con seguridad el método. Tras la aprobación del comité de ética, anestesie ratas macho con un peso corporal de 120 a 180 gramos, coloque la rata dentro de una caja de plexiglás y administre del dos al tres por ciento en volumen de isoflurano mediante un vaporizador de isoflurano.En cuanto se alcance el nivel adecuado de anestesia, se pesa a la rata y se afeita el área cervical ventral. Coloque a la rata en posición decúbito dorsal sobre una almohadilla calefactora para mantener la temperatura corporal a 37 grados Celsius y administre isoflurano al dos por ciento en volumen mediante una máscara de silicona. Las siguientes preparaciones se realizan mejor utilizando un microscopio quirúrgico.Realice una incisión cutánea horizontal de dos centímetros en la región de la escotadura esternal. Movilice las glándulas salivales lateralmente. Ahora tiene ante usted los músculos cervicales ventrales.Separarlos cuidadosamente por la línea media y localizar la tráquea. Exponer de uno a dos centímetros de la tráquea y colocar una pinza microquirúrgica por debajo para elevarla. Ahora, insertar aproximadamente a la mitad del lado ventral de la tráquea un tubo de calibre 14 como tubo traqueal en la parte inferior de la tráquea, el cual previamente se habrá conectado a un ventilador para animales.Entonces, la respiración puede controlarse por volumen con una frecuencia de 35 a 45 respiraciones por minuto. Un volumen corriente de 4,5 a cinco M y una concentración de fluoruro de ISO del 1,5 al 2 por ciento en volumen para la canulación carotídea. El músculo hioides esternal derecho se separa mediante disección roma.Para localizar una arteria carótida, separe cuidadosamente el nervio vago de la arteria carótida y coloque la arteria sobre pinzas microquirúrgicas Anki para detener el flujo sanguíneo desde el corazón, pasando dos hilos de sutura por debajo de la arteria carótida en relación con el corazón; el hilo de sutura más distal se ata firmemente, mientras que el hilo proximal se ata flojamente alrededor de la arteria carótida. La colocación de un segundo hilo proximal evita el sangrado tras retirar las pinzas microquirúrgicas utilizando tijeras microquirúrgicas, realizando un pequeño corte en la arteria carótida entre las dos ligaduras. Introduzca un catéter de polietileno lleno con solución salina normal que esté conectado a un transductor de presión.Retire las pinzas microquirúrgicas y avance más el catéter dentro de la arteria. Realice análisis intermitentes de gases en sangre arterial utilizando un analizador de gases sanguíneos y mantenga el pH sanguíneo dentro de los límites fisiológicos para la administración intravenosa de colorantes fluorescentes u otros fármacos de interés. Enfóquese en la zona de la vena yugular izquierda con el microscopio quirúrgico, sosteniendo una pinza en cada mano, y rompa la fina fascia para exponer la vena yugular.Coloque la vena sobre una pinza microscópica en ángulo para detener el flujo sanguíneo. Con la pinza, pase dos trozos de hilo de sutura de igual longitud por debajo de la vena yugular de forma idéntica a la canulación carotídea; haga un pequeño corte en la vena yugular e inserte un catéter de polietileno que haya sido lavado con solución de la línea celular. Introduzca el catéter hacia el corazón y apriete el ligador más cercano al corazón.Alrededor de la vena y el catéter, utilizamos una imagenología cremastérica de aluminio en etapa cuatro que adopta rápidamente la temperatura deseada de la almohadilla calefactora. Se realiza una incisión inicial en la piel y en el fiso espermático externo por encima del escroto, en el extremo más distal, seguida de una dilatación cuidadosa del espacio subdérmico mediante tijeras finas. Tan pronto como se expone el tejido, se humedece con una solución salina precalentada.Se elimina cuidadosamente el tejido conectivo entre la fascia espermática externa y el músculo CRE maestro para liberar los músculos del trimestre de los tejidos circundantes. La superfusión continua durante la disección hidrata el tejido, lo que facilita la visibilidad y la eliminación, como el extremo distal del CRE maestro S para sujetar y