마이크로 유체 문화 플랫폼에 Glia 상호 작용 (MCP) 기반 Neuronal 축삭과 Glia 공동 문화 시스템에 신경의 영상 분석

본 프로토콜은 고해상도 이미징을 통해 뉴런과 글리아 세포 간의 상호작용을 분석하기 위한 새로운 신경세포 축삭 및 성상교세포 공동 배양 플랫폼을 구축합니다. 먼저, 미세유체 배양 챔버를 조립하고 신경세포 배양물을 준비한 후, 신경세포 축삭이 MCP의 반대편으로 진입하도록 유도합니다. 그다음, 배양된 성상교세포를 추가하여 구획화된 공동 배양 시스템을 구축하며, 공초점 면역형광 현미경을 이용한 타임랩스 이미징 등의 결과를 통해 축삭, 성상교세포 및 신경세포 축삭 사이의 상호작용을 이해할 수 있습니다.

우리는 처음 이 방법의 아이디어를 GT one 조절에 대한 뉴런 돌기(neuronal process)의 영향과 뉴런 분비(neuronal secretion)의 영향을 분리하여 확인하려 할 때 얻었습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 Axon을 세포 구획의 다른 부분으로 유도하는 데 어려움을 겪습니다. 이를 위해서는 뉴런 측에 건강한 뉴런이 고밀도로 도말되어야 하며, 특히 중앙 채널 근처에 뉴런이 배치되어야 합니다.

MCP 오픈 챔버는 서로 다른 유형의 세포를 구획화하여 배양하도록 설계되었으며, 공배양 시 뉴런과 성상교세포를 플레이팅하기 위해서는 폴리우레탄 및 라미닌 코팅이 필요합니다. 먼저, 멸균된 유리 바닥 디쉬에 1 mg/mL 폴리우레탄 용액을 도포하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 코팅된 유리 바닥 디쉬를 2중 증류수로 3회 세척한 후, 멸균 흄 후드 내에서 건조시킵니다.

다음으로, 1 mg/mL 농도의 laminin으로 디쉬를 코팅하고 UV 램프 아래에서 1시간 동안 건조합니다. 유리 바닥 디쉬 위의 MCP 조립체는 사용 직전에 준비해야 합니다. 중앙 연결 채널이 아래쪽으로 향하도록 미세유체 배양 플랫폼을 배치하고, 코팅된 유리와 밀착시켜 밀봉합니다.

바닥 디쉬. 조립된 MCP의 양쪽에 일반 뉴런 또는 성상교세포 배양액을 첨가합니다. 챔버를 37 °C에서 2~4시간 동안 배양하고, MCP와 유리 사이에 누수가 없는지 확인합니다.

하단 접시. 피질 신경세포 배양물은 배아 14~16일 된 마우스 뇌에서 새로 준비합니다. 마우스 뇌를 박리한 후, 해부 현미경 하에서 피질의 뇌막을 제거합니다.

면도날을 사용하여 조직을 작은 블록 형태로 잘게 다진 후, 원심 분리한 다음 튜브에 넣습니다. 펠릿 위의 배지를 제거하고 0.05% Trypsin을 첨가하여 37 °C 항온수조에서 10분 동안 반응시킵니다. 화염 연마된 파스퇴르 피펫으로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 분리합니다.

70 micron 스트레이너에 샘플을 통과시켜 맑은 신경 세포 현탁액을 수집한 후, 5% FBS가 보충된 뉴런 플레이팅 배지를 사용하여 접종합니다. 조립된 MCP 플레이트의 우측에 150 microliters의 뉴런을 분주합니다.

세포 유지 영역에 부착된 뉴런만이 조립된 MCP의 중앙 채널을 통해 반대편으로 축삭을 성장시킬 수 있으므로, 뉴런을 고밀도로 배치합니다. 다음 날, 챔버의 세포 도말 영역에서 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 뉴런 도말 배지를 일반 뉴런 배양 배지로 교체합니다.

배지에 20 ng/mL의 glial derived neurotrophic factor 또는 GDNF를 챔버의 성상교세포 쪽에 첨가합니다. 이렇게 하면 화학적 구배가 형성되어 조립된 MCP의 중앙 채널을 가로질러 신경세포 쪽에서 축삭이 성장하도록 유도하는 데 도움이 됩니다. 이틀 후, 중앙 채널로 진입하는 축삭이 있는지 관찰합니다.

