Name: 모델링 성상 세포종 병인 체외와 생체 대뇌 피질의 성상이나 조건, 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 배우세요 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여 성상 세포종 병인을 체외 및 생체 내에서 모델링하는 방법입니다. 이 기술은 신경 종양학 연구와 전임상 약물 개발에 활용됩니다.

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CRM은 Damon Runyon-Genentech 임상 조사관입니다. 이 작업은 Damon Runyon Cancer Research Foundation(CI-45-09), Department of Defense(W81XWH-09-2-0042) 및 University of North Carolina University Cancer Research Fund(UCRF)의 CRM 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 저자는 쥐 사육 지원에 대해 Daniel Roth에게 감사를 표합니다. 저자는 또한 조직 배양 및 면역형광 지원에 대해 Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette 및 Susannah Krom에게 감사를 표합니다.

저자는 공개할 것이 없습니다.

가장 중요한 단계, 2), 3) 철저히 세포를 떼어 놓다, 수막을 제거하는 뇌량 아래 조직을 고려하지 않고 피질을 절제하는 적절한 수확 및 대뇌 피질의 성상 세포의 배양 아르 일)을 보장하기 위해, 4) GFAP에 대한 풍부 + 성상 교세포. 우리는 GFAP + 성상 세포에 대한 풍부 방법 (GFAP 프로모터의 제어하에 (지배적 인 변형 유전자의 Ad5GFAPCre 벡터 또는 활용과 TgGZT 121)를 유전자 재조합의 제한) 기계 (흔들림) 유전자를 사용하지만, 다른 기술은 대뇌 피질을 정화하기 위해 이용되어왔다 성상 교세포. 예를 들어, 오염 된 미세 아교 세포는 L-류신 메틸 에스터 (47)이어서 유사 분열 억제제 합류 배양을 처리함으로써 제거 될 수있다. 혈청 함유 미디어에서 기계적으로 정제 배양 성상 세포의 형태와 발현 프로파일은 이전 hypothesi으로, 급성 격리 성상과 다를데이빗은 더 미성숙 성상 세포...

