Name: Nauplius의 움직임을 분석 아테 살리나 플라즈몬 나노 입자의 광학 추적하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: 학습하세요 광학 트위저를 이용한 플라즈몬 나노입자 광학 추적 기법으로 Artemia salina의 운동 주파수를 분석하는 방법을. 이 기술은 수생 미생물의 행동 연구와 생태계 분석에 활용됩니다.

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나노 시스템 이니셔티브 뮌헨 (NIM)를 통해 DFG에 의해 고급 탐정 그랜트 HYMEM 통해하고 Sonderforschungsbereich (SFB1032)를 통해 ERC에 의해 재정 지원, 프로젝트 A8은 기꺼이 인정 받고 있습니다. 우리는 알렉산더 박사 Ohlinger 박사 솔 Carretero - 팔라시오 스 및 지원 유익한 토론 스파 Nedev에 감사드립니다.

1. 실험 설정 <ol><li> 암시 야 조명을위한 개구 수 (NA) = 1.2로 업 오른쪽 현미경 및 암 필드 오일 콘덴서를 사용한다. 입자의 관찰과 트래핑 100X 배율 및 NA = 1.0 침수 목표를 사용합니다. Nauplius의 움직임을 따라 10 배 배율 NA = 0.2으로 공기 목적을 사용합니다. </li><li> 위쪽 오른쪽 현미경으로 결합 된 1,064 nm의 연속파 레이저 광 핀셋 설정을 사용하십시오. (대물 후 파워 미터로 측정) 100 mW의 광을 트랩의 레이저 파워를 설정한다. </li><li> 광학 트랩 Nauplius의 움직임에 금 입자의 움직임을 감지하고 이미지에 CMOS 고속 카메라 또는 디지털 싱글 렌즈 반사 (DSLR) 카메라를 사용합니다. </li><li> 카메라 들어가는 레이저를 방지하는 노치 필터를 사용한다. </li><li> 대물 후에 레이저 파워를 측정하는 파워 미터를 사용한다. </li></ol> 2. 샘플 준비 </p&gt; <ol><li> 현미경 유리 슬라이드에 물 방울 (180 μL)를 피펫 및 암시 야 현미경에서 샘플을 놓습니다. </li><li> 물 방울에 작은 물 탱크로부터 Nauplius 피펫. </li><li> 용액 Nauplius의 움직임을 관찰하고 비디오 스트림을 기록 10X 대물 공기를 사용한다. </li><li> Nauplius 의해 생성 된 유체 운동을 관찰하는 검출기로서 60 ㎚의 직경을 갖는 금 나노 입자를 사용한다. 따라서, 그래서 약 입자가 100X 침수 목적으로 시야에서 볼 수있는, 물방울에 매우 희석 입자 용액의 5 μl를 추가합니다. </li></ol> 3. 입자 추적 실험 <ol><li> 광학 트위터와 트랩 한 금 나노 입자. 따라서, 현미경 스테이지를 이동하여 솔루션에 확산 된 금 나노 입자에 가까운 1,064 nm의 트래핑 레이저를 가져옵니다. 매력적인 광학 힘은 일의 초점을 향해 금 나노 입자를 끌어E 레이져. 갇혀 입자가 더 이상 확산 오히려 그 위치를 유지하지 않습니다. 30 초 동안 50 Hz의 프레임 레이트로 DSLR 카메라와 함께 포집 나노 입자의 비디오 스트림을 가라. </li><li> 광학 족집게의 레이저를 끄고 트랩에서 금 나노 입자를 놓습니다. </li><li> 비디오 스트림의 각 프레임에서 광학적으로 갇혀 금 입자의 위치를​​ 판독하는 입자 추적 프로그램을 사용한다. 시간이 지남에 따라 입자의 XY 위치의 고속 푸리에 변환 (FFT)의 주파수 스펙트럼을 보여준다. NOTE : 여기서, 자기 기록 &#39;IGOR의 PRO&#39;컴퓨터 프로그램 코드는 시간의 경과와 FFT 분석 XY-평면에서의 입자의 중심 위치를 분석하기 위해 사용되었다. </li><li> 자기 기록 IGOR 코드에 대한 대안으로 비디오에서 입자를 추적 무료로 사용할 수있는 &#39;비디오 스팟 트래커&#39;프로그램을 사용합니다. 추적 데이터의 푸리에 변환을 수행하기 위해 상용 소프트웨어 &#39;원본&#39;을 사용 <oL&gt; <li> 열려있는 프로그램 &#39;비디오 스팟 트래커&#39;에 비디오 파일을 드래그합니다. </li><li> 마우스는 비디오 스트림과이자가 나타납니다의 원형 영역의 첫 번째 사진에서 볼 수있는 입자를 클릭합니다. </li><li> 입자의 추적을 최적화하기 위해 상단 명령 프롬프트 창에 &quot;대칭&quot;와 &quot;최적화&quot;를 선택합니다. </li><li> 마우스 상단 명령 프롬프트 창에서 &quot;로깅&quot;을 클릭하고 데이터를 저장할 폴더를 선택합니다. 추적 데이터는 데이터를 스프레드 시트로 저장됩니다. </li><li> 마우스 추적 프로그램의 왼쪽 명령 프롬프트 창에 &quot;플레이 동영상&quot;을 클릭하고 비디오의 모든 프레임이 분석 될 때까지 기다립니다. </li><li> 프로그램을 종료하고 &#39;원산지&#39;로 저장된 데이터를 스프레드 시트를 엽니 다. &quot;Y 1&quot;과 &quot;Y 2&quot;로 열 값을 설정합니다. </li><li> &#39;원래의 데이터 스프레드 시트의 &quot;X&quot;각 비디오 프레임에 대한 시간 간격을 설정합니다. </li><li> 마크 X위치 컬럼 상부 명령 프롬프트 창에서 &quot;데이터 분석&quot;과 &quot;FFT&quot;를 선택하여 FFT를 수행합니다. Y-위치 컬럼에 대한 단계를 반복합니다. </li><li> 주파수에 대한 x-및 y-방향으로 계산 된 FFT 신호의 진폭을 그린다. </li></ol></li></ol> 4. 수치 시뮬레이션 <ol><li> 컴퓨터 프로그램 &#39;매쓰&#39;를 사용하여 60 nm의 금 입자의 분극 α를 계산한다. <ol><li> . (1) 쿠와타 등 16에 따라 분극을 계산하는 방정식을 사용하여 <img alt="식 (1)" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51502/51502eq1.jpg" width="300" /> (1) </li><li> 금 입자, 나노 입자 반경 및 주변 매질의 굴절률의 파장 의존성 복합 유전체 기능 : 프로그램 코드의 다음 세 개의 매개 변수를 정의한다. </li></ol></li><li> ELEC의 설명을 사용하여. 60 나노 금 입자에 작용하는 광학 힘을 계산하는 Agayan 등 17에 따라 초점을 맞춘 가우시안 빔의 TRIC 필드 분포 : <img alt="식 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51502/51502eq2.jpg" width="500" /> (2) <ol><li> . 사용 방정식 (3) - (6) Agayan 등 17 두를 계산하려면, 그라데이션 및 입자에 작용하는 힘을 산란 : <img alt="식 3" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51502/51502eq3.jpg" width="350" /> (3) <img alt="식 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51502/51502eq4.jpg" width="300" /> (4) <img alt="식 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51502/51502eq5.jpg" width="500" /> (5) <img alt="식 (6)" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51502/51502eq6.jpg" width="300" /> (6) </li><li> 프로그램 코드에서는, O의 개구를 레이저 파워에 대한 매개 변수를 정의bjective 및 나노 입자의 복합체 분극. </li><li> 광 트랩의 금 입자에 작용하는 전체 광학 힘을 계산하는 그라디언트 력 및 산란 력을 요약. </li></ol></li><li> 동시에 &quot;컨트롤&quot;을 눌러 &quot;입력&quot;으로 시뮬레이션을 실행합니다. </li></ol>

