단일 가닥 DNA 타일에서 단지 두 차원 모양의 자기 조립 (self-assembly)

다음 실험의 전반적인 목표는 단일 가닥 타일로 복잡한 DNA 나노 구조를 형성하는 것입니다. 이는 두 번째 단계로 원하는 DNA 나노 구조를 형성하기 위해 원하는 완충 용액에 신중하게 설계된 합성 DNA 가닥을 혼합함으로써 달성됩니다. 샘플은 구조 자체 조립이 이루어지는 동안 무릎을 꿇습니다.

다음으로, 나노 구조의 성공적인 형성을 확인하기 위해 천연 아그로스 겔 전기영동 및 원자력 현미경 이미징을 수행합니다. 결과는 네이티브 아그로스, 겔 전기영동 및 원자력 현미경 이미징을 기반으로 자체 조립된 DNA 나노 구조를 보여줍니다. 일반적으로, 이러한 자가 조립체의 시료 준비는 복잡해 보였기 때문에 이 방법을 처음 접하는 개인은 어려움을 겪을 것입니다: 이 절차를 시작하기 전에, Vbo 96 웰 플레이트의 RNA에 용해된 유리 물, 24개의 나선에 대한 362개의 웰 각각에서 1마이크로리터를 28회전으로 피펫합니다.

직사각형 : 2 밀리리터 시험관에 가닥 당 100 마이크로 몰을 추가합니다. 그런 다음 138마이크로리터의 증류수 탈이온수를 시험관에 추가하여 원액을 만듭니다. 가닥 당 200 나노 어금니의 농도에서.

50 마이크로 리터의 200 아노 몰 스톡 용액을 추가합니다. 10 x 어닐링 버퍼 A 10 마이크로 리터와 증류수 40 마이크로 리터를 0.2 밀리리터 PCR 튜브에 넣습니다. 그 후 열 순환기에서 17시간 동안 샘플을 섭씨 90도에서 25도로 냉각합니다.

SYBR 금고가 미리 칠해진 기본 2% 아그로스 젤을 준비한 후 얼음물 수조에서 100볼트로 2시간 동안 실행합니다. 완성 된 이미지는, 청색광 Transluminator에 SYBR 안전 얼룩에 대한 적절한 필터와 젤 스캐너를 사용하여 날카 롭고 깨끗한 면도날을 사용하여 1, 500 염기 쌍의 밴드와 유사한 이동성을 가진 우성 밴드를 절제합니다. 원하는 젤 조각을 스핀 컬럼에 넣은 다음 마이크로 튜브 Pele를 사용하여 젤을 미세한 조각으로 부순 다음 438G에서 섭씨 4도에서 3분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후. 260나노미터에서 자외선 분광 광도계를 사용하여 DNA의 농도를 측정합니다. 이 시점에서 스카치 테이프를 사용하여 표본 금속 디스크에 부착된 MICA를 벗겨내어 평평한 표면을 만들고 표본 디스크를 현미경의 이미징 스테이지에 놓습니다.

40마이크로리터의 1개 x 및 무릎 꿇은 완충액 A를 추가한 다음 24개의 HELOC의 정제된 샘플 5마이크로리터를 갓 절단된 미카 표면에 직사각형으로 28바퀴 돌립니다. 혼합물이 약 2분 동안 가라앉을 때까지 기다립니다. A FM 실리콘 아질산염 캔틸레버 칩을 캔틸레버 홀더에 설치하고 2마이크로미터의 스캔 크기(해상도 1024줄)를 사용하여 유체 태핑 모드에서 샘플을 이미지화합니다.

및 직사각형의 8개의 내부 타일 및 6개의 경계 타일에 대한 3개의 프라임 17 뉴클레오티드 세그먼트에 부착된 내부 라벨링에 대한 0.5 내지 1 헤르츠의 스캔 속도. 손잡이가 있는 28개의 가닥을 24개의 HELOC의 나머지 구성 요소 가닥과 28회 직사각형으로 혼합하여 경계 라벨링을 위한 200 NANOMOLAR 스톡 용액을 만듭니다. 손잡이가 있는 14개의 가닥을 24개의 힐 바다의 나머지 구성 가닥과 28바퀴 직사각형으로 혼합하여 내부 라벨링을 위한 200나노몰 스톡 용액을 얻습니다.

경계 라벨링을 위해 200 나노몰 스톡 용액 50마이크로리터를 추가합니다. 100마이크로몰 비오틴 변형 안티 핸들 가닥 60마이크로리터. 10 x 어닐링 버퍼 A 10마이크로리터 및 증류수 탈이온수 34마이크로리터를 A PCR 시험관에 넣습니다.