성상 세포종은 가장 흔한 일차 뇌종양 및 아교 모세포종 (GBM), 등급 IV의 성상 세포종 아르, 12-15개월 1,2의 평균 생존과 가장 일반적이고 공격적인 서브 타입이다. 미만성 성상 세포종, 특히 GBM의 침공, 완전한 수술 적 절제를 배제 보조 요법의 효과를 제한하고, 필연적으로 치료 후 재발 세 리드. 드 노보 (주) GBM 또는 필연적으로 (보조) GBM 사에 진행 낮은 뇌 성상 세포종 중 처음 본 환자. GBM은 유 전적으로 이기종 세 가지 핵심 신호 전달 경로 제어하는 유전자에 상호 배타적와 공동으로 발생하는 돌연변이에 의해 특징입니다 : G 1 / S (굽은) 세포주기 체크 포인트, 수용체 티로신 키나제 (RTK)를, 그리고 TP53 5-7 경로. GBM은 GBM의 하위 유형 influ 것을 제안, 서로 다른 뇌 세포 유형과 유사한 별개의 발현 양상과 네 게놈 하위 유형으로 구성원점 6,8,9의 그것의 세포에 의해 추측되는. 성상 세포종 나은 모델은 성상 세포종 병인 중에 특정 세포 유형의 돌연변이의 특정 조합의 역할을 정의해야한다. 보다 효율적인 임상 약물 개발을위한 이러한 모델을 활용하여 궁극적으로 환자 결과를 개선하는 데 도움이됩니다. 성상 세포종 전류 모델은 인간 세포주, 환자 유래의 이종 이식 (PDX), 유전자 변형 정상적인 인간 성상 세포와 신경줄 기세포 (NSC), 유전자 조작 및 마우스 (GEM) 10-14 확립 포함한다. 대뇌 피질의 성상 및 NSC - - floxed 종양 대립 유전자의 다양한 조합을 품고 GEM에서 수확 우리는 차 뇌 세포를 활용 대안, 비 생식 GEM (nGEM) 모델 15을 개발했다. 목적 표현형 I에서 전임상 약물 개발을위한 시험 관내 및 생체 내 모두에서 특징 및 잠재적으로 이용 될 수있는 유 전적으로 정의 성상 세포종 세포 모델을 생성 할 수 있었다mmune 능력있는 마우스. 설립 인간의 세포 라인 그들은 곧장 앞으로, 기술적으로 널리 사용할 수 있습니다. 성상 세포종의 발병 기전 및 생체 외 및 생체 내에서 약물 반응의 가장 일반적으로 사용되는 모델이며, 면역 결핍 쥐 10,11,16-18에서 소성을 xenografting에 따라 반응 속도와 발암을 정의한 . 이들 단점은 높은 성상 세포종에 연구를 제한 뇌 성상 세포종에서 확립 세포주를 생성하는 무능력을 포함한다; 기원의 정의 셀의 부족; 종종 원래의 환자 샘플에서 현저하게 차이가 게놈 프로파일 복잡한 게놈 이상의 존재; 그리고 감수성 혈청 11,17,19-22 직렬 문화 중 표현형 및 유전자형 드리프트. 설립 인간의 GBM 세포 라인의 개별 종양 돌연​​변이의 표현형의 결과는 종종 eluc을 배제 실제로 존재하는 이상,의 무리에 의해 마스크 될 수있다직접 유전자형 - 표현형 결과의 idation. PDX는 면역 결핍 마우스 또는 면역 결핍 생쥐 12,23의 뇌에 소성을 주입 이전에 정의 된 무 혈청 배지에서 비 부착 회전 타원체로 그들의 문화를 통해 환자 격리 성상 세포종 세포의 피하 통로를 통해 생성됩니다. PDX보다 정확하게 인간 성상 세포종의 게놈 프리를 유지하지만, 인간의 확립 세포주 유사한 개별 발암 돌연변이 표현형 효과는 그들의 게놈 19,24 복잡성으로 인해 마스크 할 수있다. 특히 신규 한 치료법에 대한 응답으로, 특정 종양 돌연​​변이 표현형 결과를 정의하는 확립 인간 세포주 또는 PDX의 패널은 자주, 유전자형 표현형의 상관 관계를 확립 일반화를 보여주고, 세포주 특정 효과의 가능성을 최소화하기 위해 이용된다. PDX 정확하게 인간의 별아교 세포종, INC의 조직 병리학 적 특징을 요점을 되풀이하는 동안내습 luding 확립 인간 세포주의 동 소성은 일반적으로 이종 이식편을 수행하지 21,23,25. 또한, 정상적인 인간의 성상 및 NSC는 시험관 및 생체 내 13,14,26에서 성상 세포종의 종양을 모델로 정의 된 발암 돌연변이 유전자 설계되었다. 이러한 세포는 인간의 확립 세포주 및 PDX 게놈의 복잡성이 부족하고 정확하게 인간 성상 세포종의 조직 병리학 요점을 되풀이하지만, 생체 내에서 면역 결핍 설치류 xenografting을 필요로한다. 인간의 모든 세포 모델은 면역 매개 이종 이식 거부 반응을 방지하기 위해 면역 결핍 쥐 호스트를 요구하기 때문에,이 모델은 기질 타겟팅 및 면역 조절 성 전임상 연구를 제한 동계 체제의 기본 종양 기질 상호 작용을 요점을 되풀이하는 데 실패하고 그대로 면역 체계 부족 10, 11를 치료. 종양 무타 소정 조합의 표현형 결과의 GEM 허가 심사현장 종양에있는 동안 생체 내에서 tions. 비 조건부 GEM 개발을 통해 모든 조직 내에서 돌연변이를 가지고있는 반면, 조건부 GEM은 세포 유형 - 특이 적 프로모터 10,11,15,18의 사용을 통해 특정 세포 유형에 Cre 호텔 매개 재결합을 제한하여 돌연변이의 대상으로 사용 발암 대립 유전자를 floxed있다. 조건부 성상 세포종의 GEM은 그대로 뇌 (11) 내에서 서로 다른 종류의 세포에 발암 성 변이의 기능적 역할을 규명하기 위해 이용되고있다. 조건부 GEM을 사용 시츄 gliomagenesis에서의 전임상 유틸리티 1) 생체 외 상관 관계의 부족, 복합 유전형과 시츄 종양 발생에서의, 3) 긴 레이턴시를 마우스의 큰 코호트를 생성하는 2)의 어려움을 포함하여 많은 요인에 의해 제한된다 4) 확률 적 종양 진행. 반응계에서 종양이 대응 관내 모델이 부족하기 때문에, 시험 관내 시험은 약물 w 수행 할 수없는기존의 i 번째 조건 GEM 모델. 다른 암과는 대조적으로, 성상 세포종의 조건부 GEM 모델은 거의 하나의 종양 유전자 돌연변이 (11)에 의해 유도되지 않는다. 따라서, 복잡한 사육 방식은 여러 종양 돌연​​변이 조건부 GEM을 생성해야합니다. 높은 성상 세포종으로의 진행은 일반적으로 불균일, 확률 적으로 발생하고 궁극적 복잡한 게놈 경관과 빠른 성장 동역학 (27)과 종양 상승을 제공하면서 또한, 성상 세포종 개시는이 모델에서 오랜 지연 기간 후에 가변 투과도 발생, 28. 조건부 GEM 모델에서 변수 투과도 및 악성 진행의 확률 적 특성은 개별 쥐가 임상 약물 시험에서 자신의 등록 전에 높은 성상 세포종의 존재 및 위치를 검출하기 위해 방사선 촬영으로 검사를해야합니다. 함께 찍은, 이러한 제한은 홍보에 필요한 생성 및 조건 GEM의 대규모 코호트 시험을 방해e 임상 약물 검사. 특정 신경 세포 유형의 바이러스 성 수용체 (TVA)를 표현하기 위해 설계 GEM 감염 조류 레트로 바이러스 (RCA 단자) 벡터를 이용하여 RCA 단자-TVA의 GEM 시스템은 광범위하게 성상 세포종의 종양 (11)를 모델로 활용되고 있습니다. 