Name: 전기 방사를 적응하는 것은 트라이 계층에 대한 세 가지 독특한 환경을 제공하기 위해 체외기도 벽의 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 배우세요 전기방사 기술을 이용한 3D 기도 벽 모델 제작 방법을. 미세섬유와 나노섬유 스캐폴드를 사용하여 성인 인간 세포의 공동 배양을 가능하게 하고, 천식 및 COPD 같은 호흡기 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

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이러한 AirPROM 결과로 이어진 연구는 보조금 계약 n° 270194에 따라 유럽 연합으로부터 자금을 지원받았습니다.이 연구는 또한 NC3Rs(National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research)와 EPSRC(Engineering and Physical Research Centre) 재생 의학 박사 교육 센터(DTC)의 자금 지원을 받았습니다. 영국

비 천식 개인의 기본 ASM 세포 글렌 병원 전술 한 바와 같이 (레스터, UK)에서 기관지 생검으로부터 분리 하였다. 이 연구는 레스터 셔 윤리위원회에 의해 승인 된 환자는 서면 동의서를 주었다. 1. 전기 방사 PE​​T 공사장 공중 발판 (그림 2) <ol><li> - 트리 플루오로 아세트산 (TFA) 용액 (1) 디클로로 메탄 (DCMro) : 1의 음료 병 등급 PET의 용액 (10 ㎖)을 준비한다. 8 %, 30 % 및 10 % 중량 / 부피 (중량 / 부피)의 PET 농도는 나노, 마이크로 화이버 필요하고 비계를 각각 정렬 애완 동물이 용해에 대한 다음 솔루션 O 실온에서 / N을 자극한다. </li><li> 주사기로 애완 동물 솔루션을 전송하고 주사기 (나노 섬유에 대한) 23-G 또는 18-G (마이크로 화이버 및 정렬) 바늘을 부착 전동 주사기 펌프에 주사기를 놓습니다. 바늘의 포인트가 아래로 회전되어 있는지 확인합니다. </li><li> 엄마의 위치를바늘을 보장 떨어진 바늘의 선단으로부터 15cm ndrel는 드럼의 중심에서 지적된다. </li><li> 악어 클립 바늘 끝으로 전기 공급을 부착하고 지구 (바나나 소켓을 통해) 맨드릴을 접지. 나노 및 마이크로 비계 용 (약 13.2 m · 분 -1에 해당) 60 rpm으로 전원 맨드릴에 공급하고 설정 속도에 전환합니다. 대한 정렬 비계 (약 440m · 분 -1에 해당) 2,000 rpm으로 설정 속도. </li><li> 0.5 ML의 유량 주사기 펌프를 설정 · 시간 -1 나노 섬유 랜덤 정렬 비계 또는 2.0 ml의 용 · 시간 -1 마이크로 화이버 발판합니다. 용액이 바늘에서 임의의 공기를 제거하기 위해 바늘 끝로부터 압출 될 때까지 펌프가 실행될. 그런 다음 펌프를 중지합니다. </li><li> 주사기 펌프, 용액의 전량을 2 ml의 배출 펌프를 시작하도록 설정한다. </li><li> 전원 SUPP에 설정 전압 14 kV의에 공급하고, 스위치LY. </li><li> Electrospin 용액 2 ml의 전기 방사 될 때까지 (나노 섬유 정렬 발판 4 시간, 마이크로 화이버 발판 1 시간). </li><li> 맨드릴의 폭을 따라 블레이드 비계를 잘라. 이는 (이 경우, 직사각형의 시트 22cm X 11cm) 발판의 2D 시트 맨드릴 표면적의 크기 신중 맨드릴을 박리 할 수​​ 있음) 생성한다. ) 정전기를 줄이기 위해 알루미늄 호일의 발판을 저장합니다. 참고 : 바이 페이 비계가 순차적 마이크로 화이버 지지체에 직접 나노 섬유 지지체를 전기 방사에 의해 생성된다. </li></ol> 세포 배양에 사용하기 전에 비계의 2 살균 <ol><li> 발판 시트에서 0.8 mm 직경의 생검 펜을 사용 이상성 또는 정렬 비계의 디스크를 펀치와 비 독성 수족관 접착제를 사용하여 개스킷 스틱. </li><li> (20)에 침지하기 전에 지지체의 각 측면에 30 분 동안 자외선을 조사하여 멸균 비계% 부피 / 부피 안티 곰팡이 / 항생제 용액 (2 × 5 개 ml의 -1 페니실린 G, 2,000 mg의 ml의 -1 스트렙토 마이신 황산염과 500 μg의 ml의 -1 암포 테리 신 B) O / 4 ℃에서 N. </li><li> 사용할 때까지 4 ° C에서 PBS로 PBS에서의 TCP 웰 플레이트에 3 번 한 다음 저장 발판을 발판을 씻으십시오. </li></ol> 3. 세포 배양 미디어 성분 <ol><li> DMEM-F12 배지에서 배양 CALU3 상피 세포 (10 % 부피 / 권 소 태아 혈청 (FCS), 2 nM의 L- 글루타민 용액, 1 % 부피 / 부피 항생제 / 항진균제 용액 1 만대 ml의 -1 페니실린 G를, 100 mg의 보충 ml의 -1 스트렙토 마이신 황산염 25 μg의 ml의 -1 암포 테리 신 B). </li><li> DMEM 배지에서 배양 MRC5 섬유 아세포와 ASM 세포 (10 % 부피 / 권 소 태아 혈청 (FCS), 2 nM의 L- 글루타민 용액, 1 % 부피 / 부피 항생제 / 항진균제 용액 1 만대 ml의 -1 페니실린 G, 1 보충00 mg을 ml의 -1 스트렙토 마이신 황산염 25 μg의 ml의 -1 암포 테리 신 B). </li><li> 문화 상피 - 섬유 아세포 - ASM 세포의 공동 문화 70:30 DMEM-F12에 : DMEM 미디어 혼합물. </li></ol> 바이 페이 비계 위에 섬유 아세포와 상피 세포의 4. 시드 <ol><li> 조직 배양 접시에, DMEM-보충 미디어의 발판을 흡수 세포 파종 전에 1 시간 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> , DMEM-보충 용지를 제거 치근단 발판의 마이크로 화이버 단계를 배치하고 DMEM-보충 미디어의 30 μL에 1.5 X10 4 MRC5 섬유 아세포 씨앗. 공기 O / N 37 ° C 5 % CO 2 인큐베이터에서 떠나기 전에, 2 시간 동안 궤도 통에 판을 선동. </li><li> 그래서 발판의 나노 단계가 치근단면을 통해 지지체의 나노 단계에 DMEM-F12-보충 미디어의 30 μL에서, 종자 3.0 X10 4 CALU3 상피 세포를 지지체를 켜고 fo를 품다R 70:30 DMEM-F12에 발판을 잠수 전에 공기를 37 ℃에서 2 시간, 5 % CO 2 : DMEM-보충 미디어 O / N 전에 생물 반응기를 전송합니다. </li></ol> 정렬 발판 위에 ASM 세포의 5. 시드 <ol><li> 조직 배양 접시에, DMEM-보충 미디어의 발판을 흡수하고 2 시간 (37 ℃, 5 % CO에 대한 DMEM-보충 미디어의 30 μL에 2.5 X10 4 셀 시드 및 배양하기 전에 37 ℃에서 1 시간 동안 배양 2 공기). 인큐베이터와 O를 떠나 DMEM-보충 미디어 대가로 발판을 잠수함 / N 생물 반응기에서 트라이 문화를 설정하기 전에. </li></ol> 6. 설정 업 생물 반응기 시스템을 사용하여 트라이 문화 (그림 7) <ol><li> 상피 단계는 챔버로 위를 향하게 한 챔버 내 홈에 이상성 발판 가스켓을 놓습니다. </li><li> 이상성 발판 아래에 정렬 된 지지체를 배치 (그래서 MI 인접crofiber 이상성 비계의 상)과 함께 생물 반응기의 두 개의 챔버를 잠급니다. </li><li> (DMEM-F12 / DMEM 함유 기초 저장 미디어 혀끝의 저수지에 DMEM-F12-보충 미디어)이 회로 주위 펌프 미디어가 약 0.1 ml / 분 연동 펌프를 사용하여 두 매체 저수지에 연결된 두 개의 관류 흐름 회로를 조립 (40 ml의 미디어는 각 회로를 통해 재활용). 하우스 37 ℃, 공기 중 5 % CO 2 인큐베이터 내에서 시스템의 모든 부품. </li><li> 일주 후, 분석 한 후 적어도 일주일 동안 알리의 상피 세포를 혀끝 챔버에서 용지를 제거하고, 문화. </li></ol>

