마이크로 유체 문화 플랫폼에 Glia 상호 작용 (MCP) 기반 Neuronal 축삭과 Glia 공동 문화 시스템에 신경의 영상 분석

이 연구는 소설 neuronal 축삭과 (천체) glia 공동 문화 플랫폼을 설정하는 절차를 설명합니다. 이 공동 문화 시스템에서 하나의 축삭 (및 단일 glial 세포) 사이의 직접 상호 작용 조작은 glial 신호에 대한 상호 신경 세포의 기계론의 분석을 수 있도록 가능한된다.

이 프로토콜은 고해상도 이미징을 사용하여 뉴런과 ggl 간의 상호 작용을 분석하기 위해 새로운 뉴런 축삭 및 Astroglia 공동 배양 플랫폼을 구축합니다. 먼저, 미세유체 배양실을 조립하고 신경세포 배양을 준비하며 신경세포 축삭돌기가 MCP의 반대편으로 들어가도록 유도합니다. 다음으로, 배양된 성상세포를 추가하여 구획화된 공동 배양 시스템 결과를 확립하며, 컨포칼 면역형광 현미경을 사용한 타임 랩스 이미징을 포함하여 축삭돌기, 성상아교세포 및 신경 축삭돌기 간의 상호 작용을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

우리는 GT one regulation에 대한 신경 세포 과정과 신경 세포 분비의 효과를 분리하려고 할 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 축삭을 세포 구획의 다른 부분으로 유도하는 데 어려움을 겪을 것입니다. 이를 위해서는 뉴런 쪽에 도금된 건강한 뉴런의 밀도가 높고 뉴런은 중앙 채널 근처에 도금되어 있어야 합니다.

MCP 오픈 챔버는 다양한 유형의 세포의 구획 배양을 위해 설계되었으며, 폴리우레탄 및 라미닌 코팅은 공동 배양에서 뉴런과 성상세포를 도금하는 데 필요합니다. 먼저, 멸균 유리 바닥 접시에 밀리리터당 1밀리그램의 폴리우레탄 용액을 바르고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 코팅된 유리 바닥 접시를 이중 증류수로 세 번 세척한 다음 멸균 흄 후드 아래에 놓아 건조시킵니다.

다음으로, 접시에 밀리리터당 1밀리그램, 라미닌을 바르고 자외선에서 1시간 동안 건조시킵니다. 유리 바닥 접시에 MCP를 조립하는 것은 사용하기 전에 갓 준비해야 합니다. 중앙 연결 채널이 바닥면에 있는 미세유체 배양 플랫폼을 배치하고 코팅된 유리로 단단히 밀봉합니다.

바닥 요리. 조립된 MCP의 양쪽에 일반 뉴런 또는 성상세포 배양 배지를 추가합니다. 섭씨 37도에서 2-4시간 동안 챔버를 배양하고 MCP와 유리 사이에 누출이 없는지 확인합니다.

바닥 접시. 코르티코 신경 세포 배양은 14일에서 16일 된 배아 쥐의 뇌에서 신선하게 준비됩니다. 쥐의 뇌를 해부한 후, 해부 현미경으로 피질의 수막을 제거합니다.

면도날을 사용하여 조직을 작은 조직 블록으로 다지고 원심분리 후 다진 조직 블록을 튜브에 넣습니다. 펠릿 위의 매체를 버리고 0.05%를 추가합니다.10분 동안 시도하고 섭씨 37도의 수조를 사용합니다. 불에 닦인 파스타 피펫으로 부드럽게 가열하여 세포를 해리합니다.

샘플을 70미크론 스트레이너에 통과시켜 뉴런 도금을 사용하여 투명한 뉴런 세포 현탁액을 수집합니다. 5%FBS 종자가 보충된 배지. 조립된 MCP 플레이트의 오른쪽에 있는 150마이크로리터의 뉴런.

세포 보유 영역에 부착되는 뉴런만이 중앙 채널을 통해 축삭을 조립된 MCP의 반대편으로 성장시킬 수 있기 때문에 높은 밀도의 뉴런. 다음 날에. 챔버의 세포 도금 영역에서 배지를 조심스럽게 흡인하고 뉴런 도금 배지를 일반 뉴런 배양으로 교체합니다.

매체, 밀리리터당 20나노그램, 신경교세포 유래 신경 영양 인자 또는 GDNF를 챔버의 성상세포 쪽에 추가합니다. 이것은 조립된 MCP의 중앙 채널을 가로질러 뉴런 쪽에서 축삭 성장기를 유도하는 데 도움이 되는 화학적 구배를 생성합니다. 이틀 후 중앙 채널로 들어가는 축삭을 모니터링합니다.