조건부 GEM과 대조적으로,이 모델 시스템은 복잡한 육종 계획에 대한 요구없이 특정 세포 유형에서의 다중 발암 돌연변이의 도입을 가능하게한다. 그러나, 가변 투과도 적극적 바이러스 통합을 달성하기 위해 세포를 분할하기위한 요구, 및 숙주 게놈 (29)에 도입 유전자의 임의의 삽입에 의해 제한된다. 그들은 다른 모델 시스템 (15)의 많은 한계를 극복하기 때문에 GEM에서 수확 세포를 활용하는 비 생식 GEM (nGEM) 모델은 점점 더 중요 해지고있다. 성상 세포종의 병인 세포 유형과 공동 발생 돌연변이를 개시 역할 억제하기 어렵다이들은 악성 진행 중에 미정 세포 유형에서의 광범위한 유전 적 돌연변이를 축적 말기 종양으로부터 유도되기 때문에 내 인간 GBM 세포주 또는 PDX 설립 사용. 대조적으로, 성상 세포종 모든 등급은 특정 정제 뇌 세포 유형 11,30 내에 유전 변이를 유도함으로써 nGEM 정의를 사용하여 모델링 될 수있다. 따라서, 특정 유전자 돌연변이 세포 및 분자 표현형에 세포 유형의 영향을 시험 관내 및 생체 내에서 결정될 수있다. 설립 된 인간 GBM 세포주와 유사 nGEM를 사용 초기 시험 관내 약물 테스트는 동일한 셀을 이용한 생체 내 테스트에 대한 약물의 우선 순위를 사용할 수있다. 생체 내에서 종양 형성 후 orthotopically 면역 능력 한배 새끼 동계 (30)의 뇌에 nGEM 세포 동종 이식에 의해 결정될 수있다. 이러한 동 소성 이식 모델은 따라서뿐만 아니라 종래의 세포 상해의 생체 내 시험에서 허용차 치료를 대상으로하지만, 면역 조절 성 간질 - 표적으로 한 치료뿐만 아니라. 마지막으로, 종양의 개시 및 진행에 미세 환경의 역할은 동일 세포 유형에서 동일한 변이를 사용 nGEM 종래 GEM 모델 사이의 결과를 비교함으로써 결정될 수있다. 우리와 다른 일차 전지를 사용하여 성상 세포종 nGEM을 개발했다 - 성상, NSC, 또는 희소 돌기 아교 세포 전구 세포 (OPC) - GEM 30-34에서 수확을. 성상 세포종 nGEM 개발 배후의 이론적 근거는 잠재적 면역 유능한 동물에서 시험 관내 약물 전임상 시험 및 생체 내에서 사용될 수있는 특정 유형의 세포에서 발암 돌연변이 표현형 결과를 결정하는 모델을 생성 하였다. 사포닌에 loxP /에 loxP 또는 TgGZT - 우리는 표현 표현형 WT 대뇌 피질의 성상 세포 및 비 Cre 호텔에서 NSC, floxed RB 경로와&gt; 94 % C57 / BL6 배경에 유지 조건 GEM 수확121 - 다양한 조합 35-39에서 유전자 - NF1에 loxP /에 loxP, Kras은 G12D, PTEN을에 loxP /에 loxP - 및 RTK / RAS / PI3K 통로를 floxed. 우리는 Cre 호텔 재조합 효소를 암호화하는 아데노 바이러스 벡터를 사용하여 시험 관내에서 유전자 재조합을 유도. 대뇌 피질의 성상 세포 수확은 세포 유형의 혼합물을 포함하기 때문에, 우리는이 문화 GFAP + 대뇌 피질의 성상 세포에 풍부하게, 같은 TgGZT 인간 GFAP 프로모터에서 쫓겨 121 Ad5GFAPCre 벡터 지배적 발암 유전자를 사용했다. 우리는 생체 외 및 생체 내에서 대뇌 피질의 성상 및 NSC의 표현형 G 1 / S의 결과 (굽은), MAPK와 PI3K 통로 돌연변이를 정의했다. MAPK 및 PI3K 경로 활성 G1 / S 불량 아스트로 분자 모방 proneural 인간의 GBM과, 소성을 주입하면, 균일 한 성장 동역학, 짧은 대기 시간을 가진 사전 정의 된 위치에 형성된 종양 및 조직 병리학인간의 GBM (30)의 알 특징. 생체 내에서 종양 성장의 종 모니터링 치료 40 님의 질문에 답변 처리 동료와 종양 성장의 정량 분석의 정상화를 통해 전임상 약물 검사를 도움이됩니다. 우리는 루시퍼 라제는 대뇌 피질의 성상을 표현 주입 한 쥐의 종 생물 발광 영상으로 종양의 성장 속도론을 결정했다. 따라서 조건부 GEM에서 파생 된 대뇌 피질의 성상 및 NSC는 성상 세포종 관련 돌연변이의 기능적인 결과와 임상 약물 개발을위한 잠재적 인 모델 시스템의 정의에 대한 다루기 쉬운 모델 시스템을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco의 Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>11995065</td><td>DMEM은 GIBCOSigma 및 Cellgro</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Regular</td><td>Cellgro</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-395</td><td>를 포함한 다른 공급업체에서도 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>연골 엄지 집게, 곡선형</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>1631</td><td></td></tr><tr><td>Miltex 17-301 스타일 1 보석상 스타일 집게, 세밀, 4</td><td>Miltex</td><td>17-301</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 (200 proof)</td><td>Decon Labs</td><td>2710</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), 액체</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (1x), Phenol Red</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td>다른 트립신 용액은 피질 성상 세포에도 적합합니다 및 배</td></tr><tr><td>양 Culture Dish, 60 x 15 mm</td><td>Thomas Scientific</td><td>9380H77</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>아데노바이러스 재고</td><td>유전자 전달 Vector Core, U. 아이오와</td><td>Ad5CMV5</td><td>&micro의 저장소 l -80 &deg;C에서 부분 표본. 