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자연 ECM에 비해 구조적 특성을 가진 고분자 섬유를 electrospin하는 기능은, 이러한 환경을 재현하기 위해 전기 방사되는 수많은 천연 또는 합성 폴리머, 또는 폴리머 블렌드하게되었다. 가능한 모든 영향 골격 특성 (중합체의 선택, 중합체 농도, 용매, 바늘 끝의 거리와 온도 포함) 공정 변수의 조작; 그러나 일부 매개 변수는 다른 25보다 비계의 특성에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. PET 섬유 직경을 수정하는 경우, 우리가 사용하는 중합체의 농도, 중합체 용액을 전기 방사되었을 때의 속도와 직경의 바늘로 주요 파라미터를 발견했다. 정렬 된 섬유를 전기 방사 할 때 키 파라미터 (회전 맨드릴) 사용 수집 방법 및 속도로 맨드릴 회전한다. 60 rpm으로 맨드릴 속도를 감소 통해, 우리는 생성 된 무작위로 정렬 된 비계 큰 발판 UNI을 보였다 발견의 적합성은 평평한 집 전판에 전기 방사에 비해. 탈세 포화 된기도 조직의 특성은 각각의기도 세포 유형의 배양을 위해 개발 된 다양한 골격 지형에 대한 지침을 제공하기 위해 분석 하였다. 전기 방사 나노 섬유는 세포 이동을 규제하는 동안 증가 된 대사 물질의 확산을 가능하게 작은 기공 크기하지만 전반적으로 높은 기공률로 인해 기저막 구조를 복제하는 매력적인 골격이다. 9 전기 방사에 매개 변수를 최적화하는 동안, PET 농도와 유량의 범위는 시험 하였다. 얇은 섬유는 다른 그룹에 의해 이전에 사용 된 6 % 중량 / 부피 PET 용액을 사용하여 달성 하였다. 그러나, 높은 수준의 비딩 및 균일 성의 결여는 일정한 문제였다. 비딩을 제거하는 초기 시도는 다양한 소스를 표면 장력을 낮추기 위해 용액에, 양이온 성 계면 활성제, 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 (CTAB)를 첨가하고, 테스트 포함애완 동물의. 계면 활성제의 첨가는 완전히는 아니지만, 비딩의 양을 감소시켰다. TFA 용매 용액 : 애완 동물 펠릿의 상업적 출처를 시도 후, 식품 등급 음료 병, PET 음료 병을 절단하고 DCM 이러한 용해하여 사용 하였다. PET 섬유 소스 균일 성 증가와 섬유 비딩의 감소의 결과로서이 사용. 중량 / 부피 8 %로 약간 용액 농도를 증가시키고 (23G에 18G) 바늘 직경을 감소시킴으로써 우리는 지속적으로 약 250 nm의 섬유 직경으로 결함이없는 나노 파이버를 만들었다. 전기 방사 나노 섬유 지지체는 어려운 비계의 수동 취급을 맨드릴에서 수집에 크게 정전이 될 수 있습니다. 이 회전하고 사용하기 전에 70 % IMS에 몸을 담근 후 알루미늄 호일의 발판을 저장하여 개선되었다. 이것은 전기 방사 과정에서 발판에 남은 잔여 정전 하를 방산하기 위해 나타났다. 최고를 제공하기 위해천천히, 무작위 정렬 나노 파이버가 생성 저농도 PET 용액을 전기 방사하여 : ographies기도 벽 내에 세 가지기도 세포 유형에 의해 발생한 각각의 미세 환경과 유사하게, 기본 전기 방사 프로토콜이 이러한 유형의 세포에 대한 세 가지 고유 골격을 생산하도록 채택 된 있는에 상피 세포 (RBM을 흉내 낸) 시드했다. 더 빠른 속도로 더 높은 농도 PET 용액을 전기 방사하여, 무작위 정렬 마이크로 섬유 (더 다공성 지지체의 제조)이되는 섬유 아세포 (RBM 바로 아래 서브 점막 영역을 흉내) 시딩 하였다 생성 하였다. 맨드릴 정렬 나노 파이버를 고속 회전에 저농도 PET 용액을 전기 방사하여, 섬유 배향 방향의 평활근 세포의 세포 시트를 제조하는 정렬 상으로 제작했다. 증가 된 섬유 직경이 큰 셀 penetratio있게 증가 기공 크기로 이어질N 발판으로 그렇게하는 것은, 진정한 3D 환경을 만드는 데 도움이. 마이크로 화이버 지지체는 세포가 지지체 내에서 여러면에 존재하는지 확인하기 위해 연구에서 섬유 아세포의 배양에 사용 하였다. 30 % 중량 / 부피에 PET의 농도를 증가시켜, 2.5 ㎛의 평균 직경을 가진 PET 섬유를 제조 하였다. 대경 섬유 (≈ 4 μm의)은 35 % 중량 / 부피 PET 용액을 사용하여 제조하였으나, 지지체 두께 균일 성이 손실되고, 개개의 섬유 사이에 높은 가변성이 명백했다. 마이크로 섬유 지지체의 기공 (각각 1.43 μm의 대 10.45 μm의) 나노 섬유 지지체로 측정보다 7 배 더 있었지만, 세포의 여전히 정적 시드 제한 세포 침투를 제공했다. 이는 동적 혼합기 궤도 이전 효과적인 것으로 방법을 사용하여 세포를 시딩함으로써 개선되었다. 매우 정렬 된 나노 섬유 지지체는 10 %를 전기 방사하여 만든중량 / 맨드릴 상 부피 애완 동물 솔루션은 2,000 rpm으로 회전 (≈ 440m · 분 -1). PET 섬유 농도가 낮은 농도에서 전시 불규칙한 물결 모양의 형태를 막기 위해 8 %로 증가 하였다. 섬유 배향 농도의 증가에도 불구하고, (랜덤 배향 대 216 내지 255 nm의 대) 평균 섬유 직경을 감소시켰다. 그들은 한 건조 전에 섬유 드로잉 맨드릴의 고속이 효과가 발생할 가능성이있다. 섬유의 배향 ASM 세포의 배향에 영향을, 또한 다른 21 특성화되었다 ASM 세포에 다른 생리 효과를 갖는다. 이 프로토콜의 주요 한계는 샘플을 희생하지 않고 결정하는 것은 불가능 장기간에 걸쳐 초기 세포 부착 또는 분화를 만들기 비계의 ON / 화상 생균에 없다는 것이다. 즉, 수정, 이것은 대부분의 최적화 배양 기간 이후에 발생하는 것을 의미샘플을 보내고 다음 세포 배양은 세포 배양시하지 후 성공 여부를 측정. (분홍색 파란색) 알라 마르 블루 배양 지지체의 색 변화를 관찰하면 세포가 존재하고 실행 가능한 있습니다 나타내지 만 적합하지 않습니다. 젤라틴과 같은 전기 방사 더 투명 고분자 지지체에 세포를 시각화에 도움을 수 있습니다. 우리의 모델 내에서 나노 섬유 지지체의 전기 방사 마찬가지로 상피 세포가 상주하는 고밀도 나노 섬유로 구성된기도 RBM의 복제를 허용했다. 이것은 이전에 면역 세포 (데이터 미도시) 할 수 있지만, 구조가 세포, 나노 섬유 지지체 (22)를 통해 이전 할 수있는 것으로 나타났다. 3 차원 표면에 특정 세포 유형의 배양하는데 유리하다 니 (상피 및 내피 세포와 같은)을 통해 나노 파이버 구조 세포 이동의 방지는 다른 종류의 세포 배양 해로울 수있다. 평활근은 일을 통해 마이그레이션 할 수 없습니다로E 정렬 나노 지지체 우리는 (두 종류의 세포를 분리 정렬 지지체 대향) 서로 마주 평활근 및 섬유 아세포 층과 3 중층 공 배양을 조립. 이 세포가 가까운 동격에있을 수 있습니다 반면, 본 연구는 하나의 셀 타입 (섬유 아세포 또는 평활근 하나) 더 장기간의 배양 기간 동안 전체 층을 따라 잡을 것이라는 결론을 내릴 수 없습니다. 이러한 제한에도 불구하고,기도 벽 가능한 트라이 레이어 모델이 여러 세포 유형 간의 상호 작용을 조사하기 위해 다른 플랫폼을 제공하는 개발되었다. 섬유 아세포는 내가 내강면 (17) 내에서 외부 표면과 상피 세포에 접종 평활근과 하이드로 겔 원통형 콜라겐에 포함 된 경우와 유사한 3 중층 연구는 최근에 출판되었습니다. 유사한 관상을 허용 여기 개발 전기 방사 비계의 기계적 안정성이 형성되도록 구축하고, 현재 resea의 유지RCH는 우리 그룹 내에서 목표로하고 있습니다. 연구이 연구에서 강조 바디 주 내의 여러 장기 기본적인 점막 구조 단위 및 세입자 수정을 통해기도에 집중했다 반면, 유사한 플랫폼은 혈관, 방광 포함 기저막 유닛을 함유하는 조직을 위해 개발 될 수있다 콜라겐 기반 다중 레이어 모델을 채용 한 각막.

