축삭 손상 모델 구성 및 다중 오믹스 분석 가능을 위한 미세유체 칩

이 프로토콜은 축삭 손상 후 신경 대사 역학을 모델링하는 미세유체 시스템을 설명하여 내재 대사 리모델링의 이미징, 다중 오믹스 분석 및 기계론적 연구를 가능하게 합니다.

우리는 축삭 손상 후 뉴런의 대사 메커니즘을 설명하기 위해 멀티오믹스 분석을 가능하게 하는 대규모 미세유체 칩을 개발했습니다. 우리는 주로 미세유체 기술, 대사 플럭스 분석 및 전사체학을 활용하여 축삭 손상 및 재생 중 뉴런의 대사 메커니즘에 대한 연구를 발전시킵니다. 우리는 발달 질환에 따라 피질 뉴런 간에 대사 차이가 있으며, 젊은 뉴런은 외부 손상 후 대사 리모델링을 겪는다는 것을 발견했습니다.

우리 프로토콜의 핵심 이점은 수백만 개의 세포에 대한 정확한 멀티오믹스와 크기를 가능하게 하는 대규모 미세유체 플랫폼 설계 및 운영 표준에 있습니다. 시작하려면 PDMS 베이스와 경화제를 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 혼합물이 들어 있는 원심분리기 튜브를 원심 교반기 믹서에 넣습니다.

2, 000 G에서 4분 동안 두 번 원심분리하여 혼합하고 가스를 제거합니다. 13-15g의 탈기된 PDMS를 미세유체 금형에 부어 금형 바닥이 완전히 덮이도록 합니다. 이제 금형을 진공 데시케이터에 넣은 다음 진공 펌프를 사용하여 5-10분 동안 공기를 배출하여 PDMS에서 기포를 완전히 제거합니다.

고무 전구를 사용하여 PDMS의 표면을 가볍게 두드려 남아 있는 표면 기포를 부수십시오. 금형을 컨벡션 오븐으로 옮기고 섭씨 80도에서 100분 동안 구워 폴리디메틸실록산을 경화시킵니다. PDMS가 완전히 경화되면 메스 끝을 PDMS 가장자리 아래로 부드럽게 밀어 조심스럽게 들어 올려 금형에서 분리합니다.

직경 2.0-2.5mm의 생검 펀치를 사용하여 배양 배지 주입 및 세포 로딩을 위해 PDMS에 구멍을 만듭니다. 접착 테이프를 사용하여 PDMS에서 표면 불순물을 제거한 다음 깨끗한 유리 접시에 넣고 알루미늄 호일로 싸서 보관합니다. 실험 전에 미세유체 장치를 섭씨 121도 및 101킬로파스칼에서 5분 동안 오토클레이브하여 무균을 보장합니다.

기존의 미세유체 장치용 커버 슬립을 35mm 배양 접시에 놓습니다. 접시에 밀리리터당 0.1밀리그램의 폴리-D-라이신 용액 2밀리리터를 추가합니다. 접시를 섭씨 37도에서 6시간 또는 밤새 배양합니다.

배양 후 재사용 또는 적절한 폐기를 위해 폴리-D-라이신 용액을 조심스럽게 회수하십시오. 이제 접시에 멸균 초순수 2밀리리터를 추가합니다. 시계 방향으로 50번 돌린 다음 시계 반대 방향으로 50번 돌립니다.

멸균 피펫 팁에 연결된 진공 펌프를 사용하여 물을 흡입하고 액체 폐기물 용기에 폐기물을 수집합니다. 모든 세척이 완료된 후 사용하기 전에 커버 슬립을 생물 안전 캐비닛에서 자연 건조시키십시오. 멸균 미세 팁 겸자를 사용하여 고압멸균된 미세유체 칩을 마이크로채널이 아래쪽을 향하도록 유리 표면 중앙에 놓습니다.

200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 칩을 유리 표면에 부드럽게 눌러 완전한 접착을 보장합니다. 그런 다음 영구 마커를 사용하여 왼쪽 챔버에 점을 표시하여 체세포 구획을 지정합니다. 10마이크로리터 피펫으로 10마이크로리터의 신경 현탁액을 흡인한 다음 현탁액을 표시된 체세포 구획 위의 로딩 포트에 천천히 분배합니다.

왼쪽 챔버의 하부 저장소로 유체가 제대로 흐르는지 확인합니다. 배양 접시를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소로 설정된 가습 인큐베이터에 20분 동안 옮깁니다. 배양 후, 접시를 20X 현미경 아래에 놓아 마이크로채널을 통해 체세포 구획에서 축삭 구획까지의 배지 풍부함을 확인합니다.

이제 150마이크로리터의 신경 기저 배지를 축삭 구획의 상부 포트에 피펫팅합니다. 유사하게, 150마이크로리터의 완전한 뉴런 배지를 체세포 구획의 상부 포트에 추가합니다. 다음으로, 20mm 배양 접시에 150ml의 초순수를 부어 습도 챔버를 만듭니다.