위험한. Bsl2 안전 주의사항 사용</td></tr><tr><td>황산나트륨 (Na2SO4)&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>238597</td><td></td></tr><tr><td>황산칼륨(K2SO4)</td><td>시그마-알드리치</td><td>221325</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘(MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘(CaCl2)</td><td>시그마-알드리치</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 칼륨염</td><td>시그마-알드리치</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)- 포도</td>당 <td>시그마-알드리치</td><td>G8270&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨 (NaOH)</td><td>시그마-알드리치</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>파파인</td><td>워딩턴</td><td>LS003127</td><td></td></tr><tr><td>L-시스테인-HCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>C1276</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터 (0.22 &마이크로; m pore size)</td><td>Millipore</td><td>SLGP033NS</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult 증식 키트, 마우스</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5702</td><td>이 키트에는 NSC 배양에 필요한 NeuroCult NSC 기초 매체 및 NeuroCult NSC 보충제가 포함되어</td></tr> 있습니다. <tr><td>0.2% Heparin 용액</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>EGF&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td><td></td></tr><tr><td>bFGF&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>E-64</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td>10 mM 재고 만들기 DMSO, -20 &deg에서 보관; C</td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기(40 &마이크로; m pore size)</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>줄기세포 해리 용액</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5707</td><td>또는 Accutase</td></tr><tr><td>Methyl cellulose 15 cP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Media 2x</td><td>Millipore</td><td>SLM-202-B</td>와 같은 부드러운 효소 용액을 사용하십시오. 5<td>% 메틸 셀룰로오스 용액</td></tr><tr><td>1.7ml Snap Cap 제조용 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 주사기, 250 &micro; l LT 바늘 없음</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-92</td><td></td></tr><tr><td>PB600-1 항원 디스펜서</td><td>해밀턴</td><td>&nbsp; 83700</td><td></td></tr><tr><td>일회용 18G 바늘</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9015638</td><td></td></tr><tr><td>27 ga 1/2" 루어 팁 바늘</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9386574</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Opthalmic Ointment</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NC9689910 모델 900 스테레오택시 프레임</td><td>Kopf Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VETBOND</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9259532&nbsp;</td><td>조직 접착제&nbsp;</td></tr><tr><td>리도카인&nbsp;</td><td>ShopMedVet</td><td>RXLIDO-EPI</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sox2</td><td>Millipore</td><td>AB5603</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td><td>Dako</td><td>Z0334&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Kinetic</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>in vivo 이미징용</td></tr><tr><td>D-Luciferin - K+ Salt 생물 발광 기판</td><td>PerkinElmer</td><td>122796 <</td><td>em>in vivo 생물 발광 이미징</td></tr><tr><td>EdU 이미징 키트</td><td>Invitrogen</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>MSCV Luciferase PGK-hygro</td><td>Addgene</td><td>18782</td><td></td></tr></tbody></table>