재생 의학 및 조직 공학의 분야는 빠르게 기관 및 신장 재생이 주목할만한 최근의 성과에 돌파구로 진행된다. 조직 공학에서 개발 된 생체 재료는 덜 전문 실험실에 이러한 프로토콜을 전송 할 수있는 기회, 더 접근되고있다. 생체 물질의 사용 증가를 통해 이익을 준비하는 하나의 필드는 체외 진단이다. 시험관 연구에서 단일 세포 유형 내에서 세포 내 신호 전달 경로를 조사하는 중요한 플랫폼이며, 수많은 질병 pathophysiologies을 기본 메커니즘의 윤곽을 도왔다. 이러한 연구는 일반적으로 조직 배양 플라스틱 (TCP)에 단층으로서 배양 한 세포 형에 의존하고; 훨씬 덜 탄성 다공성 3 차원 환경 세포보다 2 차원 강성 표면은 조직 또는 기관 내에서 노출된다. 동물 모델은 전통적 E왔다또한 전체 조직 번역 관내에서 발견 효과를 확인 mployed, 또한 인간의 질병을 조사 전임상 플랫폼으로서 사용될 수있다. 그러나, 간 종의 차이는 인간의 질병에 대한 우리의 이해에 동물 모델에이 신뢰를 훼손 -. 예를 들어, 폐 질환, 천식 훨씬 이해가 작은기도 평활근 다발의 비만 세포 침윤의 증거, 또는 동물 내에서 자발적인 질병 발전 용량을 포함한 사람의 상태와 모델 사이의 본질적인 차이에도 불구 마우스 모델에 기초 3,4 모델. 영국 및 기타 국가에서 권장되는 동물 실험에서 &quot;교체, 정제 및 감소&quot;의 &quot;3RS&quot;표준 동물 모델의 사용에 대한 윤리적 고려 사항도 있습니다. 매력적인 대안은 체외 만들기 구조에서 인체 조직의 재현부 것s는 하나의 단위로 성인의 세포 유형 간의 협력 특성을 알아보고자 하였다. 세포는 독특한 미세 환경 내에서 각 조직 내에 3D 다세포 구조에 존재한다. TCP에 세포의 배양은이 환경을 복제 또는 다중 세포 배양을위한 능력을 제공 할 수없는 세포 단층의 배양을 허용한다. 생체 재료의 발전은 세포 배양을위한 천연 및 합성 3D 플랫폼을 모두 개발할 수있는 기회를 제공한다. 줄기 세포를 포함 하나, 다른 세포 유형 recellularized 때 탈세 포화 된 ECM은 크게 조직 제한된 비 - 인간 기원의 가용성 그러나 이러한 프로토콜은 복잡하고 시간 소모적 일 수 있고, 3 차원 세포 배양에 사용될 수있다. 다른 프로토콜은 나노 임 프린팅, 전자 재료 증착, 세포 시트 기술, 또는 전기 방사 등의 생성 세포의 환경을 더 잘 제어 할 수 있습니다. 전기 방사 나노 미터에서 마이크로 미터까지 직경, R와 섬유 부직포 3D 다공성 매트를 생성자연 ECM 치수를 eplicating. 전기 방사 발판이 점점 3D 세포 배양 플랫폼으로 채택되고있다 -. 전기 방사 매개 변수의 조작은 기공 크기, 섬유 직경, 지형과 정렬 및 표면 화학 등의 골격 특성을 통해 복잡한 제어 할 수 있습니다. 세포를 분리하여 배양 한 경우와 같은 파라미터들의 변경은, 직접적으로 세포 부착 및 성장에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이러한 장점은 3D 모델 조직 구조로서기도 세기관지를 사용하여 단일 차원 조직 구조로 여러 종류의 세포를 배양 할 수 있도록 본 연구에 이용되어왔다. 세기관지 벽은 세 가지 주요 영역 (그림 1)으로 구성되어 있습니다. 기도 상피 세포가 외부 환경에 대한 중요한 장벽을 제공하는, 공기 - 액체 경계면 (ALI)에 앉아 여기서 점막이다. 그들은 망상 기저막 (RBM)에 상주, 단단히 소형 ECM 주로 collag 구성EN IV, perlecans 및 라미닌. 서브 점막 층을 직접 점막, 섬유 아세포, 근섬유 비롯한 질병 상태 하에서 백혈구 침윤 여러 종류의 세포로 구성된 다공성 영역보다 아래에서 발견된다. 마지막으로 평활근 번들은 나선형 방식으로기도의 주위에 포장하고,기도 평활근 (ASM)의 정렬 시트로 구성된다. 그것은기도 톤을 제어하는​​ 평활근의 상대적 수축 상태입니다. 폐 시스템 내에서 전기 방사 비계의 고용은 최근까지 재생 목적으로 제한되었다; 전기 방사 기관과 교환이 성공적으로 이식된다. 성공하는 동안, 이러한 치료는 숫자에 제한되어 인해 조직의 기능의 상대적 단순한 자연 기관에 초점을 맞추고있다. 체외 진단에 사용기도 모델 한정적인 예는 존재하고, 주로 평활근 수축 측정에 초점을 맞추고있다. 무독성없고N 분해성 중합체, 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 (PET)는 미리 전기 방사하고 있으며, 적합한 것으로 또한 (이를 &quot;기성품&quot;이용 될 수 있도록) 분해없이 장기간 저장 될 수 생성 발판을 보장하는 본 연구에 사용하고 있었다 오랜 기간 동안 안정적으로 세포 배양합니다. 우리 그룹의 이전의 연구는 기본적인 전기 방사 프로토콜의 세 변이를 이용하는 세 개별 PET의 전기 방사 비계가 배양기도 상피 섬유 아세포에 대한 최적의 지형 및 분리 (21, 22)에서의 평활근 세포 및기도의 공 배양을 제공하도록 제조 될 수 있다는 것을 보여 주었다 상피 세포와 섬유 아세포 (22). 섬유 직경이 크게 상피 기능 (22)에 영향을 미치는 것을 발견하고, 섬유 배향 평활근 (21)의 시트들의 정렬을 생성 하였다. 이러한 연구는 정적 조건에서 각각 독립적으로 수행 하였다. 본 연구에서는 이러한 differe완전히 분화 ​​된 성인 인간 세포를 포함하는 NT 지지체는기도 간 세포 반응을 조사하는 시험 관내 모델에서의 생리 학적 관련성을 제공하고,기도 벽의 3D 부로서 시판 생물 반응기에서 ALI에서 일주일 동안 동시 배양 하였다. 이 프로토콜은 모델 시스템과 같은기도 세기관지를 사용하는 동안, 그것은 다른 기관으로부터 점막 단위의 3 차원 공 배양을위한 플랫폼으로 구성 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET)</td><td>Lucozade (GSK) 병</td><td>N/A</td><td>전기 방사용 PET 공급원. 작은 조각으로 자르고 필요에 따라 무게를 잰</td></tr>다 <tr><td>디클로로메탄(DCM)PET</td> 트리플루오로아세트산(TFA)<td></td><td></td><td>용 용제</td></tr><tr><td>,</td> PET 회전 맨드릴용 <td>시그마</td><td></td><td>용제</td></tr><tr><td></td><td>자체</td><td></td> 제작 <td>전기 방사 섬유를 수집하는 데 사용됩니다. 서로 다른 속도로 회전함으로써 섬유를 정렬하거나 무작위 방향으로 만들 수 있습니다</td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>전기 방사 공정에 사용되는</td><td>하버드 장치</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>CALU3 세포용</td><td>Gibco</td><td></td> 배양 배지</tr><tr><td>HASM 세포용</td><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td></td> 배양 배지</tr><tr><td>MRC5 세포용</td><td>MEM</td><td>Gibco</td><td></td> 배양 배지</tr><tr><td>항생제/항진균제 해결책</td><td>Gibco</td><td></td><td>Media supplement</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td></td><td>Media supplement</td></tr><tr><td>Orbital mixer (Orbital shake 503)</td><td>Stuart Scientific</td><td></td><td>마이크로파이버 스캐폴드에 세포의 동적 시딩을 위한</td></tr><tr><td>연동 펌프&nbsp;</td><td>왓슨 말로우(Watson Marlow</td><td></td>) <td>3D</td></tr><tr><td>세포 배양을 위한</td> <td>3DKube</td><td>Kiyatec</td><td></td> 바이오리액터</tr>를 통한 배지 흐름 제공</tbody></table>