내부 라벨링을 위해 50마이크로리터의 200나노몰 원액을 추가합니다. 3 마이크로 리터의 내부 안티 핸들 비오틴 수정 가닥은 100 마이크로 몰에서 변형됩니다. 10 x 어닐링 버퍼 A 10 마이크로리터와 증류 탈이온수 37 마이크로리터를 PCR 시험관에 넣습니다.

다음으로 증류수 3ml에 소변기 포름산염 0.06g의 무게를 잰다. 2% 수성 소변기 포름산염 얼룩 용액을 준비하려면 주사기에 부착된 0.2마이크로리터 필터를 사용하여 염색 용액을 여과합니다. 5마이크로리터의 5가지 일반 수산화나트륨을 여과된 염색 용액 1ml에 첨가합니다.

20에 해결책 분리기를 짧게 와류 후에, 000 G 빛내. 다음 설정을 사용하여 코팅된 면이 위를 향하도록 탄소 코팅된 그리드를 배출합니다. 완료되면 3.5마이크로리터의 샘플을 글로우 방전 처리된 그리드에 피펫팅합니다. 4분 후, 여과지 조각을 사용하여 측면에서 그리드와 접촉하여 샘플을 흡수합니다.

그런 다음 즉시 3.5마이크로리터의 염색 용액을 그리드에 추가합니다. 1분 후 얼룩을 제거하고 여과지를 그리드에 1-2분 동안 유지합니다. 그리드를 TEM 시편 홀더로 옮깁니다.

A-J-E-O-L GM 1400을 사용한 이미지, 10K에서 80K까지의 배율로 80킬로볼트에서 작동.모양이 식별되면 분자 캔버스의 모양에 해당하는 가닥을 선택합니다. 노출된 도메인을 10 - 11 뉴클레오티드 길이의 폴리 T 세그먼트로 교체하거나, 노출된 도메인을 보완하는 가장자리 보호기를 추가하고 10 - 11 뉴클레오티드 길이의 폴리 T 세그먼트로 종결합니다. 응집을 방지하려면 코르셋을 포함하는 310픽셀 분자 캔버스에 대한 가닥 라이브러리를 만듭니다.

1 개 세트 별 2 개 세트, 3 개 별 및 4 성 세트 총 1, 344 개의 가장자리 프로텍터를 제공합니다. 서로 다른 세트에 대한 96개의 웰 플레이트를 원심분리한 후, 코어 세트에서 206개 가닥으로 구성된 1마이크로리터, 세트에서 0개, 세트에서 별 2개, 별 3개 및 세트 4에서 24개의 가닥을 2밀리리터 원심분리 튜브에 피펫팅합니다. 튜브에 20마이크로리터의 증류수 탈이온수를 추가하여 DNA 가닥의 400나노몰 스톡 용액을 만듭니다.

다음으로, 50 마이크로리터의 400 나노몰 원액을 첨가한다. 10 x 어닐링 버퍼 B 10 마이크로리터와 증류된 탈이온수 40 마이크로리터를 0.2 밀리리터 PCR 튜브에 넣고 앞서 설명한 바와 같이 열 순환기에서 17시간 동안 혼합물을 가열한다. 샘플을 정제하고 DNA 농도 이미지를 측정한 후, 이전과 동일한 방식으로 FM을 사용하는 샘플은 최종적으로 평행 heoc의 수와 나선형 회전의 수를 단순히 변경하여 다른 크기의 직사각형을 구성합니다.

단일 연선 타일의 자체 조립은 24개의 HELOCs를 28회 회전하며, 서로 다른 단일 연선 타일에 대한 직사각형 DNA 염기서열을 수정하고 최적화하여 연쇄구균 분할을 가능하게 하고 직사각형을 튜브로 변환하는 라벨링을 가능하게 할 수 있습니다. 다양한 크기의 튜브와 직사각형을 형성하기 위한 단일 가닥 타일의 프로그래밍 가능한 자체 조립과 분자 캔버스 도메인 치환 설계 및 가장자리 보호기 설계를 사용하여 2차원 임의 형상을 구성하는 것은 임의의 형상의 노출된 도메인을 따라 응집에 대한 솔루션으로 테스트되었습니다. 두 설계 모두 젤 수율과 구조적 무결성이 비슷하지만, 엣지 프로텍터 설계는 보조 종이 더 적기 때문에 비용 효율적입니다.

이 비디오를 시청한 후에는 단일 가닥 타일을 기반으로 복잡한 DNA 나노 구조를 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.