모델링 성상 세포종 병인 체외와 생체 대뇌 피질의 성상이나 조건, 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

현재의 성상세포종 모델은 질병 발병 중 특정 뇌세포 유형에서 발암성 돌연변이의 역할을 정의하는 능력과 전임상 약물 개발에 대한 유용성에 한계가 있습니다. 이러한 응용 프로그램을 위한 더 나은 모델 시스템을 설계하기 위해, 플록스된 발암성 대립유전자의 다양한 조합을 가진 조건부, 유전자 조작 마우스(GEM)의 표현형 야생형 피질 성상세포와 신경 줄기세포(NSC)를 수확하고 배양에서 성장시켰습니다. 유전자 재조합은 아데노바이러스 Cre 매개 재조합을 사용하여 in vitro에서 유도되었으며, 그 결과 돌연변이 발암 유전자의 발현 및 종양 억제 유전자의 결실이 이루어졌습니다. 이러한 돌연변이의 표현형 결과는 in vitro에서 증식, 형질전환 및 약물 반응을 측정하여 정의되었습니다. 형질전환된 세포를 면역이 가능한 syngeneic littermates의 뇌에 정위 주입하는 orthotopic allograft model은 in vivo 종양 형성에 대한 발암 돌연변이 및 세포 유형의 역할을 정의하기 위해 개발되었습니다. 대부분의 확립된 인간 교모세포종 세포주 이종이식편과 달리, 형질전환된 GEM 유래 피질 성상세포를 면역 능력이 있는 리터메이트의 뇌에 주입하면 가장 공격적인 아형인 교모세포종을 포함한 성상세포종을 생성했으며, 이는 정상 뇌 실질의 확산 침습을 포함하여 인간 성상세포종의 조직병리학적 특징을 요약했습니다. 루시페라아제를 발현하도록 조작된 형질전환된 성상세포의 정형외과 동종이식편의 생물발광 이미징을 활용하여 시간 경과에 따른 생체 내 종양 성장을 모니터링했습니다. 따라서 조건부 발암성 대립유전자와 함께 GEM에서 수확한 성상세포와 NSC를 사용하는 성상세포종 모델은 시험관 내 및 생체 내에서 성상세포종 발병의 유전학 및 세포 생물학을 연구하기 위한 통합 시스템을 제공하며 이러한 파괴적인 질병에 대한 전임상 약물 개발에 유용할 수 있습니다.