전기 방사를 적응하는 것은 트라이 계층에 대한 세 가지 독특한 환경을 제공하기 위해<em&gt; 체외</em&gt;기도 벽의 모델

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

전기 방사는 체외 세포 배양에 활용할 수 있는 다공성 3D 섬유 골격을 생산하는 적응력이 뛰어난 방법입니다. 공정 내에서 고유한 매개변수를 변경하면 섬유 직경, 정렬 및 다공성을 포함한 골격 특성을 높은 수준으로 제어할 수 있습니다. 장기 또는 조직 특이적 세포외 매트릭스(ECM)와 유사한 치수와 지형을 가진 골격을 개발함으로써 세포가 현장에서 노출되는 것을 대표하는 미시 환경을 만들 수 있습니다. 
세 가지 주요 미시환경으로 구성된 기도 세기관지 벽이 모델 조직으로 선정되었습니다. 탈세포화된 기도 ECM을 가이드로 사용하여 세 가지 다른 프로토콜로 분해되지 않는 폴리머인 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)를 전기 방사하여 상피, 섬유아세포 또는 평활근 세포 배양에 최적화된 세 개의 개별 전기 방사 골격을 생성했습니다. 시판되는 바이오리액터 시스템을 사용하여 세 가지 세포 유형을 안정적으로 공동 배양하여 장기간에 걸쳐 기도 벽의 체외 모델을 제공했습니다.
이 모델은 3D 조직 특이적 환경 내에서 완전히 분화된 성체 세포를 배양할 수 있는 관련 플랫폼을 제공함으로써 중요한 세포 간 누화 메커니즘을 조사하거나 새로운 제약 표적을 평가하는 체외 진단 연구에 이러한 방법이 사용될 수 있는 가능성을 강조합니다.