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<li>Agayan, R. R., Gittes, F., Kopelman, R., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+near+resonance+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Optical trapping near resonance absorption.</a> Applied Optics. 41 (12), 2318-2327 (2002).</li>
<li>Klar, T., Perner, M., Grosse, S., von Plessen, G., Spirkl, W., Feldmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-Plasmon+Resonances+in+Single+Metallic+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Surface-Plasmon Resonances in Single Metallic Nanoparticles.</a> Physical Review Letters. 80, 4249-4252 (1998).</li>
<li>Ohlinger, A., Nedev, S., Lutich, A. A., Feldmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optothermal+Escape+of+Plasmonically+Coupled+Silver+Nanoparticles+from+a+Three-Dimensional+Optical+Trap%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Optothermal Escape of Plasmonically Coupled Silver Nanoparticles from a Three-Dimensional Optical Trap.</a> Nano Letters. 11 (4), 1770-1774 (2011).</li>
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<li>Urban, A. S., Fedoru, K. M., Nedev, S., Lutich, A., Lohmueller, T., Feldmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrink-to-fit+Plasmonic+Nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Optical+Materials%22%5BJournal%5D)">Shrink-to-fit Plasmonic Nanostructures.</a> Advanced Optical Materials. 1 (2), 123-127 (2013).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

