마이크로 유체 문화 플랫폼에 Glia 상호 작용 (MCP) 기반 Neuronal 축삭과 Glia 공동 문화 시스템에 신경의 영상 분석

본 프로토콜은 고해상도 이미징을 통해 뉴런과 글리아(glia) 간의 상호작용을 분석하기 위한 새로운 뉴런 축삭 및 성상교세포(Astroglia) 공동 배양 플랫폼을 구축합니다. 먼저, 미세유체 배양 챔버(MCP)를 조립하고 뉴런 배양물을 준비한 후, 뉴런 축삭이 MCP의 반대편으로 진입하도록 유도합니다. 다음으로, 배양된 성상교세포를 추가하여 구획화된 공동 배양 시스템을 구축합니다. 공초점 면역형광 현미경을 이용한 타임랩스 이미징을 포함한 분석 결과는 축삭, 성상교세포 및 뉴런 축삭 간의 상호작용을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

우리는 처음 이 방법의 아이디어를 GT-1 regulation에 미치는 뉴런 돌기의 영향과 뉴런 분비의 영향을 분리하여 분석하려 할 때 얻게 되었습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 축삭을 세포 구획의 다른 부분으로 유도하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 이를 위해서는 뉴런 측에 건강한 뉴런을 고밀도로 도말해야 하며, 특히 중앙 채널 근처에 뉴런이 배치되어야 합니다.

MCP 오픈 챔버는 다양한 유형의 세포를 구획화하여 배양할 수 있도록 설계되었습니다. 공배양 시 뉴런과 성상교세포를 플레이팅하기 위해서는 폴리우레탄 및 라미닌 코팅이 필요합니다. 먼저, 멸균된 글래스 바텀 디쉬에 1 mg/mL 폴리우레탄 용액을 도포하고 37 °C에서 하룻밤 동안 인큐베이션합니다. 코팅된 글래스 바텀 디쉬를 2차 증류수로 3회 세척한 후, 멸균 흄 후드 내에서 건조시킵니다.

다음으로, 디쉬를 1 mg/mL 농도의 laminin으로 코팅하고 UV 라이트 아래에서 1시간 동안 건조하십시오. 유리 바닥 디쉬 위의 MCP 조립체는 사용 직전에 준비해야 합니다. 중앙 연결 채널이 바닥면으로 향하게 하여 미세유체 배양 플랫폼을 배치하고, 코팅된 유리와 단단히 밀봉하십시오.

하단 디쉬. 조립된 MCP의 양측에 일반 뉴런 또는 성상교세포 배양 배지를 추가합니다. 챔버를 37 °C에서 2~4시간 동안 배양하고 MCP와 유리 사이에 누수가 없는지 확인합니다.

하단 접시. 피질 뉴런 세포 배양물은 배아 14~16일 된 마우스 뇌에서 신선하게 준비합니다. 마우스 뇌를 적출한 후, 해부 현미경 하에서 피질의 수막을 제거합니다.

면도날을 사용하여 조직을 작은 조직 블록으로 잘게 다진 후, 원심분리 후 튜브에 넣습니다. 펠릿 위의 배지를 제거하고 0.05% Trysin을 추가하여 37 °C 항온수조에서 10분 동안 반응시킵니다. 화염 연마된 파스퇴르 피펫으로 부드럽게 교반하여 세포를 해리시킵니다.

뉴런 플레이팅용 배지에 5% FBS를 첨가하여 준비한 후, 샘플을 70 micron 스트레이너에 통과시켜 맑은 뉴런 세포 현탁액을 수집합니다. 조립된 MCP 플레이트의 우측에 뉴런 150 microliters를 분주합니다.

조립된 MCP의 중앙 채널을 통해 반대편으로 축삭을 성장시킬 수 있는 것은 세포 유지 영역에 부착된 뉴런뿐이므로, 높은 밀도의 뉴런이 필요합니다. 다음 날, 챔버의 세포 도말 영역에서 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 뉴런 도말 배지를 일반 뉴런 배양 배지로 교체하십시오.

배지에 20 ng/mL의 신경교 유래 신경영양인자(glial derived neurotrophic factor, GDNF)를 챔버의 성상교세포 쪽에 첨가합니다. 이를 통해 화학적 구배를 형성하여 조립된 MCP의 중앙 채널을 가로질러 신경세포 쪽에서 축삭이 성장하도록 유도합니다. 이틀 후, 중앙 채널로 진입하는 축삭이 있는지 관찰합니다.