탈세 포화기도 조직 또는 우리가 전기 방사의 발판 지형에 소개하고 싶다고기도 ECM의 바람직한 특성을 식별기도 조직 검사에서 면역 조직 이미지의 주사 전자 현미경 이미지 : 기본 RBM 행렬은 약 30.6 nm의 ± nm의 153 (N 평균 ± SD = 50 측정 섬유로 구성 )의 직경 (도 3a 및도 5a), RBM 주변 매트릭스 동안 자연 (도 3c)에서 더 많은 다공성이었다. 평활근 번들을 통해 면역 조직 섹션 셀 (21) (그림 3E)의 정렬 시트로 ASM 선물을 보여줍니다. 이 정보는 전기 방사 골격에 도입 특성을 안내하는 데 사용되었다. 회전 맨드릴 안정적으로 고속으로 회전 할 수 있었다 (&gt; 2,000 RPM / 440m · 분 -1) 정렬 섬유와 발판을 생산합니다. 저속 회전 맨드릴 (60 RPM이 13.2 m · 분 -1) 섬유 배향에 영향을 미치지 않았다하지만, 고정 플레이트 상에 전기 방사 할 때보다 더욱 균일 한 두께를 갖는 지지체를 제작. 전기 방사 파라미터 (PET 농도 및 용액 유량)를 변경함으로써, (전기 방사 파라미터를 표 1에 명시되어있다) 수 마이크로 미터 또는 수백 나노 미터의 직경을 갖는 섬유 지지체를 만드는 것이 가능했다. 그러나 이러한 낮은 PET 농도에서 천연 RBM 섬유 (150 ㎚) 6 % PET 용액을 사용하여 제조 된, 상당 섬유 직경 전기 방사 섬유, 섬유의 비딩 (도 4a)에 발생 하였다. 이것은 2.4 nm의 ± 내지 255의 평균 직경을 갖는 균일 한 나노 섬유를 제조 8 %로 PET 용액의 농도를 증가시켜 제거 하였다 (SEM 평균 ±)와 1.43 μm의 ± 0.02 ㎛의 (도 4B,도 5A 및 B)의 평균 기공 크기. 나노 섬유 electrospin로 느린 유속을 허용, 23 G 18 G에서 바늘의 크기를 감소시킬 필요가 있었다 whils높은 유속을 유지하고 바늘 막힘, 큰 바늘 반복 문제를 감소 t. 때문에 높은 용액 점도로 마이크로 니들 팁에서 여러 방해 외에 섬유 직경 (도 4F)에서 균일 부족&gt; 30 % PET 리드선 PET 용액을 전기 방사 할 때 증가. μm의 ± 0.02 ㎛의 2.50의 평균 섬유 직경을 갖는 균일 한 마이크로 섬유 매트를 2 ㎖ / h의 유속으로 30 % 중량 / 부피 PET 용액을 전기 방사 할 때 생성하고, 10.45 ㎛의 ± 0.13 ㎛, 평균 기공 크기 (± SEM을 의미) -1 (그림 4 층, 5A &amp; B). 마이크로 화이버 지지체 (여전히 맨드릴에 부착)에 직접 나노 섬유 지지체의 연속 전기 방사는 이상성 발판 (그림 3D)를 만들었습니다. 평균 섬유 직경은 각각 나노 섬유와 마이크로 섬유 단계 20 nm 내지 2.30 μm의 ± 0.06 ㎛, ± 280 nm의이었다개별 나노 및 마이크로 비계의 크기 비교. 또한 이상성 지지체의 두께는 개별 나노 섬유와 마이크로 섬유 지지체 (도 5C)의 합과 유사 하였다. 맨드릴을 통해 속도를 증가 (2,000 RPM / 440m · 분 -1), 고도로 정렬 된 나노 또는 마이크로 섬유 지지체를 제조 하였다. 8 % 중량 / 부피의 PET 솔루션은 물결 모양의 형태 (그림 3 층)를 가진 정렬 된 나노 섬유 및 생산 섬유를 제조하기위한 최적의 아니었다. 10 % 애완 동물에 대한 증가는이 효과를 무효,하지만 여전히 감소 섬유 직경에 무작위로 정렬 된 나노 섬유 지지체에 비해 (2.2 nm의 (SEM ± 평균) ± 내지 216) 결과. 섬유 배향은 평균 섬유 각도에서 각각의 섬유의 각도의 어긋남을 측정함으로써 계산되었다. 정렬 된 나노 섬유의 골격에서 79 % 무작위 정렬 나노 scaff에서 섬유의 10.2 %에 비해 (± 10 °, 평균 섬유 각도)으로 정렬했다어린이 (그림 5D). 8 % 나노 섬유 지지체는 상피 세포가 상주하는 RBM 요점을 되풀이하는 데 사용하고, CALU3 세포의 배양 (기도 상피 세포 라인)을 지원하기 위해 사용되었다. 자연에서 더욱 다공성 인 30 % 중량 / 부피 마이크로 섬유 지지체는, 서브 점막 영역을 모방하는 데 및 MRC5 세포 (기도 섬유 아세포 세포주)와 함께 배양 하였다. 위상 참조 제공하는 10 % 중량 / 부피의 정렬 된 나노 섬유 지지체는 ASM 셀 정렬을 보장하기 위해 때 지지체에 배양 하였다. 2 주 기간 (도 6A) 위에 개별 지지체에 배양하고,이 이주 배양 기간 (도 6B, 6C, 6D) 후 세포 형 특정 단백질을 발현 할 때 세 세포 유형 생존의 증가를 보였다. 개별 세포 골격 상호 작용의 또 다른 특성은, 다른 곳 (21)이보고되었다. 나노 섬유 지지체의 연속 전기 방사마이크로 섬유 지지체는 각각 나노 섬유와 마이크로 섬유 상 상 CALU3 상피 세포와 섬유 모세포 MRC5 세포의 공 배양 용 지지체를 제조 이상성 상. 함께 정적 조건 하에서 두 세포 배양은 22 곳에보고되었다. 정적 조건 하에서 이주 넘어 이상성 배양 시간을 다른 세포 층을 추가하거나 확장하는 시도 또한 워크 (데이타 미기재) 실패 입증했다. 배양 장기간에 걸쳐 3 중층 모델, 우리는 관류 생물 반응기를 이용했다. CALU3 및 MRC5 세포 이상성 지지체 상에 시딩하고, ASM 세포 시딩 정렬 지지체 상에, 모두 2 일간 배양 하였다 별도로 하였다. 두 발판은 생물 반응기 내의기도 벽의 삼중 레이어 모델을 (도 7)을 형성하도록 함께 구입 하였다. 두 챔버는 혀끝 상피 챔버가 미디어를 제거했다 전에 7 일간 미디어를 관류하고, 상피 세포에서 배양 하였다또 7 일간 알리. 비계는 고정하거나 절단 및 염색, 또는 전체 골격은 세포 특이 마커에 대한 면역 염색했다되었다. 트라이 층 문화를 통해 섹션은 공 배양 (그림 8B)의 세 가지 레이어를 통해 배포 세포 핵을 보였다. 세포가 세포 특이 마커에 대한 면역 염색했을 때, 상피 세포가 합류 세포 층으로 혀끝의 나노 섬유의 위상을 채워과 cytokeratin에 양성 염색 (그림 8C), 마이크로 화이버 상에, 섬유 아세포는 S100A4 (그림 8D)에 대한 긍정적 인 염색과에 기도 벽의 3D 모델 내의 각각의 세포 유형의 우수한 생존율을 나타내는 SM22α (도 8E) 양성 염색 정렬 10 % 골격 ASM 세포. