전기 방사를 적응하는 것은 트라이 계층에 대한 세 가지 독특한 환경을 제공하기 위해

이 절차의 전반적인 목표는 3차원 상성(phasic) 지지체를 전기 방사하여, 완전히 분화된 성인 인간 세포를 공동 배양함으로써 이 세포들이 C two에서 접하는 천연 세포외 기질을 재현하는 것입니다. 이는 먼저 무작위로 배열된 마이크로섬유 지지체를 전기 방사함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 마이크로섬유 지지체 위에 무작위로 배열된 나노섬유 층을 직접 전기 방사하여 이상성(biphasic) 지지체를 형성하는 것입니다.

다음으로, 별도의 정렬된 나노섬유 스캐폴드를 전기방사합니다. 마지막 단계는 각 스캐폴드에 각각의 세포 유형을 파종하고, 단일 구조체로서 관류 바이오리액터 시스템 내에서 스캐폴드들을 공배양하는 것입니다. 최종적으로 매개체 방출 측정 및 면역 염색을 통해 다세포 상호작용을 분석할 수 있습니다.

구성체. 이 기술이 2D 형질전환 막과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은, 전기 방사 스캐폴드가 생리학적으로 유의미한 형태를 제공하도록 조절 가능한 3D 섬유질 환경을 제공한다는 것입니다. 이는 더 다공성인 구조이며 여러 세포 유형의 공동 배양을 가능하게 합니다.

이 방법은 코호트, 질환 또는 건강한 상태의 인간 세포를 인비트로(in vitro) 모델로 사용하여 안정적인 플랫폼을 제공합니다. 이를 통해 인간 질병과의 관련성 측면에서 한계가 있는 동물 모델에 대한 의존도를 낮추고, 실험에 사용되는 동물의 수를 줄이는 데 도움이 될 것입니다. 이 방법은 천식 및 COPD와 같은 질병에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 장의 염증성 질환 연구나 화학 물질 테스트를 위한 피부 모델 개발과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.

먼저, 클로로메탄과 트리클로로아세트산의 1:1 혼합액에 PET를 각각 8%, 10%, 30% 농도로 용해하여 세 가지 서로 다른 10 mL PET 용액을 준비합니다. PET를 완전히 용해시키기 위해 용액을 실온에서 하룻밤 동안 교반한 후 다음 날 사용합니다. 준비된 PET 용액을 주사기에 옮겨 담고, 8% 혼합액이 담긴 주사기에는 23 gauge 바늘을, 10% 및 30% PET 용액이 담긴 나머지 두 주사기에는 18 gauge 바늘을 장착합니다.

마이크로섬유 스캐폴드를 준비합니다. 먼저, 30%PET 용액이 들어 있는 주사기를 바늘 끝이 아래를 향하도록 주사기 펌프에 장착합니다. 드럼에서 15 centimeters 떨어진 곳에 매니폴드를 배치하고, 바늘이 드럼의 중심을 향하고 있는지 확인합니다.

금속제 악어 클립을 사용하여 양극 전원 공급선을 바늘 팁에 연결하고, 접지선을 바나나 소켓에 연결하여 manl을 접지합니다. 모터를 켜고 manl 속도를 60 RPMs로 설정합니다. 시린지 펌프를 켜서 2.0 milliliters per hour의 유속이 제공되도록 합니다.

마이크로섬유 지지체를 제작하는 동안, 바늘 내의 공기를 제거하여 시스템을 프라이밍하기 위해 용액이 바늘 끝에서 압출될 때까지 펌프를 작동시킵니다. 그 다음 시린지 펌프의 펌프 작동을 중단합니다.

배출될 용액의 총 부피를 2 mL로 설정하고 펌프를 작동시킵니다. 다음으로, 바늘과 맨드릴 사이에 14 kV의 전압을 인가하여 30% PET 용액 2 mL가 전기방사될 때까지 1시간 동안 전기방사를 수행합니다. 마이크로파이버 스캐폴드가 맨드릴에 부착된 상태에서 전압을 끕니다. 악어 클립을 제거하고 30% PET 용액이 들어 있는 시린지를 8% PET 용액이 들어 있는 시린지로 교체합니다.