우리는 표현형 생체 외 및 생체 특징으로 할 수있다 조건부 종양 대립 유전자 (그림 1) floxed 신생아 GEM의 숨겨에서 수확 대뇌 피질의 성상 및 NSC와 nGEM 모델 시스템을 개발했다. 구체적으로는 시험 관내에서 피질 별아교 세포의 발암 돌연변이의 영향을 조사하기 위하여, 성상 세포에 대한 제 풍부하는 것이 중요하다. 두피 성상 세포는 미세 아교 세포 수확, 아스트로 사이트, 올리고 덴드로 사이트, OPC 및 뉴런의 혼합물을 포함하지만, 기계적 및 유전 적 방법은 성상 세포 농축에 도움을 줄 수있다. 뉴런 정상 배양 조건 하에서 다이 반면, 미세 아교 세포 및 희소 돌기 아교 세포는 41,43 밤새 진탕 제거 될 수있다. 또한, Ad5GFAPCre을 사용 GFAP + 성상 세포를 대상으로 floxed, 종양 대립 유전자의 유전자 재조합은 성상 세포에 풍부하게 할 수 있습니다. 우리는 플로와 <su...

플록스, 조건부 발암성 대립유전자로 조작되고 바이러스 Cre 매개 재조합을 통해 형질전환된 마우스에서 채취한 표현형 야생형 성상세포와 신경 줄기세포는 syngeneic, immune-competent littermate의 뇌에 형질전환된 세포의 orthotopic 주입에 의해 in vitro 및 in vivo에서 성상세포종 발병기전을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다.