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig1.jpg" /> 그림 1.기도 세기관지. 중증의 기관지 생검간엽 세포로 채워 기본 점막하 영역과 망상 기저막 (RBM)의 상피를 도시 천식성기도, 평활근의 α- 액틴 (브라운) 스테인드 평활근 세포로 채워 주변 평활근 번들. 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig2.jpg" /> 도 2 전기 방사 장치의 개략도. (첨부 바늘) 중합체 / 용매 용액을 함유하는 주사기 맨드릴 대향 주사기 펌프 상에 배치된다. 전위 니들 맨드릴 일으키는 섬유 바늘 끝로부터 토출하고, 회전 맨드릴 상에 증착되는 사이에 확립된다. 섬유는 대기를 통과 할 때,맨드릴에 고분자 섬유의 침착을 일으키는 원인이되는 용매 증발한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig3.jpg" /> 기본기도 ECM에 전기 방사 비계의 그림 3. 비교. 탈세 포화 된 기저막 (A) 단면 (C) 및기도 평활근 번들의 조직 학적 섹션 세기관지 탈세 포화 된기도의 주사 전자 현미경 이미지 (헤 마톡 실린 및 에오신, 규모로 염색 바 40 μm의) 나노 섬유 (B에 비해 (E)) 이상성 (D) 및 정렬 (F) 애완 동물 골격. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig3large.jpg" target="_blank">보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 더 큰 버전. 표 1 매개 변수 극세사, 전기 방사 나노 섬유를 사용하고 개별적 이상성 발판위한 발판을 정렬. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig4.jpg" /> PET 농도도 4 변질 섬유 특성. 6 %, 8 %, 10 % (AC), 25 %, 30 % 및 35 % (EG) (중량 / 부피) PET 용액으로부터 방사 된 전기 방사 비계의 주사 전자 현미경 이미지에 영향을 미치는 . 또한 정렬 발판이 8 % (D) 30 %에서 생산되는 (H) 중량 / 부피 애완 동물 솔루션을 표시. 광고는 1000 배의 배율로 이미지화 EH, 5000 배의 배율로 몇 군데. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig4large.jpg" target="_blank">더 크게 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 버전입니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig5.jpg" /> 전기 방사 애완 동물 골격의 그림 5. 속성. 망상 기저막 세포 외 기질 (RBM ECM), 무작위로 정렬 된 나노 및 마이크로 섬유 지지체 및 정렬 된 나노 섬유 지지체의 섬유 직경 분포를 나타내는 () 분포 곡선. (B)의 히스토그램은 나노와 마이크로 섬유 지지체의 상대적인 기공 크기 분포를 도시. (C) 나노, 마이크로, 이상성 정렬 비계의 평균 두께 (평균 ± 표준 편차 N = 6). (D) 비계 섬유 ImageJ에 분석 소프트웨어를 사용하여 수행 하였다 랜덤 또는 정렬 ​​된 나노 섬유 지지체의 평균 섬유 배향으로부터의 편차를 나타내는 히스토그램 플롯. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig5large.jpg" target="_blank">P</a>임대이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig6.jpg" /> 도 6 개인 비계에 개별 종류의 세포 배양. (A) 정렬 비계에 ASM 전지용 알라 마르 블루 세포 생존력 분석 결과, CALU3 나노 섬유 지지체에 세포 및 극세사 비계에 MRC5 세포 (SEM 평균 ± N = 3 20). 나노 섬유, 마이크로 섬유의 주사 전자 현미경 사진과 정렬 섬유 지지체 (B, C 및 D 각각)과 SM22α 스테인드 vinculin (적색) 및 ASM 세포 스테인드 E-cadherin의 (적색)에 대해 염색 CALU3 세포 MRC5 세포의 면역 형광 이미지 (각각 E, F 및 G) 모든 전문 발판에 (빨간색). 훽스트는 핵 (파란색)를 착색하는 데 사용되었다 눈금 막대가 표시 40# 181;. M <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig7.jpg" /> 트라이 층기도 벽 모델에 대한 그림 7. 관류 시스템. 연동 펌프와 2 배의 미디어 저장소에 연결된 생물 반응기 용기 (A) 사진. 3 중층 비계의 (B) 도식. (C) 도식은기도의 모델은 공기 - 액체 계면에서 개최되는 두 생물 반응기 회로로. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig8.jpg" /> 그림 8. 완료 3D기도 벽 모델입니다. (A) 빨간색으로 강조 점막층과기도 벽의 기관지 생검, 점막하 지역은 녹색으로 강조하고, 평활근 번들 금 강조했다. 상피 세포, 섬유 아세포, 2 주 공 배양 한 후 고정 평활근 세포로 채워 이상성 정렬 발판으로 구성된 3 중층기도 벽을 통해 (B) 섹션을 참조하십시오. 세포 핵는 동시에 몇 군데 발판 반사율 (회색)와 DAPI (파란색)으로 염색 하였다. 비계 또한 cytokeratin (녹색)에 대한 염색 CALU3 셀 (C), S100A4 (녹색) (D), 및 SM22α (적색)에 대해 염색 평활근 세포 염색 MRC5 세포 (함께 고정 2 주 후에 세포 특이 마커 면역 염색 하였다 E). 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 표 1.