그 다음 악어 클립을 23 gauge 바늘에 다시 연결합니다. 시린지 펌프의 유속을 0.5 milliliters per hour로 변경하고, 용액이 팁에서 흘러나올 때까지 시린지 펌프를 작동시켜 바늘을 프라이밍합니다. 맨드릴이 60 RPMs로 계속 회전하는 상태에서, 바늘 팁과 맨드릴 사이에 14 kilovolt 전위를 인가하고, 시린지 펌프에 의해 압출될 총 부피를 2 milliliters로 설정합니다.

8% PET 용액 2 mL가 전기 방사될 때까지 4시간 동안 전기 방사를 수행합니다. 전기 방사가 완료되면 전원 공급 장치와 맨드릴을 회전시키는 모터를 끕니다. 맨드릴의 표면적 크기의 2D 시트 형태 스캐폴드를 제작하기 위해, 칼을 사용하여 맨드릴의 너비 방향을 따라 이상성 스캐폴드를 절단합니다.

정렬된 PET 스캐폴드를 준비하려면, 10% PET 용액이 담긴 시린지를 바늘 끝이 아래를 향하도록 시린지 펌프에 장착하십시오. 그런 다음 바늘에 악어 클립을 연결하십시오. 유량을 시간당 0.5밀리리터로 설정하고 바늘 내부에 PET 용액을 채워 프라이밍하십시오.

그런 다음 모터를 켜고 맨드릴 회전 속도를 2000 RPMs로 설정합니다. 이어서 시린지 펌프를 켭니다. 전압 공급 장치를 14 kilovolts로 설정하고 전원을 켜서 2 milliliters의 용액이 전기 방사될 때까지 4시간 동안 전기 방사를 진행합니다.

전기 방사가 완료되면 전원 공급 장치와 모터를 끕니다. 맨드릴의 너비를 따라 블레이드로 스캐폴드를 절단하여 정렬된 2D 시트 형태의 스캐폴드를 제작합니다. 정전기 전하를 줄이기 위해 전기 방사된 스캐폴드를 알루미늄 호일에 싸서 보관합니다.

0.8 밀리미터 직경의 생검 펀치(biopsy pen)를 사용하여 SPU 시트에서 이상성(biphasic) 또는 정렬된 스캐폴드 디스크를 펀칭하여 추출합니다. 그다음, 독성이 없는 수족관용 접착제를 사용하여 이상성 스캐폴드 디스크를 가스켓에 접착합니다. 가스켓과 스캐폴드를 12웰 조직 배양 플레이트에 넣습니다.

가스켓과 스캐폴드를 자외선 I 조사기로 스캐폴드의 각 면당 30분씩 멸균합니다. 그 다음, 20% 항생제-항진균제 용액에 담가 4°C에서 하룻밤 동안 침지시킨 후 다음 날 꺼냅니다. 스캐폴드를 PBS로 3회 세척하고, 사용 전까지 4°C의 PBS에 보관합니다.

이상성 스캐폴드를 PBS에서 새로운 12 Well 플레이트로 옮기고, 10% FCS가 첨가된 DMEM 배지에서 37°C로 1시간 동안 온도를 높입니다. DMEM 첨가 배지를 제거하고, 스캐폴드의 마이크로파이버 상이 위를 향하게 놓은 뒤, 섬유아세포의 스캐폴드 내부 침투를 돕기 위해 30 µL의 DMEM 첨가 배지에 15,000개의 MRC-5 섬유아세포 세포를 현탁하여 각 스캐폴드 위에 접종합니다. 플레이트를 오비탈 셰이커에 올리고 100 RPM으로 2시간 동안 스캐폴드를 진동시킵니다.