35mm 배양 접시를 큰 접시 안에 놓은 다음 전체 배양 시스템을 인큐베이터로 옮기고 필요한 시간 동안 유지합니다. 대규모 미세유체 장치를 배치하기 위해 10cm 너비의 페트리 접시를 사용하십시오. 각 방법에는 서로 다른 축삭 손상 프로토콜이 필요하므로 실험적 필요에 따라 전체 채널 또는 간격 채널 시딩을 선택하십시오.

파종이 완료된 후 뉴런 성장을 유지하기 위해 페트리 접시에 5밀리리터의 완전 뉴런 배양 배지를 추가합니다. 나중에 사용할 수 있도록 적절한 양의 신경 기저 배지를 새로운 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 피질 뉴런이 포함된 미세유체 장치를 깨끗한 벤치에 놓습니다.

보푸라기가 없는 종이를 사용하여 35mm 배양 접시의 바닥을 건조시킨 다음 200마이크로리터 피펫을 사용하여 미세유체 장치의 두 오른쪽 구멍에서 배지를 흡인합니다. 그런 다음 진공 펌프 튜브를 멸균된 필터가 없는 200마이크로리터 피펫 팁에 연결합니다. 분당 60리터의 흡입 속도로 진공 펌프를 켜고 축삭 단말 챔버의 하단 구멍과 챔버 사이의 연결 지점에 팁을 겨냥하여 오래된 매체를 흡인하여 음압으로 인해 축삭 파손을 일으킵니다.

피펫 팁을 교체하고 150마이크로리터의 신경 기저 배지를 끌어와 오른쪽 챔버의 아래쪽 구멍을 통해 천천히 추가합니다. 첨가 및 흡인을 4회 수행한 후 신선한 완전 뉴런 배지로 교체한 다음 세포체 측면 구멍에서 오래된 배지를 흡인하고 필요한 경우 약물을 함유한 신선한 완전 뉴런 배지를 추가합니다. 미세유체 장치를 배양 접시와 함께 150mm 배양 접시에 넣고 24시간 등 필요한 시간 동안 배양을 계속합니다.

수동 축삭 손상의 경우 대규모 미세유체 장치의 모든 챔버에 뉴런을 시드합니다. 5% 이산화탄소가 함유된 가습 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 장치를 3일 동안 배양합니다. 시험관 내 7일째에 미세유체 장치가 들어 있는 배양 접시를 인큐베이터에서 꺼내 멸균 단계에 놓습니다.

20배 배율의 현미경을 준비하고 75% 에탄올을 사용하여 작업 영역을 멸균합니다. 10마이크로리터 멸균 여과된 피펫 팁을 잡고 현미경 안내 하에 원래 마이크로채널의 축삭 다발을 식별합니다. 피펫 팁을 사용하여 각 축삭 다발을 따라 세로 스크래치를 수행합니다.

현미경으로 축삭 파손을 실시간으로 관찰합니다. 표준 미세유체 장치의 마이크로채널은 시험관 내에서 7일 동안 베타 3 튜불린 염색으로 확인된 바와 같이 축삭의 성장을 허용하지만 체세포의 성장은 허용하지 않습니다. 신경 밀도는 축삭 손상 후 유의미한 차이를 나타내지 않았으며, 이는 관찰 가능한 신경 사멸이 없음을 나타냅니다.

멀티오믹스 분석을 위해 3차원 확장 가능한 디자인의 대규모 미세유체 장치가 개발되었습니다. 천공되지 않은 PDMS 복제품과 천공된 PDMS 복제품은 모두 10cm 접시 또는 PC 보드에 단단히 부착되었습니다. 피펫 팁 긁힘으로 인한 축삭 손상은 손상 전의 온전한 축삭과 달리 형태가 파괴된 축삭을 명확하게 절단했습니다.

축삭 재생은 손상 후 6시간과 24시간 모두에서 관찰되었으며, 손상되지 않은 축삭은 안정적으로 유지되었습니다. 신경 단백질 농도는 기준선 1420.4 마이크로그램/밀리리터에서 6시간 후 밀리리터당 1748.9, 손상 후 24시간 동안 밀리리터당 1823.7 마이크로그램으로 크게 증가했습니다. 대조군과 축삭 손상 그룹의 RNA 수율은 거의 동일했습니다.

RNA 시퀀싱을 통해 595개의 손상 특이적 유전자와 609개의 대조군 특이적 유전자가 밝혀졌으며 17, 471개의 유전자가 그룹 간에 공유되었습니다. KEGG 경로 분석은 손상 후 산화적 인산화, 활성 산소종 반응, 자가포식 및 TCA 주기 경로의 상당한 상향 조절을 확인했습니다.