생체 재료 기술의 발전으로 3차원 다세포 유형의 구조를 개발할 수 있게 되었습니다. 우리는 기도의 주요 구조 세포를 배양하기 위해 3개의 개별 골격을 생산하여 기도 세기관지 벽의 3D 체외 모델을 제공하는 전기 방사 프로토콜을 개발했습니다.

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

이 절차의 전반적인 목표는 3차원 상성(phasic) 지지체를 전기 방사하여, 완전히 분화된 성인 인간 세포를 공동 배양함으로써 이 세포들이 C two에서 접하는 천연 세포외 기질을 재현하는 것입니다. 이는 먼저 무작위로 배열된 마이크로섬유 지지체를 전기 방사함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 마이크로섬유 지지체 위에 무작위로 배열된 나노섬유 층을 직접 전기 방사하여 이상성(biphasic) 지지체를 형성하는 것입니다.다음으로, 별도의 정렬된 나노섬유 스캐폴드를 전기방사합니다. 마지막 단계는 각 스캐폴드에 각각의 세포 유형을 파종하고, 단일 구조체로서 관류 바이오리액터 시스템 내에서 스캐폴드들을 공배양하는 것입니다. 최종적으로 매개체 방출 측정 및 면역 염색을 통해 다세포 상호작용을 분석할 수 있습니다.구성체. 이 기술이 2D 형질전환 막과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은, 전기 방사 스캐폴드가 생리학적으로 유의미한 형태를 제공하도록 조절 가능한 3D 섬유질 환경을 제공한다는 것입니다. 이는 더 다공성인 구조이며 여러 세포 유형의 공동 배양을 가능하게 합니다.이 방법은 코호트, 질환 또는 건강한 상태의 인간 세포를 인비트로(in vitro) 모델로 사용하여 안정적인 플랫폼을 제공합니다. 이를 통해 인간 질병과의 관련성 측면에서 한계가 있는 동물 모델에 대한 의존도를 낮추고, 실험에 사용되는 동물의 수를 줄이는 데 도움이 될 것입니다. 이 방법은 천식 및 COPD와 같은 질병에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 장의 염증성 질환 연구나 화학 물질 테스트를 위한 피부 모델 개발과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.먼저, 클로로메탄과 트리클로로아세트산의 1:1 혼합액에 PET를 각각 8%, 10%, 30% 농도로 용해하여 세 가지 서로 다른 10 mL PET 용액을 준비합니다. PET를 완전히 용해시키기 위해 용액을 실온에서 하룻밤 동안 교반한 후 다음 날 사용합니다. 준비된 PET 용액을 주사기에 옮겨 담고, 8% 혼합액이 담긴 주사기에는 23 gauge 바늘을, 10% 및 30% PET 용액이 담긴 나머지 두 주사기에는 18 gauge 바늘을 장착합니다.마이크로섬유 스캐폴드를 준비합니다. 먼저, 30%PET 용액이 들어 있는 주사기를 바늘 끝이 아래를 향하도록 주사기 펌프에 장착합니다. 드럼에서 15 centimeters 떨어진 곳에 매니폴드를 배치하고, 바늘이 드럼의 중심을 향하고 있는지 확인합니다.금속제 악어 클립을 사용하여 양극 전원 공급선을 바늘 팁에 연결하고, 접지선을 바나나 소켓에 연결하여 manl을 접지합니다. 모터를 켜고 manl 속도를 60 RPMs로 설정합니다. 시린지 펌프를 켜서 2.0 milliliters per hour의 유속이 제공되도록 합니다.마이크로섬유 지지체를 제작하는 동안, 바늘 내의 공기를 제거하여 시스템을 프라이밍하기 위해 용액이 바늘 끝에서 압출될 때까지 펌프를 작동시킵니다. 그 다음 시린지 펌프의 펌프 작동을 중단합니다.배출될 용액의 총 부피를 2 mL로 설정하고 펌프를 작동시킵니다. 다음으로, 바늘과 맨드릴 사이에 14 kV의 전압을 인가하여 30% PET 용액 2 mL가 전기방사될 때까지 1시간 동안 전기방사를 수행합니다. 마이크로파이버 스캐폴드가 맨드릴에 부착된 상태에서 전압을 끕니다. 악어 클립을 제거하고 30% PET 용액이 들어 있는 시린지를 8% PET 용액이 들어 있는 시린지로 교체합니다.그 다음 악어 클립을 23 gauge 바늘에 다시 연결합니다. 시린지 펌프의 유속을 0.5 milliliters per hour로 변경하고, 용액이 팁에서 흘러나올 때까지 시린지 펌프를 작동시켜 바늘을 프라이밍합니다. 맨드릴이 60 RPMs로 계속 회전하는 상태에서, 바늘 팁과 맨드릴 사이에 14 kilovolt 전위를 인가하고, 시린지 펌프에 의해 압출될 총 부피를 2 milliliters로 설정합니다.8% PET 용액 2 mL가 전기 방사될 때까지 4시간 동안 전기 방사를 수행합니다. 전기 방사가 완료되면 전원 공급 장치와 맨드릴을 회전시키는 모터를 끕니다. 맨드릴의 표면적 크기의 2D 시트 형태 스캐폴드를 제작하기 위해, 칼을 사용하여 맨드릴의 너비 방향을 따라 이상성 스캐폴드를 절단합니다.정렬된 PET 스캐폴드를 준비하려면, 10% PET 용액이 담긴 시린지를 바늘 끝이 아래를 향하도록 시린지 펌프에 장착하십시오. 그런 다음 바늘에 악어 클립을 연결하십시오. 유량을 시간당 0.5밀리리터로 설정하고 바늘 내부에 PET 용액을 채워 프라이밍하십시오.그런 다음 모터를 켜고 맨드릴 회전 속도를 2000 RPMs로 설정합니다. 이어서 시린지 펌프를 켭니다. 전압 공급 장치를 14 kilovolts로 설정하고 전원을 켜서 2 milliliters의 용액이 전기 방사될 때까지 4시간 동안 전기 방사를 진행합니다.전기 방사가 완료되면 전원 공급 장치와 모터를 끕니다. 맨드릴의 너비를 따라 블레이드로 스캐폴드를 절단하여 정렬된 2D 시트 형태의 스캐폴드를 제작합니다. 정전기 전하를 줄이기 위해 전기 방사된 스캐폴드를 알루미늄 호일에 싸서 보관합니다.0.8 밀리미터 직경의 생검 펀치(biopsy pen)를 사용하여 SPU 시트에서 이상성(biphasic) 또는 정렬된 스캐폴드 디스크를 펀칭하여 추출합니다. 그다음, 독성이 없는 수족관용 접착제를 사용하여 이상성 스캐폴드 디스크를 가스켓에 접착합니다. 가스켓과 스캐폴드를 12웰 조직 배양 플레이트에 넣습니다.가스켓과 스캐폴드를 자외선 I 조사기로 스캐폴드의 각 면당 30분씩 멸균합니다. 그 다음, 20% 항생제-항진균제 용액에 담가 4°C에서 하룻밤 동안 침지시킨 후 다음 날 꺼냅니다. 스캐폴드를 PBS로 3회 세척하고, 사용 전까지 4°C의 PBS에 보관합니다.이상성 스캐폴드를 PBS에서 새로운 12 Well 플레이트로 옮기고, 10% FCS가 첨가된 DMEM 배지에서 37°C로 1시간 동안 온도를 높입니다. DMEM 첨가 배지를 제거하고, 스캐폴드의 마이크로파이버 상이 위를 향하게 놓은 뒤, 섬유아세포의 스캐폴드 내부 침투를 돕기 위해 30 µL의 DMEM 첨가 배지에 15,000개의 MRC-5 섬유아세포 세포를 현탁하여 각 스캐폴드 위에 접종합니다. 플레이트를 오비탈 셰이커에 올리고 100 RPM으로 2시간 동안 스캐폴드를 진동시킵니다.그 다음, 각 스캐폴드에 DMEM 보충 배지 2 mL를 첨가하고 37°C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 웰에서 배지를 제거하고 스캐폴드의 나노섬유 상이 위쪽을 향하도록 뒤집습니다. 그런 다음 10% FCS가 보충된 DMEM/F12 배지 30 µL에 현탁된 30,000개의 Cal-3 상피 세포를 스캐폴드의 나노섬유 상에 파종합니다.스캐폴드를 37 °C, 5% carbon dioxide 환경에서 2시간 동안 배양한 후, D-M-E-M-F 12와 DMEM 보충 배지의 70:30 혼합액에 스캐폴드를 담그고 12시간 동안 정적 배양을 지속하여 기도 평활근 세포를 배양합니다. 먼저, 정렬된 스캐폴드를 PBS에서 새 12-well 플레이트로 옮긴 후, 이를 DMEM 보충 배지와 함께 37 °C에서 1시간 동안 가온합니다. DMEM 보충 배지를 제거하고, 30 µL의 DMEM 보충 배지에 부유된 25,000개의 기도 평활근 세포를 각 스캐폴드에 첨가한 뒤 37 °C, 5% carbon dioxide 환경에서 2시간 동안 배양합니다.부착이 완료되면, 보충제가 첨가된 DMEM 배지에 스캐폴드를 담급니다. 이를 인큐베이터로 옮겨 하룻밤 동안 배양한 후, 바이오리액터에서 삼중 배양을 설정합니다. 다음 날, 상피 세포 층이 챔버 위쪽을 향하도록 하여 이상성 시드 스캐폴드를 바이오리액터 챔버에 넣습니다.그 다음, 정렬된 스캐폴드를 이상성 스캐폴드의 아래쪽에 배치하여 이상성 스캐폴드의 마이크로파이버 상과 인접하게 합니다. 바이오리액터의 두 챔버를 함께 잠급니다. 그 후, 동반된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 인큐베이터 내에 두 개의 관류 흐름 회로를 조립하고, 일주일 후에 연동 펌프를 사용하여 약 0.1 milliliters per minute의 속도로 두 회로에 배지를 펌핑합니다.상단 챔버와 배양액에서 배지를 제거합니다. 바이오리액터에서 2주간 배양한 후, 분석 전 추가로 1주일 동안 공기-액체 계면에서 상피 세포를 배양합니다. 여기에 제시된 삼중 배양 스캐폴드를 고정 및 절편화하여 구조체의 세 층 전체에 분포된 세포 핵을 확인하였습니다. 세포 핵은 DPI로 염색되어 파란색으로 나타나며, 스캐폴드 재료는 회색으로 나타납니다. 여기에는 상피 세포, 섬유아세포, 평활근 세포를 각각 파종하기 위해 제작된 전기방사 나노섬유, 마이크로섬유 및 정렬된 스캐폴드의 주사 전자 현미경 이미지입니다.세 가지 세포 유형 모두 2주 동안 각각의 스캐폴드에서 배양했을 때 생존율이 증가하는 것을 보였습니다. 또한, 각 세포는 2주의 배양 기간 이후에도 세포 유형 특이적 단백질을 계속해서 발현했습니다. 이 절차를 수행할 때는 전기방사 섬유로 재현하고자 하는 천연 세포외 기질에 대해 조사하는 것이 중요합니다.세포는 서로 다른 3D 지형에 부착될 때 각기 다르게 행동합니다. 예를 들어, 상피세포는 나노 섬유 위에서 배양될 때만 기능적 장벽을 형성합니다. 이 영상을 시청한 후에는 동적 배양 환경 내에서 세포 간 상호작용 연구에 사용할 수 있는 다층 공배양 시스템을 구축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.본 절차를 수행하는 동안 사용하려는 폴리머 및 용매 시스템에 맞게 유량 및 전압과 같은 전기 방사 파라미터를 조정하는 것이 중요하다는 점을 잊지 마십시오. 이는 원하는 섬유를 생성하는 데 결정적인 역할을 합니다. 또한, 용매가 적절히 배출될 수 있도록 환기 시설이 갖춰진 후드나 보관함 내에서 전기 방사를 진행하십시오.