암시 야 현미경은 금속 나노 입자의 산란 단면적이 그들의 형상 단면 (info 참조도 2A) (18)을 초과하기 때문에, 광 회절 한계 이하 치수의 금 나노 입자를 시각화하기위한 강력한 도구이다. 족집게 설정에서,이 접근 방법도 입자 사이 플라즈몬 커플 링 플라즈몬 공진 주파수 (15)의 적색 - 시프트의 원인이되기 때문에 단지 하나 또는 여러 개의 금 나노 입자가 레이저 광에 의해 포획 된 경우를 구별 할 수있다. 광학 족집게 구성 어두운 필드 현미경 따라서 수많은 새롭고 매우 유용한 실험적 가능성을 제공하지만, 조합 자명하지 않다. 삼차원 광 트랩의 원점이 광 전계 밀도 구배에 의해 발생되기 때문에, 안정적인 광학 포착 강하게 집중된 레이저 빔이 필요하다. 일반적으로, 높은 개구 수 (NA는 1.3-1.4을 =)와 목표는 트위터에 사용되는레이저 19 초점을 꽉를 달성하기 위해 설정. 시판 암시 야 오일 콘덴서의 높은 NA는, 그러나, ...

화학 및 생물 학적 지표에 따라 수질 평가는 수생 생태계 1-3의 상태 및 환경 조건에 대한 통찰력을 얻기 위해 근본적인 중요하다. 화학 물 분석 용 고전 방법은 관능 특성이나 물리 화학적 파라미터의 결정에 기초한다. 생물 지표는, 다른 한편으로는, 그 존재 및 생존 환경 조건들이 bioindicators 대한 전형적인 예 인치 발생할 생태계에 대한 오염 물질의 효과에 대한 통찰력을 제공 동물 종은 요각류, 작은 물 갑각류 기, 수있다 아르 거의 모든 물 서식지 4,5에서 발견 될 수있다. 물 샘플에서 이러한 종의 활성 및 생존을 관찰하는 것은, 따라서 생태계 5 전체적인 조건에 대한 정보를 얻기 위해 사용될 수있다. 노 플리 우스라고 요각류의 유충,, (각 유충은 appenda 세 켤레가 자신의 안테나의 리듬 스트로크를 사용하여그들의 머리 지역에서 GES)는 물 6에서 수영. 이러한 스트로크의 빈도와 강도함으로써 연령, 적합하고, 동물 7-10의 환경 조건의 직접적인 지표이다. 이 표본에 대한 조사는 일반적으로 관찰하고 직접 노 플리 우스의 안테나 선을 계산하여 현미경으로 수행됩니다. 크기 때문에 (~ 100 ~ 500 μm의) 11, 이것은 종종 하나 하나 또는 기판에 단일 Nauplius를 해결하는 하나의 측정을 수행해야합니다. 여기, 우리는 초 고감도 탐지기로 광학 포획 금 나노 입자를 사용하여 물 샘플에서 요각류 유생의 활동을 관찰하기 위해 새로운 접근 방식을 보여줍니다. 광 핀셋은 일반적으로 piconewton 범위 12 ~ 14까지 분자 사이의 힘을 적용하거나 측정 할 수있는 정밀한 실험 도구로 여러 그룹에 의해 사용됩니다. 최근 광 핀셋에 대한 응용 프로그램의 범위는 음향 진동을 관찰하고 해결하기 위해 확장되었습니다광학 트랩 (15)에 국한되어 나노 및 마이크로 입자의 움직임을 모니터링하여 액체 미디어에 NT 변동. 액체에 몰입 입자는 브라운 운동을 실시한다. 광학 트랩 내부, 그러나,이 운동은 부분적으로 강한 레이저 유도, 그라데이션 힘에 의해 감쇠된다. 따라서, 광 트랩의 강성과 레이저 빔의 초점 내의 입자의 지역화는 레이저 파워에 의해 조정될 수있다. 동시에, 그것은 트래핑 대한 잠재적 특성을 공개하고 트랩에서 시간 의존적 입자 운동을 모니터링하여 입자와 분자의 상호 작용을 분석하는 것이 가능하다. 이 접근법은 가능한 주파수, 강도, 그 액체 환경에서 움직이는 물체에 의해 생성되는 유체의 운동 방향을 태우기 위해 렌더링한다. 우리는이 일반적인 아이디어가 필요없이 개별 Nauplius의 움직임의 주파수 스펙트럼을 얻기 위해 적용될 수 있는지 보여직접 표본을 방해합니다. 이 실험 방법은 매우 민감한 방법으로 수생 표본의 운동성 행동의 관찰을위한 새로운 일반적인 개념을 소개합니다. 생물 지표 종에 대한 관측의 경우, 이것은 물 분석을위한 현재의 방법론을 확장 할 수 있고, 건강과 생태계의 완전성에 대한 정보를 얻기 위해 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>현미경 Zeiss Axio Scope.A1</td><td>Carl Zeiss</td><td>490035-0012-000</td><td>암시야 조명</td></tr><tr><td>물 대물렌즈 Achroplan</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>440087 100X 배율, NA = 1.0</td></tr><tr><td>공기 대물렌즈 Epiplan</td><td>Carl Zeiss</td><td>442934</td><td>10X 배율, NA = 0.2</td></tr><tr><td>암시야 오일 콘덴서</td><td>Carl Zeiss</td><td>445323</td><td>NA = 1.2</td></tr><tr><td>코볼트 룸바 CW 1,064 nm DPSSL</td><td>Cobolt</td><td>1064-05-01-2000-500</td><td>1,064 nm, CW, &lambda; = 1,064 nm, 2 Watt, TEM00</td></tr><tr><td>빔 익스팬더</td><td>Edmund Optics</td><td></td><td>부품 번호 1064 2-8X 64414</td></tr><tr><td>고속 카메라 Dimax HD</td><td>PCO. 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>컬러 카메라 Canon EOS 500 D&nbsp;</td><td>Canon</td><td></td><td>FAQ-ID: 8201395700</td></tr><tr><td>노치 필터 StopLine 532/1064</td><td>Semrock</td><td>A11149-711265</td><td>부품 번호. NF01-532U</td></tr><tr><td>물&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nauplius Artemia salina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>금 콜로이드</td><td>BBInternational</td><td>Batch 13741&nbsp;</td><td>직경 60 nm</td></tr><tr><td>MQMie 버전 3.2&nbsp;</td><td>마이클 퀸튼</td><td></td><td></td>박사</tr><tr><td>매스매티카 8.0</td><td>Wolfram</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Comsol Multiphysics 4.0&nbsp;</td><td>주식회사 컴솔</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