extender ligeramente el extremo del S en el interior del extremo distal del saco en la cara ventral y alargar la incisión proximalmente. Utilizando tijeras microquirúrgicas, se categorizan cuidadosamente los vasos sanguíneos que sangran a lo largo de las líneas de incisión.Utilizando un Cory térmico, el músculo cremaster abierto queda plano sobre la dosis del pedestal de aluminio, aún conectado mediante delgados ligamentos a los EPI debajo del testículo, incluyendo una pequeña arteria y vena. Use el ery para sellar los vasos y cortar los ligamentos conectivos entre el tejido discal y el tejido cremasteriano. Empuje suavemente el testículo aislado de vuelta hacia el canal inguinal.Además de la primera fijación, que son cuatro picazones del tejido, y con cuidado adhiera los hilos extendiendo radialmente el tejido cremaster sobre la plataforma de aluminio. Coloque los dos extremos de un catéter de polietileno cerca del tejido cremaster para el montaje de la superfusión. Dibuje una línea de gel de petrolato alrededor del músculo cremaster utilizando una jeringa para crear una cámara de fluido.Coloque un cubreobjetos cuadrado sobre el tejido cric y sujete firmemente los bordes a la línea de vaselina. El tejido cremastérico ya está listo para la imagenología microscópica. La configuración básica in vivo puede variar.Utilizamos un microscopio intra vital de epifluorescencia equipado con una fuente luminosa LED de 470 nanómetros para la laminación EP. Con un objetivo de inmersión en agua, alcanzamos un aumento de aproximadamente 800 x y registramos la observación mediante una cámara digital de alta resolución. Para la imagen de epifluorescencia, el experimento debe realizarse en una habitación oscura.Para la marcación de leucocitos, inyecte rumina seis J por vía intravenosa a través del catéter yugular a una concentración de 0,4 miligramos por kilogramo de peso corporal. Elija un vaso postcapilar para la observación. El tamaño del vaso debe oscilar entre 20 y 60 micrómetros y el flujo sanguíneo debe ser suficiente.Antes de que ocurra la isquemia, deje que el tejido se estabilice durante 30 minutos. Posteriormente, realice una grabación de 30 segundos para establecer los valores basales de la rodadura y adherencia de los leucocitos. Coloque suavemente una pinza vascular bemer alrededor del extremo muy proximal del tejido cremaster expuesto utilizando fórceps de aplicación.Retire la pinza del vaso después de 30 minutos de isquemia. Se pueden realizar grabaciones posteriores durante todo el período de reperfusión. Para la cuantificación del rodamiento de leucocitos, defina una línea virtual que cruce verticalmente el vaso, la cual debe ser consistente en todos los registros.Cuente manualmente el número de leucocitos rodantes que pasan la línea dentro de los 30 segundos. Para la cuantificación de leucocitos adherentes, defina una sección vascular de 200 micrómetros que sea constante en todos los registros.Cuente el número de leucocitos claramente visibles que permanecen estáticos durante 30 segundos. Los resultados representativos se proporcionan dentro del protocolo escrito. Aunque la lesión por isquemia-reperfusión ha sido implicada en diversos sistemas orgánicos, aquí describimos un método para analizar la interacción leucocito-endotelial en la lesión por reperfusión del tejido muscular estriado.Por lo tanto, particularmente relevante para la cirugía de colgajo libre, ya que se asume que la lesión tisular post isquémica de otros órganos implica los mismos mecanismos inflamatorios. El método descrito puede utilizarse para obtener conocimientos fundamentales sobre los mecanismos patológicos en la lesión por isquemia-reperfusión. La inducción de isquemia en el músculo cremástero puede realizarse fácilmente y refleja perfectamente condiciones clínicamente relevantes, como la cirugía de colgajo libre.Además, modificaciones como la isquemia fría o la isquemia tibia o la superperfusión crónica con sustancias que influyen en la inflamación pueden aplicarse fácilmente. La inyección intraoral puede ser el método de elección cuando se necesita un tratamiento, horas o días antes de la grabación.