adapting-electrospinning-process-to-provide-three-unique-environments

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

조직 공학 및 세포 배양을위한 폴리머를 electrospinning의 과정은이 문서에서 해결되었습니다. 특히 photopatterning 멀티 고분자 electrospinning의 추가 처리 능력과 photoreactive macromers의 electrospinning이 설명되어 있습니다.

조직 공학 및 세포 배양을위한 섬유 고분자의 공사장 공중 발판을 Electrospinning

본 연구의 목적은 동맥 벽 원래 세 계층 아키텍처를 모방하는 것이었다. 이것을 달성하기 위해, electrospinning은 3-1 (입출력) 노즐의 사용과 고용 및 polycaprolactone, 엘라스틴, 콜라겐의 결합되었다.

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이 프로토콜은 폴리머와 전기를 통해 건설 기계를 조작 하는 포괄적인 지침 직접 쓰기 모드에 녹아 있습니다. 우리는 체계적으로 과정을 약술 하 고 타겟된 비 계 구조를 달성 하기 위한 적절 한 매개 변수 설정 정의.

조직 공학 응용 프로그램에 대 한 제어 형태학과 3 차원 Poly(ε-caprolactone) 장비의 전기 글 녹아

이 문서에서는 물리와 화학의 높은 처리량 조작 신호 세포 microenvironments vivo에서 흉내 낸 고을 다중화 인공 세포 MicroEnvironment (MACME) 배열 준비 하 상세한 방법론 단일 셀 프로 파일링 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)를 위한 최적의 휴대폰 환경을 식별 합니다.

멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작

이 문서에서는 덜한 CO2 의 depressurization 통해 3 차원 (3D) 비 계에 전통, 2 차원 (2D) electrospun nanofiber 매트를 확장 하는 기술을 보여 줍니다. 이러한 증강된 건설 기계는 3D, 밀접 하 게 모방 세포 nanotopographic 신호, 고는 nanofibers 캡슐화 하는 생물 학적 분자의 기능을 보존 한다.

건설 기계 3-차원으로 2 차원 Electrospun Nanofiber 매트의 확장

이 프로토콜은 래트 기관지로부터 내인성 상피의 선택적 제거 및 루멘 표면 상의 외인성 세포의 균질한 분포를 허용하는 이미징-활성화된 생물반응기를 기술하고, 이어서 세포-조직 구축물의 장기 시험관내 배양을 허용한다.

생체 공학 기도 조직 생성을 위한 영상 유도 생물반응기

제시된 방법은 3차원(3D) 스캐폴드(예: 심장 판막 전단지)에서 생체 모방 섬유 구조를 엔지니어링하는 혁신적인 방법을 제공합니다. 3D 인쇄된 전도성 형상은 모양과 치수를 결정하는 데 사용되었습니다. 섬유 배향 및 특성은 각 층에 대해 개별적으로 조정가능하였다. 하나의 설정으로 여러 샘플을 제조 할 수 있습니다.

3D 프린팅과 전기방사를 결합하여 생체모방 심장 판막 전단지 제조

여기에서는 나노섬유막 기반 2층 시스템에서 섬유아세포로 배양된 상피 세포가 어떻게 막에 안정적으로 부착하고 성장할 수 있는지 보여줍니다.

나노섬유막(Nanofibrous membranes)을 이용한 상피세포의 3차원 공동배양 모듈 구축

배우세요 전기방사 기술을 이용한 3D 기도 벽 모델 제작 방법을. 미세섬유와 나노섬유 스캐폴드를 사용하여 성인 인간 세포의 공동 배양을 가능하게 하고, 천식 및 COPD 같은 호흡기 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

전기 방사를 적응하는 것은 트라이 계층에 대한 세 가지 독특한 환경을 제공하기 위해

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