모델링 성상 세포종 병인 체외와 생체 대뇌 피질의 성상이나 조건, 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여

다음 실험의 전반적인 목표는 in vitro 및 in vivo 표현형 특성화를 위해 정의된 세포 유형에서 유전적으로 조작된 성상세포종 모델을 생성하는 것입니다. 이는 시험관 배양을 위해 신생아 조건부 유전자 조작 마우스를 발현하지 않는 Cree에서 야생형 일차 세포를 수확하여 달성됩니다. 두 번째 단계에서, 일차 세포는 체외에서 F 플록스 대립유전자의 유전자 재조합을 유도하기 위해 Cree 재조합을 암호화하는 아데노바이러스 벡터에 감염됩니다.

다음으로, 재조합된 세포는 표현형 특성화를 위해 연속적으로 배양됩니다. 궁극적으로, 정의된 돌연변이가 특정 신경 세포 유형에서 신경교세포(glio agenesis)를 촉진하는지 여부는 in vitro 및 in vivo에서 종양 유발 관련 표현형의 특성화에 의해 결정됩니다. 이 방법은 다음과 같은 주요 신경 종양학 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다: 성상세포종 관련 돌연변이의 표현형 결과는 무엇입니까?

이 기술의 의미는 성상세포종에 대한 전임상 약물 개발로 확장되는데, 유전적으로 정의된 이러한 세포는 면역 능력이 있는 syngenetic 마우스에서 in vitro 및 in vivo에서 사용할 수 있기 때문입니다. 세포 수확 및 orthotopic 주입 단계는 기술적으로 어렵고 해부학적 구조를 정확하게 식별해야 하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실 To Collecting the Brain Tissue의 기술자인 Ryan Bash입니다.

먼저 에탄올 살균 해부 가위를 사용하여 생후 1-3일 된 안락사 신생아 생후 유전적으로 조작된 쥐의 척수에서 코까지 두개골 위의 피부를 시상으로 자릅니다. 다음으로, 척수에서 시작하여 후각구를 지나 시상 봉합사를 따라 두개골을 절개합니다. 그런 다음 구부러진 집게를 사용하여 직선 마이크로 집게를 사용하여 두개골의 각 반구를 뇌에서 측면으로 부드럽게 벗겨냅니다.

다음으로, 소뇌와 후각구를 피하도록 주의하면서 각 피질 반구의 등쪽 부분을 부드럽게 집어내고 뇌 조직을 H-B-S-S-N이 들어 있는 조직 배양 접시에 넣습니다. 해부 현미경으로 두 쌍의 마이크로 집게를 사용하여 각 피질 반구에서 수막을 부드럽게 제거하고 조직 배양 접시를 얼음 위에 다시 올려 뇌 조직을 균질화합니다. 먼저 깨끗한 면도날을 사용하여 피질 반구를 깍둑썰기합니다.

그런 다음 플레이트를 조직 배양 후드로 옮기고 조직 조각을 멸균된 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 얼음처럼 차가운 HBSS 1ml로 플레이트를 헹구고 세척액도 튜브로 옮깁니다. 실온 2밀리리터에서 과도한 HBSS를 제거한 후 EDTA를 튜브에 트립신하고 1밀리리터 피펫으로 약 10회 위아래로 피펫팅하여 조직 조각을 추가로 연결합니다.

세포 현탁액을 섭씨 37도에서 15-20분 동안 배양합니다. 배양 후 5분마다 역전을 통해 세포 용액을 조심스럽게 혼합하고, 방금 시연한 것처럼 10회 위아래로 피펫팅하여 트립신을 억제하기 위해 3ml의 완전한 배지를 세포 현탁액에 혼합했습니다. 그런 다음 해리된 성상세포를 스핀다운합니다.

1 밀리리터 피펫으로 스내트를 조심스럽게 제거하고 펠릿을 섭씨 37도의 4 밀리리터에 다시 현탁시킵니다. 완전한 미디어. 그런 다음 성상세포 현탁액을 T 75 스크류 톱 조직 배양 플라스크로 옮기고 수확 후 약 16시간 동안 피질 성상세포를 5% 이산화탄소에서 섭씨 37도로 유지합니다.

섭씨 37도 HBSS의 4밀리리터로 플라스크를 세척합니다. 그런 다음 4ml의 완전한 배지를 추가하고 피질 성상세포를 5% 이산화탄소에서 섭씨 37도로 유지합니다. 배양액이 약 95% 합류점에 도달하면 5% 이산화탄소에서 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양물을 흔듭니다.

그런 다음 분리된 세포가 포함된 매체를 제거하고 섭씨 37도의 HBSS를 4밀리리터 더 사용하여 플레이트를 세척합니다. 그런 다음 4ml의 새로운 완전 배지를 추가하고 피질 성상세포를 위한 배양을 농축한 후 24시간 후에 세포를 다시 배양합니다. 2밀리리터의 완전한 미디어로 문화를 새롭게 하십시오.