그 다음, 각 스캐폴드에 DMEM 보충 배지 2 mL를 첨가하고 37°C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 웰에서 배지를 제거하고 스캐폴드의 나노섬유 상이 위쪽을 향하도록 뒤집습니다. 그런 다음 10% FCS가 보충된 DMEM/F12 배지 30 µL에 현탁된 30,000개의 Cal-3 상피 세포를 스캐폴드의 나노섬유 상에 파종합니다.

스캐폴드를 37 °C, 5% carbon dioxide 환경에서 2시간 동안 배양한 후, D-M-E-M-F 12와 DMEM 보충 배지의 70:30 혼합액에 스캐폴드를 담그고 12시간 동안 정적 배양을 지속하여 기도 평활근 세포를 배양합니다. 먼저, 정렬된 스캐폴드를 PBS에서 새 12-well 플레이트로 옮긴 후, 이를 DMEM 보충 배지와 함께 37 °C에서 1시간 동안 가온합니다. DMEM 보충 배지를 제거하고, 30 µL의 DMEM 보충 배지에 부유된 25,000개의 기도 평활근 세포를 각 스캐폴드에 첨가한 뒤 37 °C, 5% carbon dioxide 환경에서 2시간 동안 배양합니다.

부착이 완료되면, 보충제가 첨가된 DMEM 배지에 스캐폴드를 담급니다. 이를 인큐베이터로 옮겨 하룻밤 동안 배양한 후, 바이오리액터에서 삼중 배양을 설정합니다. 다음 날, 상피 세포 층이 챔버 위쪽을 향하도록 하여 이상성 시드 스캐폴드를 바이오리액터 챔버에 넣습니다.

그 다음, 정렬된 스캐폴드를 이상성 스캐폴드의 아래쪽에 배치하여 이상성 스캐폴드의 마이크로파이버 상과 인접하게 합니다. 바이오리액터의 두 챔버를 함께 잠급니다. 그 후, 동반된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 인큐베이터 내에 두 개의 관류 흐름 회로를 조립하고, 일주일 후에 연동 펌프를 사용하여 약 0.1 milliliters per minute의 속도로 두 회로에 배지를 펌핑합니다.

상단 챔버와 배양액에서 배지를 제거합니다. 바이오리액터에서 2주간 배양한 후, 분석 전 추가로 1주일 동안 공기-액체 계면에서 상피 세포를 배양합니다. 여기에 제시된 삼중 배양 스캐폴드를 고정 및 절편화하여 구조체의 세 층 전체에 분포된 세포 핵을 확인하였습니다. 세포 핵은 DPI로 염색되어 파란색으로 나타나며, 스캐폴드 재료는 회색으로 나타납니다. 여기에는 상피 세포, 섬유아세포, 평활근 세포를 각각 파종하기 위해 제작된 전기방사 나노섬유, 마이크로섬유 및 정렬된 스캐폴드의 주사 전자 현미경 이미지입니다.

세 가지 세포 유형 모두 2주 동안 각각의 스캐폴드에서 배양했을 때 생존율이 증가하는 것을 보였습니다. 또한, 각 세포는 2주의 배양 기간 이후에도 세포 유형 특이적 단백질을 계속해서 발현했습니다. 이 절차를 수행할 때는 전기방사 섬유로 재현하고자 하는 천연 세포외 기질에 대해 조사하는 것이 중요합니다.

세포는 서로 다른 3D 지형에 부착될 때 각기 다르게 행동합니다. 예를 들어, 상피세포는 나노 섬유 위에서 배양될 때만 기능적 장벽을 형성합니다. 이 영상을 시청한 후에는 동적 배양 환경 내에서 세포 간 상호작용 연구에 사용할 수 있는 다층 공배양 시스템을 구축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

본 절차를 수행하는 동안 사용하려는 폴리머 및 용매 시스템에 맞게 유량 및 전압과 같은 전기 방사 파라미터를 조정하는 것이 중요하다는 점을 잊지 마십시오. 이는 원하는 섬유를 생성하는 데 결정적인 역할을 합니다. 또한, 용매가 적절히 배출될 수 있도록 환기 시설이 갖춰진 후드나 보관함 내에서 전기 방사를 진행하십시오.