축삭이 중앙 채널로 진입하면, 보통 하루 이내에 반대편으로 진입합니다. 축삭은 반대편으로 진입한 후 최소 일주일 동안은 일반적으로 온전한 상태를 유지합니다. P1~3 마우스의 뇌를 해리한 후, 폴리우레탄이 코팅된 10 centimeter 디쉬에 성상교세포를 분주합니다.

세포를 하룻밤 동안 배양하고, 이후 이틀 동안은 매일 성상교세포 배양액을 보충하며, 7일 후 성상교세포가 90% 밀도의 단층을 형성하면 3일마다 한 번씩 보충합니다. 트립신을 사용하여 세포를 수확합니다. 뉴런을 플레이팅한 지 약 5일 후에 GDNF를 흡입하여 제거합니다. 그 다음, 재부유시킨 성상교세포 150 µL를 조립된 MCP의 왼쪽에 파종합니다. 성상교세포를 재파종한 후 액손이 진입하기 직전이거나 막 진입했을 때, 조립된 MCP의 왼쪽으로 진입한 액손은 직접적인 액손 접촉 또는 수용성 인자의 방출을 통해 성상교세포와 직접 상호작용합니다.

별아교세포가 세포 유지 영역에 부착되었는지 확인하십시오. 구획화된 공동 배양 시스템 내의 세포를 면역 염색하여 축삭과 별아교세포 간의 상호작용에 관여하는 단백질과 같은 특정 단백질을 시각화하십시오. 구획화된 뉴런 및 별아교세포 공동 배양 시스템을 통해 뉴런의 돌기, 특히 축삭만이 선택적으로 별아교세포와 상호작용할 수 있습니다.

본 연구에서는 축삭에 의해 유도되는 성상교세포 글루타메이트 운반체의 전사 활성화를 기술합니다. 이 연구에는 GT1 게놈 프로모터의 제어 하에 EGF 형광 리포터가 발현되는 형질전환 마우스가 사용되었습니다. 조립된 MCPA의 세포 유지 영역에 고밀도의 뉴런을 배양하였으며, 확대된 보기에서는 축삭이 중앙 채널을 가로질러 반대편으로 진입하는 모습이 나타납니다. beta-III tubulin 염색을 통해 축삭 성장 원추(growth cone)를 확인할 수 있습니다.

MCP 시스템을 통해 축삭 다발이 중앙 채널을 통해 성장하여 반대편으로 진입하는 과정을 모니터링할 수 있습니다. GLT-1에 대한 면역 염색을 통해 MCP 시스템의 글리아(glial) 측에서 성상교세포가 형성되었음을 확인하였습니다. 이미지는 여기서 축삭과 GLT-1 양성 성상교세포 사이의 접촉을 보여줍니다.

EGFP 리포터의 발현은 내인성 GT one 프로모터 활성화, 단백질 발현 및 기능적 활성과 상관관계가 있습니다. C two의 단일 성상교세포에서 GT one 프로모터 활성을 평가한 결과, 구획화된 공동 배양 시스템에서 GLT one 면역 반응성이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. 중요한 점은, MCP 시스템을 통해 타임랩스 이미지를 촬영함으로써 동적인 변화를 모니터링할 수 있다는 것입니다.

예를 들어, 이 데이터는 EGFP를 발현하는 GT1-S1 성상세포와 야생형 뉴런을 함께 배양한 지 하루 후, 축삭에 의해 유도된 GT1-S1 프로모터 활성화를 보여줍니다. EGFP 형광은 매우 최소한으로 관찰됩니다. 공동 배양 48시간 후 축삭이 성상세포 쪽으로 충분히 뻗어 나와 성상세포와 직접 접촉하며 상호작용할 때 EGFP 강도가 유의하게 증가합니다.

조립된 MCP의 뉴런 쪽에 키니네(kinine)를 처리한 결과, 뉴런 세포 사멸이 유도되었습니다. 흥미롭게도, 이는 축삭의 EGFP 형광 감소뿐만 아니라 축삭의 퇴축 및 퇴행 또한 자극하였습니다. 축삭에 반응하여 나타난 이러한 EGFP 형광 강도의 역동적인 변화는 Astroglia GT 1 프로모터 활성이 축삭 상호작용에 의해 조절된다는 것을 명확히 보여주었습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 미세유체 배양 플랫폼을 사용하여 각막 배양 시스템을 구축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 며칠 내에 적절하게 수행할 수 있습니다.