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Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.

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Microscopía intravital del cremáster microcirculación ratón M. ofrece un único y bien estandarizada-modelo in vivo para el análisis de médula ósea periférica migración de células madre en.

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Detallamos un protocolo para monitorizar el comportamiento de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas en estado estacionario e inflamatorio utilizando microscopía confocal intravital en ratones anestesiados.

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Este estudio demuestra la preparación quirúrgica del músculo cremaster de rata para la visualización de la capa libre de células in vivo. En este estudio se discuten factores considerables que afectan la precisión de la medición del ancho de la capa libre de celdas.

La visualización y cuantificación de la Capa libre de células en las arteriolas del músculo cremáster Rata

Este protocolo describe la inducción de un modelo de isquemia-reperfusión (IR) en la piel de oreja de ratón utilizando sujeción imán. El uso de un modelo de imágenes intravital hecha a la medida, se estudia en las respuestas inflamatorias in vivo después de la reperfusión. La razón fundamental detrás del desarrollo de esta técnica es extender la comprensión de cómo los leucocitos responden a la lesión IR piel.

La inducción de la lesión por isquemia-reperfusión en la piel de la oreja del ratón para intravital n fotones de imágenes de la respuesta inmune

Aquí, mostramos cómo realizar la microscopía intravital en los ventosos post-capilares del músculo cremaestro del ratón. Comúnmente aplicados a diferentes modelos de inflamación y sepsis, particularmente los inducidos por quimioquinas y citoquinas, destacamos su relevancia en el estudio de las muscolopatías que implican una infiltración exagerada de leucocitos musculares.

Infiltración de leucocitos del músculo cremaestro en ratones evaluado por microscopía intravital

La lesión por isquemia-reperfusión renal se asocia con una alta morbilidad y mortalidad en pacientes hospitalizados. Aquí, presentamos un modelo de ratón simple y efectivo de lesión unilateral por isquemia-reperfusión renal y proporcionamos una visión general secuencial de los cambios patológicos representativos observados en el riñón.

Un modelo de ratón eficaz de lesión unilateral por isquemia-reperfusión renal

El reclutamiento de leucocitos y plaquetas constituye un componente esencial necesario para el crecimiento efectivo de las arterias colaterales durante la arteriogénesis. La microscopía multifotónica es una herramienta eficiente para rastrear la dinámica celular con alta resolución espacio-temporal in vivo y menos fototoxicidad para estudiar el reclutamiento y extravasación de leucocitos durante la arteriogénesis.

Imágenes intravitales multifotónicas para la monitorización del reclutamiento de leucocitos durante la arteriogénesis en un modelo de extremidades posteriores murinas

El presente protocolo describe un modelo único y clínicamente relevante de enfermedad arterial periférica que combina la electrocoagulación de la arteria femoral y la vena con la administración de un inhibidor de la óxido nítrico sintasa para inducir gangrena de las extremidades posteriores en ratones FVB. La perfusión Intracardíaca DiI se utiliza para obtener imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie.

Imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie en un modelo de gangrena de extremidades posteriores murinas

Este protocolo presenta un método para inducir la lesión por isquemia-reperfusión mesentérica y visualizar trampas extracelulares (TNE) de neutrófilos en vénulas mesentéricas mediante microscopía intravital. El flujo sanguíneo en la arteria mesentérica superior se restringió durante 1 h, seguido de reperfusión, lo que permitió cuantificar directamente la adhesión leucocitaria y la NETosis.

Visualización de trampas extracelulares de neutrófilos en vénulas mesentéricas después de una lesión por isquemia-reperfusión mesentérica mediante microscopía intravital

Se utilizó un sistema láser de imagen con contraste de motas para monitorizar los cambios en el flujo sanguíneo microvascular renal durante la isquemia-reperfusión unilateral tras la resección del riñón derecho en ratones.

Perfusión microvascular monitorizada mediante imagen láser de contraste de speckles durante la lesión por isquemia renal-reperfusión en ratones

Aprende microscopía intravital digital para estudiar interacciones leucocito-endoteliales en lesión por isquemia-reperfusión del músculo cremáster de rata. Este protocolo permite visualizar procesos inflamatorios en tiempo real.

En tiempo real de imágenes digitales de los leucocitos del endotelio interacción en el daño por isquemia-reperfusión (IRI) del músculo cremáster Rata (Video) | JoVE Journal

En tiempo real de imágenes digitales de los leucocitos del endotelio interacción en el daño por isquemia-reperfusión (IRI) del músculo cremáster Rata

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