&#39;nauplius의 움직임을 분석<em&gt; 아테 살리나</em&gt; &#39;플라즈몬 나노 입자의 광학 추적하여

Analyzing the Movement of the Nauplius 'Artemia salina' by Optical Tracking of Plasmonic Nanoparticles

우리는 광 핀셋 작은 수생 생물의 이동에 의해 생성 된 유체 진동을 분석하는 중요한 도구를 제공 할 수있는 방법을 보여준다. 광학 트위터로 개최 한 금 나노 입자는 물 샘플에서 Nauplius 유충 (아테 살리나)의 리드미컬 한 움직임을 정량화 할 수있는 센서로 사용된다. 이것은 Nauplius 활동의 결과로 나노 입자의 포획 시간 종속 변위를 모니터링함으로써 이루어진다. 나노 입자의 위치의 푸리에 분석 후 관찰 된 종의 움직임에 대한 특징적인 주파수 스펙트럼을 산출한다. 이 실험은 직접 관찰하고 포획 된 입자에 대한 유충의 위치에 대한 정보를 얻기 위해 필요없이 작은 수생 유충의 활동을 측정하고 특징이 방법의 능력을 보여줍니다. 전반적으로,이 방법은 수중 전자에서 발견 된 특정 종의 생명력에 대한 통찰력을 줄 수cosystem 물 샘플을 분석하는 기존의 방법의 범위를 확장 할 수 있습니다.

실험 장치의 개략도는 그림 1A에 표시됩니다. 암 필드 구성은 광학적으로 광 트랩 (15)에 60 nm의 금 입자의 변위를 검출 할 필요가있다. 트래핑 레이저 1064 ㎚의 파장은 검출기 금 입자 (12, 14)의 안정적인 협착을 보장하도록 선택된다. 현미경에서 빔 스플리터는 대물 통해 포착 된 빔을 집중하는 데 및 노치 필터는 실험의 검출 장치에 유입 트래핑 레이저를 방지한다. Nauplius는 광학적으로 갇혀 금 나노 입자 (도 1b)를 둘러싼 수용액으로의 움직임을 수행 하였다. 동물에 의해 생성되는 유체 진동은 액체 매체를 통해 전파하고 광학적으로 갇혀 입자들과 상호 작용한다. 그림 2A는 B를 덫을 하나의 60 nm의 금 나노 입자의 어두운 필드의 이미지를 보여줍니다Y 레이저 빔. 암시 야 조명 아래 초록색 그 파장 영역에서의 산란 주파수를...