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

다음 실험의 전반적인 목표는 in vitro 및 in vivo 표현형 특성화를 위해 정의된 세포 유형에서 유전적으로 조작된 성상세포종 모델을 생성하는 것입니다. 이는 시험관 배양을 위해 신생아 조건부 유전자 조작 마우스를 발현하지 않는 Cree에서 야생형 일차 세포를 수확하여 달성됩니다. 두 번째 단계에서, 일차 세포는 체외에서 F 플록스 대립유전자의 유전자 재조합을 유도하기 위해 Cree 재조합을 암호화하는 아데노바이러스 벡터에 감염됩니다.다음으로, 재조합된 세포는 표현형 특성화를 위해 연속적으로 배양됩니다. 궁극적으로, 정의된 돌연변이가 특정 신경 세포 유형에서 신경교세포(glio agenesis)를 촉진하는지 여부는 in vitro 및 in vivo에서 종양 유발 관련 표현형의 특성화에 의해 결정됩니다. 이 방법은 다음과 같은 주요 신경 종양학 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다: 성상세포종 관련 돌연변이의 표현형 결과는 무엇입니까?이 기술의 의미는 성상세포종에 대한 전임상 약물 개발로 확장되는데, 유전적으로 정의된 이러한 세포는 면역 능력이 있는 syngenetic 마우스에서 in vitro 및 in vivo에서 사용할 수 있기 때문입니다. 세포 수확 및 orthotopic 주입 단계는 기술적으로 어렵고 해부학적 구조를 정확하게 식별해야 하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실 To Collecting the Brain Tissue의 기술자인 Ryan Bash입니다.먼저 에탄올 살균 해부 가위를 사용하여 생후 1-3일 된 안락사 신생아 생후 유전적으로 조작된 쥐의 척수에서 코까지 두개골 위의 피부를 시상으로 자릅니다. 다음으로, 척수에서 시작하여 후각구를 지나 시상 봉합사를 따라 두개골을 절개합니다. 그런 다음 구부러진 집게를 사용하여 직선 마이크로 집게를 사용하여 두개골의 각 반구를 뇌에서 측면으로 부드럽게 벗겨냅니다.다음으로, 소뇌와 후각구를 피하도록 주의하면서 각 피질 반구의 등쪽 부분을 부드럽게 집어내고 뇌 조직을 H-B-S-S-N이 들어 있는 조직 배양 접시에 넣습니다. 해부 현미경으로 두 쌍의 마이크로 집게를 사용하여 각 피질 반구에서 수막을 부드럽게 제거하고 조직 배양 접시를 얼음 위에 다시 올려 뇌 조직을 균질화합니다. 먼저 깨끗한 면도날을 사용하여 피질 반구를 깍둑썰기합니다.그런 다음 플레이트를 조직 배양 후드로 옮기고 조직 조각을 멸균된 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 얼음처럼 차가운 HBSS 1ml로 플레이트를 헹구고 세척액도 튜브로 옮깁니다. 실온 2밀리리터에서 과도한 HBSS를 제거한 후 EDTA를 튜브에 트립신하고 1밀리리터 피펫으로 약 10회 위아래로 피펫팅하여 조직 조각을 추가로 연결합니다.세포 현탁액을 섭씨 37도에서 15-20분 동안 배양합니다. 배양 후 5분마다 역전을 통해 세포 용액을 조심스럽게 혼합하고, 방금 시연한 것처럼 10회 위아래로 피펫팅하여 트립신을 억제하기 위해 3ml의 완전한 배지를 세포 현탁액에 혼합했습니다. 그런 다음 해리된 성상세포를 스핀다운합니다.1 밀리리터 피펫으로 스내트를 조심스럽게 제거하고 펠릿을 섭씨 37도의 4 밀리리터에 다시 현탁시킵니다. 완전한 미디어. 그런 다음 성상세포 현탁액을 T 75 스크류 톱 조직 배양 플라스크로 옮기고 수확 후 약 16시간 동안 피질 성상세포를 5% 이산화탄소에서 섭씨 37도로 유지합니다.섭씨 37도 HBSS의 4밀리리터로 플라스크를 세척합니다. 그런 다음 4ml의 완전한 배지를 추가하고 피질 성상세포를 5% 이산화탄소에서 섭씨 37도로 유지합니다. 배양액이 약 95% 합류점에 도달하면 5% 이산화탄소에서 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양물을 흔듭니다.그런 다음 분리된 세포가 포함된 매체를 제거하고 섭씨 37도의 HBSS를 4밀리리터 더 사용하여 플레이트를 세척합니다. 그런 다음 4ml의 새로운 완전 배지를 추가하고 피질 성상세포를 위한 배양을 농축한 후 24시간 후에 세포를 다시 배양합니다. 2밀리리터의 완전한 미디어로 문화를 새롭게 하십시오.그런 다음 섭씨 32도에서 관심 아데노바이러스의 10분의 10 pfu의 10분의 1 이상에 해당하는 1마이크로리터를 5%의 이산화탄소로 5%로 포함하는 1밀리리터의 완전한 배지로 세포를 배양합니다. Gfab CRE 감염은 재조합된 gfab 성상세포에서 증식 이점을 유발하여 배양에서 5-9회 통과 후 성상세포 순도를 59%에서 90% 이상으로 증가시킵니다. 6시간 후 배지가 포함된 바이러스를 제거하고 신선하고 완전한 배지에서 배양액을 다시 배양합니다.피질 성상세포를 약 90%confluence에서 수확한 후 적절한 세포 수를 얼음처럼 차가운 5%메틸셀룰로오스에 재현탁합니다. 250마이크로리터 유리 주사기를 반복 항원 디스펜서에 넣은 다음 뭉툭한 18게이지 바늘을 주사기에 부착합니다. 18게이지 바늘을 사용하여 피질 성상세포를 주사기로 흡인하고 기포를 제거합니다.그런 다음 18 게이지 바늘을 버리고 27 게이지 바늘을 주사기에 끼웁니다. 성상세포를 이식하기 위해 새 바늘에서 액체가 배출될 때까지 항원 디스펜서의 버튼을 누릅니다. 다음으로, 생후 3개월에서 6개월 된 면역 능력이 있는 수용 동물을 입체 안경테 내에 고정하고 귀와 눈 사이의 시상 봉합사 부분을 약 0.5cm 길이로 절개합니다.관상동상동맥 봉합사 또는 BRE MA의 교차점과 시상 봉합사 또는 람다(Lambda)에서 양봉선의 교차점을 찾습니다. BMA와 람다가 동일한 수평면에 있는지 확인한 후 주사기와 반복 항원 디스펜서를 동물의 머리 위의 입체 액자에 부착하고 바늘 끝이 bgma에 닿도록 합니다. 바늘을 두개골 표면에서 약간 들어 올리고 bgma에서 옆으로 2mm, 옆으로 1mm 이동합니다.그런 다음 바늘을 두개골을 통해 목적지까지 조심스럽게 내립니다. breg MA에서 4mm 복부로 이동하여 반복 항원 디스펜서를 활성화합니다. 5마이크로리터의 세포 현탁액을 한 번 주입합니다.두개내 압력이 평형을 이룰 수 있도록 2분 동안 바늘을 제자리에 두었다가 면 스왑을 사용하여 30초에 걸쳐 천천히 바늘을 빼내고 발생할 수 있는 출혈에 압력을 가합니다. 마지막으로, 조직 접착제를 사용하여 상처 가장자리를 근사화하고 절개 부위를 봉합한 다음 동물을 깨끗하고 따뜻한 케이지에 넣어 회복합니다. 확립된 인간 세포주의 이종이식은 면역결핍 숙주를 필요로 하며 일반적으로 인간 성상세포종의 조직병리학을 재현하지 않아야 합니다.예를 들어, U 87 MG orthotopic xenografts는 정상적인 뇌를 침범하지 않는 외접 종양을 형성합니다. 이와는 대조적으로, 면역 능력이 있는 syngeneic 마우스의 뇌에 T RRP null astrocyte를 주입하면 인간 마우스의 조직학적 특징, 특히 정상 뇌 조직의 침입을 요약하는 종양이 생성됩니다. TRP null 동종이식 성장을 모니터링하기 위해 세포 주입 후 5일마다 마우스를 희생하고 종양 부담은 h 및 e 염색된 뇌 절편의 종양 영역을 정량화하여 측정했습니다.종양 부위는 시간이 지남에 따라 기하급수적으로 증가하는 것으로 확인되었으며, TP nll 성상세포의 1배에서 5분의 1을 수용자의 뇌에 주입하는 정orthotopic 주입은 신경학적 이환율을 유발했습니다. 평균 생존 기간은 22일입니다. 종적 in vivo 이미징은 종양 성장 역학을 정의하는 데 사용되었습니다.따라서 본 실험에서는 TR penal astrocytes와 루시페라아제를 발현하도록 조작된 세포를 면역 능력이 있는 syngeneic의 뇌에 주입했습니다. 깔짚 짝짓기와 종양 성장은 연속 생물 발광 이미징에 의해 결정되었습니다. 16일 동안 생물 발광이 15배 증가하는 것이 관찰되었습니다.이 절차에 따라 약물 검사를 시험관 내 및 생체 내에서 수행하여 효능을 결정하고 새로운 약물 조합을 테스트할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 조건부 유전자 조작 마우스에서 비크레아 발현 마우스에서 피질 성상세포를 채취하는 방법, 체외에서 유전자 재조합을 유도하는 방법, 면역 능력이 있는 마우스에서 정형소 동종이식을 사용하여 종양 발생을 모델링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

