STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

본 프로토콜은 4 mL의 말초혈액으로부터 인간 유도만능줄기세포를 효율적으로 생성하는 방법을 보여줍니다. 0일 차에 말초혈액 샘플에서 단핵세포를 분리하고 배양합니다. 리프로그래밍 stem co 벡터를 사용하여 일차 세포를 형질도입합니다.

9일째에, 형질도입된 세포를 불활성화된 마우스 배아 섬유아세포 위에 플레이팅하고 약 3주 동안 배양합니다. 확장 및 특성 분석을 위해 HESC 유사 콜로니를 분리합니다. SSEA-4, TRA-1-60 및 TRA-1-81과 같은 다능성 마커의 발현에 대한 면역형광 염색 결과입니다.

유도 인간 다능성 줄기세포의 효율적인 생성 방법을 시연합니다. 인간 유도 다능성 줄기세포를 생성하기 위해 줄기세포 항바이러스 벡터를 사용하는 방식은 기존의 다른 방법들에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 아마도 가장 매력적인 점은 접근 방식의 전반적인 단순함일 것입니다. 이는 공여 조직에 대한 쉬운 접근이 필요하며, 여기서 말하는 조직이란 쉽게 얻을 수 있는 말초 혈액의 외래 성분을 의미합니다.

이 방법의 가장 중요한 속성은 리프로그래밍의 효율성과 획득한 IPS 세포 클론의 품질입니다. 절차 시연은 저희 실험실의 박사후 연구원인 Andrea January Summer와 George Murphy 실험실의 대학원생인 Sarah Rozelle이 맡아 진행하며, 모든 과정은 0일 차에 이루어집니다.

시트르산 나트륨이 포함된 vacutainer 세포 준비 튜브에 말초 혈액 4 mL를 채취합니다. 채혈 후 2시간 이내에 튜브를 8~10회 반전 혼합합니다. 단핵구를 수집하기 위해 상온에서 1,800 G로 30분 동안 샘플을 원심분리합니다.

혈장(plasma)을 흡입하여 제거하고, 겔 장벽과 혈장 사이에 형성된 세포층인 버피 코트(buffy coat)를 피펫으로 분취합니다. 버피 코트를 멸균된 15 milliliter 원추형 원심분리 튜브로 옮기고, 멸균된 PBS를 추가하여 총 부피를 10 milliliters로 맞춥니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 섞어준 후, 300 G에서 15분 동안 원심분리합니다.

세포 펠렛을 10 milliliters의 멸균 PBS에 재부유시켜 세포 수를 측정한 후, 1~2 × 10⁶개의 세포를 멸균된 15 milliliter 원추형 원심분리 튜브로 옮깁니다. 원심분리를 통해 세포를 수확하고 펠렛을 2 milliliters의 확장 배지에 재부유시킵니다. 그런 다음 분리된 단핵구를 12 Well 플레이트의 한 웰에 접종하고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다.

원심분리를 통해 남은 세포를 회수하고, 3일째와 6일째에 10% DMSO가 포함된 FBS를 사용하여 바이알당 약 2 × 10⁶개의 세포를 냉동 보관하십시오. 세포를 멸균된 15 milliliter 원추형 튜브로 옮기고, QBSF 60 줄기세포 배지 1 milliliter로 웰을 한 번 세척하십시오. 이는 부착 세포를 수집하기 위함입니다.

원심분리를 통해 세포를 수확하고, 세포 펠릿을 2 mL의 em에 재현탁합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 12 웰 플레이트의 한 웰로 옮기고, 9일 차에 배양물을 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 세포를 멸균된 15 mL 원추형 튜브로 옮기고, 웰을 1 mL의 QB SF 60 줄기세포 배지로 한 번 세척하여 부착 세포를 수집합니다. 배양물을 300 G에서 10분 동안 원심분리합니다.

다음으로, 5 µg/mL의 poly brain과 MOI 1~10의 STEM 렌티바이러스가 포함된 신선한 EM 1 mL에 세포 펠렛을 재부유시킵니다. 그런 다음 현탁액을 12웰 플레이트의 한 웰로 옮기고 25 °C에서 2,250 RPM으로 90분 동안 원심분리합니다. 5 µg/mL의 poly brain이 포함된 신선한 EM 1 mL를 추가하여 총 2 mL의 EM을 맞춘 후, 10일 차에 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.