그런 다음 섭씨 32도에서 관심 아데노바이러스의 10분의 10 pfu의 10분의 1 이상에 해당하는 1마이크로리터를 5%의 이산화탄소로 5%로 포함하는 1밀리리터의 완전한 배지로 세포를 배양합니다. Gfab CRE 감염은 재조합된 gfab 성상세포에서 증식 이점을 유발하여 배양에서 5-9회 통과 후 성상세포 순도를 59%에서 90% 이상으로 증가시킵니다. 6시간 후 배지가 포함된 바이러스를 제거하고 신선하고 완전한 배지에서 배양액을 다시 배양합니다.

피질 성상세포를 약 90%confluence에서 수확한 후 적절한 세포 수를 얼음처럼 차가운 5%메틸셀룰로오스에 재현탁합니다. 250마이크로리터 유리 주사기를 반복 항원 디스펜서에 넣은 다음 뭉툭한 18게이지 바늘을 주사기에 부착합니다. 18게이지 바늘을 사용하여 피질 성상세포를 주사기로 흡인하고 기포를 제거합니다.

그런 다음 18 게이지 바늘을 버리고 27 게이지 바늘을 주사기에 끼웁니다. 성상세포를 이식하기 위해 새 바늘에서 액체가 배출될 때까지 항원 디스펜서의 버튼을 누릅니다. 다음으로, 생후 3개월에서 6개월 된 면역 능력이 있는 수용 동물을 입체 안경테 내에 고정하고 귀와 눈 사이의 시상 봉합사 부분을 약 0.5cm 길이로 절개합니다.

관상동상동맥 봉합사 또는 BRE MA의 교차점과 시상 봉합사 또는 람다(Lambda)에서 양봉선의 교차점을 찾습니다. BMA와 람다가 동일한 수평면에 있는지 확인한 후 주사기와 반복 항원 디스펜서를 동물의 머리 위의 입체 액자에 부착하고 바늘 끝이 bgma에 닿도록 합니다. 바늘을 두개골 표면에서 약간 들어 올리고 bgma에서 옆으로 2mm, 옆으로 1mm 이동합니다.

그런 다음 바늘을 두개골을 통해 목적지까지 조심스럽게 내립니다. breg MA에서 4mm 복부로 이동하여 반복 항원 디스펜서를 활성화합니다. 5마이크로리터의 세포 현탁액을 한 번 주입합니다.

두개내 압력이 평형을 이룰 수 있도록 2분 동안 바늘을 제자리에 두었다가 면 스왑을 사용하여 30초에 걸쳐 천천히 바늘을 빼내고 발생할 수 있는 출혈에 압력을 가합니다. 마지막으로, 조직 접착제를 사용하여 상처 가장자리를 근사화하고 절개 부위를 봉합한 다음 동물을 깨끗하고 따뜻한 케이지에 넣어 회복합니다. 확립된 인간 세포주의 이종이식은 면역결핍 숙주를 필요로 하며 일반적으로 인간 성상세포종의 조직병리학을 재현하지 않아야 합니다.

예를 들어, U 87 MG orthotopic xenografts는 정상적인 뇌를 침범하지 않는 외접 종양을 형성합니다. 이와는 대조적으로, 면역 능력이 있는 syngeneic 마우스의 뇌에 T RRP null astrocyte를 주입하면 인간 마우스의 조직학적 특징, 특히 정상 뇌 조직의 침입을 요약하는 종양이 생성됩니다. TRP null 동종이식 성장을 모니터링하기 위해 세포 주입 후 5일마다 마우스를 희생하고 종양 부담은 h 및 e 염색된 뇌 절편의 종양 영역을 정량화하여 측정했습니다.

종양 부위는 시간이 지남에 따라 기하급수적으로 증가하는 것으로 확인되었으며, TP nll 성상세포의 1배에서 5분의 1을 수용자의 뇌에 주입하는 정orthotopic 주입은 신경학적 이환율을 유발했습니다. 평균 생존 기간은 22일입니다. 종적 in vivo 이미징은 종양 성장 역학을 정의하는 데 사용되었습니다.

따라서 본 실험에서는 TR penal astrocytes와 루시페라아제를 발현하도록 조작된 세포를 면역 능력이 있는 syngeneic의 뇌에 주입했습니다. 깔짚 짝짓기와 종양 성장은 연속 생물 발광 이미징에 의해 결정되었습니다. 16일 동안 생물 발광이 15배 증가하는 것이 관찰되었습니다.

이 절차에 따라 약물 검사를 시험관 내 및 생체 내에서 수행하여 효능을 결정하고 새로운 약물 조합을 테스트할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 조건부 유전자 조작 마우스에서 비크레아 발현 마우스에서 피질 성상세포를 채취하는 방법, 체외에서 유전자 재조합을 유도하는 방법, 면역 능력이 있는 마우스에서 정형소 동종이식을 사용하여 종양 발생을 모델링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.