축삭이 중앙 채널로 진입하면, 보통 하루 이내에 반대편으로 진입합니다. 축삭은 반대편에 진입한 후 최소 일주일 동안은 정상적으로 유지됩니다. P1~3 마우스의 뇌를 해리한 후, 폴리우레탄이 코팅된 10 cm 디쉬에 성상교세포를 분주합니다.

세포를 하룻밤 동안 배양하고, 이후 이틀 동안은 매일 성상교세포 배양액을 보충하며, 7일 후 성상교세포가 90% 융합 단층(confluent monolayer)을 형성하면 3일에 한 번씩 보충합니다. 그 후 trypsin을 사용하여 세포를 회수합니다. 뉴런을 도말한 지 약 5일 후에 GDNF를 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 재부유시킨 성상교세포 150 µL를 조립된 MCP의 왼쪽에 파종합니다. 성상교세포를 재파종한 후, 축삭이 막 진입하려고 하거나 막 진입했을 때, 조립된 MCP의 왼쪽으로 진입한 축삭은 직접적인 축삭 접촉 또는 수용성 인자의 방출을 통해 성상교세포와 직접 상호작용합니다.

성상교세포가 세포 유지 영역에 부착되었는지 모니터링합니다. 구획화된 공동 배양 시스템 내의 세포를 면역 염색하여 축삭과 성상교세포 간의 상호작용에 관여하는 단백질과 같은 특정 단백질을 시각화합니다. 구획화된 뉴런 및 성상교세포 공동 배양 시스템을 통해 뉴런의 돌기, 특히 축삭만이 선택적으로 성상교세포와 상호작용할 수 있습니다.

본 논문에서는 축삭에 의해 유도된 성상교세포 글루타메이트 운반체의 전사 활성화에 대해 설명합니다. 본 연구에는 GT1 게놈 프로모터의 제어 하에 EGF 형광 리포터가 발현되는 형질전환 마우스가 사용되었습니다. 조립된 MCPA의 세포 유지 영역에 고밀도의 뉴런을 배양하였으며, 확대된 모습은 축삭이 중앙 채널을 가로질러 반대편으로 진입하는 것을 보여줍니다. beta 3 tubulin 염색을 통해 축삭 성장 원추를 확인할 수 있습니다.

MCP 시스템을 통해 축삭 다발이 중앙 채널을 통해 성장하여 반대편으로 진입하는 과정을 모니터링할 수 있습니다. GLT-1 면역 염색을 통해 MCP 시스템의 글리아 층에서 성상교세포를 식별하였습니다. 이미지는 여기서 축삭과 GLT-1 양성 성상교세포 사이의 접촉을 보여줍니다.

EGFP 리포터의 발현은 내인성 GT one 프로모터의 활성화, 단백질 발현 및 기능적 활성과 상관관계가 있습니다. C two의 단일 성상교세포에서 GT one 프로모터 활성을 평가한 결과, 구획화된 공동 배양 시스템에서 GLT one 면역반응성이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. 중요한 점은, MCP 시스템을 통해 타임랩스 이미지를 촬영함으로써 역동적인 변화를 모니터링할 수 있다는 것입니다.

예를 들어, 이 데이터는 성상교세포를 도말한 지 하루 후, GT1 EGFP 성상교세포와 야생형 뉴런을 함께 배양했을 때 축삭에 의해 GT1 프로모터가 활성화되었음을 보여줍니다. EGFP 형광은 매우 최소한으로 관찰됩니다. 공동 배양 48시간 후, 축삭이 성상교세포 쪽으로 충분히 뻗어 나가 이곳에서 성상교세포와 직접 접촉하여 상호작용하게 되면 EGFP 강도가 유의미하게 증가합니다.

조립된 MCP의 뉴런 측에 Kinine 처리를 하면 뉴런 세포 사멸이 유도되었습니다. 흥미롭게도, 이는 축삭의 퇴행 및 퇴화뿐만 아니라 축삭의 EGFP 형광 감소 또한 자극했습니다. 축삭에 반응하여 나타난 이러한 EGFP 형광 강도의 역동적인 변화는 Astroglia GT one 프로모터 활성이 축삭 상호작용에 의해 조절된다는 것을 명확히 보여주었습니다.

이 영상을 시청하고 나면 미세유체 배양 플랫폼을 사용하여 코어 배양 시스템을 구축하는 방법을 충분히 이해하게 될 것이며, 이 기술을 숙달하면 며칠 내에 적절히 수행할 수 있습니다.