앞서 설명한 대로 세포를 수확한 후, 세포 펠렛을 2 mL의 EM 배지에 다시 현탁합니다. 11일째에 12-well 플레이트의 한 well에 있는 형질전환된 세포를 사용하며, 6-well 플레이트의 well을 0.1% gelatin으로 코팅한 다음, 불활성화된 마우스 배아 섬유아세포를 well당 2 × 10⁵ cells의 밀도로 meth 배지에 분주합니다. 감염당 3개의 well을 준비합니다.

다음 날, 앞서 설명한 대로 형질전환된 단핵세포를 수확합니다. 원심분리 후, bFGF, 아스코르브산 및 성장인자가 포함된 meth 배지 3 mL에 세포 펠렛을 재부유시킵니다.

이제 MES 플레이트에서 배지를 흡입하여 제거하고, 웰당 1 mL의 MCs용 OFM을 넣습니다. 그 다음 1.5 mL의 완전한 meth 배지를 추가하고, 플레이트를 25 °C에서 500 RPM으로 30분 동안 원심 분리합니다. 이후 37 °C, 5% CO2 조건에서 2일 동안 배양하며, 이 과정을 14일째부터 계속 수행합니다.

BFGF 10 nanograms per milliliter와 아스코르브산 50 micrograms per milliliter를 포함하고 성장 인자는 포함되지 않은 meth 배지 2.5 milliliters를 이틀마다 보충합니다. 약 20일경 작은 콜로니가 나타나면, 30일에서 40일 사이에 인간 배아줄기세포 배지 2 milliliters를 매일 공급합니다. 각 콜로니를 채취하여 HESC 배지 1 milliliter와 rock 억제제가 포함된 불활성화된 maths가 미리 준비된 12 Well 플레이트의 개별 웰로 옮기고 세포에 매일 배지를 공급합니다.

그 후 록 억제제(rock inhibitor)가 없는 HESC 배지 1 mL를 사용하여, 인간 단핵구 유래 다능성 줄기세포를 다능성 마커의 면역형광 염색 및 통합된 재프로그래밍 카세트의 제거에 사용할 수 있도록 준비합니다. 본 프로토콜 동안, 세포는 P BMC에서 인간 iPSC 생성에 이르기까지 여러 형태학적 변화를 거치게 됩니다. 0일차에 말초혈액에서 분리한 단핵구는 9일 후에 증식 배지에서 배양됩니다.

세포 군집이 포도 송이와 같은 형태로 관찰되며, 이는 트랜스덕션 전 세포들이 건강하게 증식하고 있음을 시사합니다. 세포를 MA에 도말한 후 약 21일째에 콜로니가 형성됩니다. 30일째에 iPSC 콜로니는 전형적인 인간 배아줄기세포 유사 형태를 나타냅니다.

PBMC로부터 생성된 IPC의 면역형광 분석 결과, 다능성 마커인 SSEA 4, TRA-1-60 및 TRA-1-81의 발현이 확인되었습니다. 또한, 이 iPSC들은 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)에 대해 양성 반응을 보였습니다. 이 이미지들은 Summers 등(2010)이 설명한 바와 같이, CRE 재조합효소와 puromycin 저항성 유전자를 공동 발현하는 플라스미드를 형질전환하여 외래 유전자가 제거된(transgene-free) IPC를 생성하는 단계를 보여줍니다. 형질전환 전의 IPC와 비교하여 세포 사멸이 관찰됩니다.

퓨로마이신(puromycin) 선택을 2일간 진행한 후, 형질전환 약 10일 뒤에 내성 세포로부터 새로운 콜로니가 생성됩니다. 선택된 콜로니에 대해 서던 블롯(Southern blot) 분석을 수행하여 트랜스진(transgene)의 제거를 확인합니다. 레인 1, 3, 5, 7은 트랜스진 제거 전 iPSC 클론에 트랜스진이 존재함을 보여줍니다. 이러한 밴드들은 트랜스진 제거 후 레인 2, 4, 6, 8에서는 나타나지 않습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 어떤 개인의 소량의 말초혈액으로부터 고품질의 정상 또는 질환 특이적 인간 iPS 세포를 일관되고 안정적으로 생성할 수 있게 될 것입니다.

이 접근 방식은 rep 프로그래밍 과정을 단순화하여 줄기세포 연구 커뮤니티에서 널리 활용할 수 있도록 합니다. 동시에, 더욱 균질한 줄기세포주 집단을 생성하기 위한 기준을 제공합니다.