우리는 수생 생물의 주파수의 움직임을 조사하고 특성을 플라즈몬 나노 입자의 광학 추적을 사용합니다.

&#39;Nauplius의 움직임을 분석<em&gt; 아테 살리나</em&gt; &#39;플라즈몬 나노 입자의 광학 추적하여

We demonstrate how optical tweezers may provide a sensitive tool to analyze the fluidic vibrations generated by the movement of small aquatic organisms. A ...

이 실험 절차의 전체적인 목표는 광학적으로 포획된 플라스모닉 나노입자를 사용하여 수생 미생물의 이동 빈도를 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 광학 집게(optical tweezer)와 카메라가 장착된 현미경 하에서 물속의 OPIS 유충을 관찰합니다. 두 번째 단계는 OPIS 환경에 직경 16 nanometer의 금 나노입자를 첨가하는 것입니다.다음으로, 광집게(optical tweezer)를 사용하여 NOIs 근처에 단일 금 나노입자를 포획합니다. 마지막 단계는 Nous의 움직임에 의해 영향을 받는 포획된 나노입자의 확산을 관찰하는 것입니다. 비디오 데이터는 캡처되어 입자 추적 소프트웨어를 통해 분석됩니다.최종적으로, 시간에 따른 나노입자의 위치는 푸리에 공간으로 변환되어 노우스(nous)의 이동 주파수를 추출합니다. 일반적인 현미경 관찰과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 유체 진동을 분석한다는 것이며, 따라서 이 방법은 어떠한 광학적 해상도 제한도 받지 않습니다. 이 방법은 소크라테스 생태계의 수질 분석과 같은 환경론의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.암시야 조명 장치가 갖춰진 정립 현미경을 준비하는 것으로 시작합니다. 현미경에 수침 대물렌즈와 공기 대물렌즈를 모두 장착하십시오. 또한, 1064 nanometer 연속파 광학 집게를 현미경에 연결하십시오.다음으로, 금 입자와 opus의 움직임을 검출하고 이미징하기 위해 1064 nanometers 노치 필터가 장착된 카메라를 설치합니다. 대물렌즈 뒤에 파워 미터를 사용하여 레이저 출력을 1000 milliwatts로 설정합니다. 필요할 때까지 레이저를 꺼두십시오.시료 준비는 현미경 유리 슬라이드 위에 180 µL의 물방울을 피펫팅하는 것으로 시작합니다. 이 시점에서 시료를 암시야 현미경에 배치하고, 수조에서 OPIS를 피펫으로 취합니다. 이를 물방울로 옮깁니다.10배 공기 대물렌즈(10 x air objective)를 선택하십시오. 용액 내 OPIS의 움직임을 관찰하고 초당 25프레임으로 10초 동안 비디오 스트림을 기록하십시오. 이 과정이 완료되면 다음 단계를 준비하십시오.60 nanometer 직경의 금 나노 입자 스톡 용액 1부를 물 100부에 희석합니다. 다시 현미경으로 돌아와 용액 5 µL를 취합니다. 이를 opus를 사용하여 물방울에 첨가합니다.준비가 되면 100x 수침 렌즈로 교체하십시오. 수적을 관찰하며

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행동 추적 및 멕시코 Cavefish의 Neuromast 이미징

여기서, 우리는 세포막에 금 나노로드 (AuNRs)의 역학을 감시하기 위하여 전통적인 암장 현미경 검사법의 사용을 보여줍니다. 단일 AuNR의 위치와 방향은 ImageJ 및 MATLAB을 사용하여 감지되며 AuNRs의 확산 상태는 단일 입자 추적 해석을 특징으로 합니다.

단일 나노 입자 암장 현미경 검사를 사용하여 세포 막에 금 나노로드의 확산 역학 시각화

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학습하세요 광학 트위저를 이용한 플라즈몬 나노입자 광학 추적 기법으로 Artemia salina의 운동 주파수를 분석하는 방법을. 이 기술은 수생 미생물의 행동 연구와 생태계 분석에 활용됩니다.

'Nauplius의 움직임을 분석

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