modeling-astrocytoma-pathogenesis-vitro-vivo-using-cortical

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Astrocytes 정상 뇌 개발 및 기능, 및 중앙 신경계 수리를 위해 필수적인 기초 생물학적 과정에 참여하는 다양한 세포로 인정되었습니다. 여기 중추 신경계 세포의 주요 클래스의 생물학을 연구하는 순수 마우스 astrocyte 문화를 얻기 위해 빠른 절차를 제시한다.

마우스 두피 Astrocytes의 분리와 문화

우리는 종양의 성장하는 동안 재생에 일반적으로 생물 물리학 적 제약 조건을 되풀이되었습니다의 intravital 두 광자 현미경을위한 마우스에서 대뇌 피질의 소성을 glioblastoma의 모델을 설립했다. 종양 위의 두개골을 대체 만성 유리 창에는 두 개의 광자 현미경에 의해 시간이 지남에 따라 종양의 진행을 추적 할 수 있습니다.

소성을 Glioblastoma의 마우스 모델은 뇌 실질 물리적 제약 조건을 유지하고의 intravital 두 광자 현미경에 적합

뇌는 잘 시험관이나 자궁외 분석으로 표시되지 않은 자질을 가진 유일한 사이트입니다. 위치 재현성과 성장 특성 정위 마우스 모델을 확실 정위 고정기구 및 저압 주사기 펌프를 사용하여 두개 내 주사로 생성 될 수있다.

만들기 해부학 적으로 정확하고 인간의 두뇌 종양의 재현 두개 내 이종 이식

성상 세포는 대뇌 피질을 균일하게 타일로 만들어 세포 수준에서 복잡한 형태에 대한 분석을 어렵게 만듭니다. 여기에 제공된 프로토콜은 자궁 전기포레이션을 기반으로 하는 다색 라벨을 사용하여 피질 성상신구를 선별하고 사용자 친화적인 이미지 분석 파이프라인을 사용하여 볼륨 및 형태를 분석합니다.

피질 마우스 성상세포를 개별화하기 위해 다각형 게놈 통합 색상(MAGIC) 마커의 자궁 전기포게에서

우리는 유도 된 신경 전구 세포 (iNPC)로 인간의 피부 유래 섬유 아세포와 유도 된 천체 세포 (iA)로 후속 분화를 재프로그래밍하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 대량으로 iNPC 및 iA의 빠르고 재현 가능한 생성으로 이어집니다.

섬유아세포에서 신경 전구세포로의 직접 변환을 이용한 신경질환 시험관 모델링 및 성상세포로의 분화

여기서 우리는 중추 신경계에 있는 성상세포의 기능 및 신경질 세포와 관련시키는 기계장치를 연구하기 위하여 신경같이 조직을 biofabricating을 위한 3D 생물 인쇄 murine 피질 성상 세포의 방법을 보고합니다.

신경과 같은 조직을 위한 Murine 피질 성상 세포의 3D 생물 인쇄

여기에서 우리는 유전자 조작 마우스 모델 종양에서 파생된 세포의 두개내 주입에 의해 확립된 GBM에 대한 전임상 동소 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 인간 GBM의 질병 특징을 표시합니다. 중개 연구를 위해 마우스 뇌종양은 생체 내 MRI 및 조직병리학에 의해 추적됩니다.

다형성 교모세포종의 번역 동소 모델

전임상 테스트를 위해 일반적인 환자 돌연변이에 의해 유도되는 면역 능력이 있는 자가종양 모델을 활용하는 것은 면역 치료 테스트에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 일반적인 환자 돌연변이를 나타내는 플라스미드 DNA의 전기천공법 기반 전달을 사용하여 뇌종양 마우스 모델을 생성하는 방법을 설명하므로 정확하고 재현 가능하며 일관된 마우스 모델을 제공합니다.

Modeling Brain Tumors In Vivo Using Electroporation-Based Delivery of Plasmid DNA Representing Patient Mutation Signatures(환자 돌연변이 시그니처를 나타내는 플라스미드 DNA의 전기천공법 기반 전달을 사용한 생체 내 뇌종양 모델링)

폐기 인간의 태아 대뇌 피질의 조직에서 신경 줄기 세포의 격리와 문화에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 알려진 인간의 신경 장애에서 파생된 문화가 같은 약리 효능을 평가하기위한 플랫폼을 제공뿐만 아니라, 병적인 세포 및 분자 공정의 특성에 사용될 수 있습니다.

폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

편두통과 만성 편두통하기 위해 변화 개선 치료 옵션을 필요로 엄청난 의료 부담입니다. 우리는 모델로, 신경 면역 신호가 편두통에 느끼기 쉬운 상태를 modulates 방법을 정의하는...

스프 레딩 우울증을 사용하여 에피소드와 만성 두통의 신경 면역 신호를 모델링 체외에서</em

배우세요 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여 성상 세포종 병인을 체외 및 생체 내에서 모델링하는 방법입니다. 이 기술은 신경 종양학 연구와 전임상 약물 개발에 활용됩니다.

모델링 성상 세포종 병인 체외와 생체 대뇌 피질의 성상이나 조건, 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여

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