축삭돌기가 중앙 채널로 들어가면 보통 하루 이내에 반대편으로 들어갑니다. 축삭돌기는 일반적으로 반대편에 들어간 후 최소 일주일 동안은 손상되지 않습니다. 나는 P 1에서 3 개의 마우스 퍼프에서 뇌를 해리 한 후 성상 세포를 폴리 우레탄으로 코팅 된 10cm 접시에 뿌립니다.

배양, 세포는 하룻밤 사이에 다음 이틀 동안 매일 성상세포 배양 배지를 보충하고, 7일 후 성상세포가 트립신을 사용하여 90% 융합 단층 수확 세포를 형성하면 3일에 한 번씩 뉴런이 도금된 후 약 5일 후에 GDNF를 흡인합니다. 그런 다음 150마이크로리터의 재현유탁된 성상세포를 조립된 MCP의 왼쪽에 파종합니다. 축삭돌기가 성상세포에 들어가려고 하거나 성상세포의 재생이 끝난 후 막 들어갔을 때, 조립된 MCP의 왼쪽으로 들어간 축삭돌기는 직접적인 축삭 접촉 또는 용해성 인자의 방출을 통해 성상세포와 직접 상호 작용합니다.

성상세포가 세포 보유 영역에 부착되어 있는지 모니터링합니다. 구획화된 공동 배양 시스템의 세포를 면역염색하여 축삭돌기와 성상세포 사이의 상호 작용에 관여하는 단백질과 같은 특정 단백질을 시각화합니다. 구획화된 뉴런 및 성상세포 공동 배양 시스템은 뉴런 과정, 특히 축삭돌기만이 성상세포와 선택적으로 상호 작용할 수 있도록 합니다.

여기서 우리는 astroglia glutamate transporter의 축삭 유도 전사 활성화에 대해 설명합니다. 이러한 연구는 GT one 게놈 프로모터의 제어 하에 EGF 형광 리포터의 발현을 가진 형질전환 마우스를 사용합니다. 조립된 MCPA의 세포 보유 영역에서 고밀도의 뉴런이 배양되며, 확대 보기는 축삭돌기가 중앙 채널을 가로질러 반대편으로 들어가는 것을 보여주며, 베타 3 튜불린 염색으로 축삭돌기 성장 원뿔을 드러냅니다.

MCP 시스템은 축삭돌기가 중앙 채널을 통해 성장하여 반대편으로 들어갈 때 이를 모니터링할 수 있습니다. GT one에 대한 Immunos 염색은 MCP 시스템의 신경교세포(glial side)에서 성상세포를 식별합니다. 이미지는 축삭돌기와 GLT 1 양성 성상세포의 접촉을 보여줍니다.

EGFP 리포터의 발현은 내인성 GT one 프로모터 활성화, 단백질 발현 및 기능적 활성과 상관관계가 있습니다. C 2의 단일 성상세포에서 GT one promoter 활성을 평가한 결과, 구획화된 공동 배양 시스템에서 GLT one 면역반응이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. 중요한 것은 MCP 시스템을 통해 타임랩스 이미지가 동적 변화를 모니터링할 수 있다는 것입니다.

예를 들어, 이러한 데이터는 성상세포를 도금한 지 하루 후에 축삭돌기가 GT one EGFP 성상세포와 야생형 뉴런을 유도했음을 보여줍니다. 매우 최소한, EGFP 형광이 관찰됩니다. EGFP 강도는 축삭돌기가 성상세포 쪽으로 잘 들어가 여기에서 성상세포와 직접 접촉할 때 공동 배양 후 48시간 후에 크게 증가합니다.

조립된 MCP의 신경 측에서 키닌 처리는 신경 세포 사멸을 유도했습니다. 흥미롭게도, 그것은 또한 축삭 수축 및 퇴화뿐만 아니라 축삭 EGFP 형광의 감소를 자극했습니다. 축삭돌기에 대한 반응으로 EGFP 형광 강도의 이러한 동적 변화는 Astroglia GT one 프로모터 활성이 축삭돌기 상호작용에 의해 조절된다는 것을 분명히 보여주었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 미세유체 배양 플랫폼을 사용하여 핵심 배양 시스템을 구축하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.일단 숙달되면 이 기술을 며칠 안에 제대로 수행할 수 있습니다.