전기 방사를 적응하는 것은 트라이 계층에 대한 세 가지 독특한 환경을 제공하기 위해 체외기도 벽의 모델

이 절차의 전반적인 목표는 3차원 위상 골격을 전기 스핀하여 완전히 분화된 성인 인간 세포의 공동 배양을 가능하게 하여 이러한 세포가 C 2에서 만나는 자연 세포 외 기질을 복제할 수 있도록 하는 것입니다. 이것은 무작위로 정렬된 극세사 스캐폴드인 첫 번째 전기 방사에 의해 수행됩니다. 두 번째 단계는 무작위로 정렬된 나노섬유 층을 극세사 스캐폴드에 직접 전기 방사하여 이위상 스캐폴드를 형성하는 것입니다.

다음으로, 별도의 정렬된 나노섬유 스캐폴드를 전기로 방사합니다. 마지막 단계는 각 골격을 각각의 세포 유형에 시딩하고 풍성한 생물 반응기 시스템에서 골격을 단일 구조체로 공동 배양하는 것입니다. 궁극적으로 다세포 상호 작용은 매개체 방출 및 면역 염색 측정을 통해 분석할 수 있습니다.

구문. 2D 변형 멤브레인과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 전기 스캐폴드가 생리학적으로 관련된 형태를 제공하도록 조정할 수 있는 3D 섬유 환경을 제공한다는 것입니다. 이는 더 다공성 구조이며 여러 세포 유형의 핵심 배양을 허용합니다.

이 방법은 코호트, 질병 또는 건강한 인간 세포를 in vitro 모델로 사용하여 안정적인 플랫폼을 제공합니다. 이는 인간 질병과의 관련성이 제한적인 동물 모델에 대한 의존도를 줄이고 실험에 사용되는 동물의 수를 줄이는 데 도움이 될 것입니다. 이 방법은 천식 및 COPD와 같은 질병에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 장의 염증성 질환 연구 또는 화학 테스트를 위한 피부 모델 개발과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

시작하려면 8%10% 및 30%PET를 클로로 메탄과 트리클로로아세트산의 일대일 혼합물로 용해하여 3가지 다른 10mL PET를 준비합니다. 용액을 실온에서 밤새 저어 다음날 PET를 녹입니다. PET 용액을 주사기에 옮기고 8% 혼합물이 들어 있는 주사기에 23 게이지 바늘을 연결하고 10% 및 30% PET 용액이 들어 있는 다른 두 개의 주사기에 18 게이지 바늘을 부착합니다.

극세사 골격을 준비합니다. 먼저 30% PET 용액이 들어있는 주사기를 바늘 끝이 바닥에 오도록 주사기 펌프에 넣습니다. 바늘 끝에서 15cm 떨어진 곳에 맨을 놓고 바늘이 드럼 중앙을 가리키도록 합니다.

금속 악어 클립을 사용하여 양극 전기 공급 라인을 바늘 끝에 연결하고 접지선을 바나나 소켓에 연결하여 맨을 접지합니다. 모터를 켜고 맨 속도를 60RPM으로 설정합니다. 주사기 펌프를 켜서 시간당 2.0밀리리터의 유속을 제공합니다.

극세사 골격을 만드는 동안. 바늘의 공기를 제거하여 시스템을 프라이밍하기 위해 바늘 끝에서 용액이 압출될 때까지 펌프를 작동시키십시오. 그런 다음 주사기 펌프의 펌프를 멈춥니다.

배출할 용액의 총 부피를 2밀리리터로 설정하고 펌프를 시작합니다. 다음으로, 바늘과 맨드릴 전기 스핀 사이에 14kW의 전위를 1시간 동안 가하고, 30% PET 용액 2밀리리터가 맨드릴에 있는 극세사 스캐폴드로 전기 회전할 때까지 전압 전위를 끕니다. 악어 클립을 제거하고 30% PET 용액이 들어 있는 주사기를 8% PET 용액이 들어 있는 주사기로 교체합니다.

그런 다음 악어 클립을 23게이지 바늘에 다시 연결합니다. 주사기 펌프의 유속을 시간당 0.5밀리리터로 변경하고 용액이 팁에서 흐를 때까지 주사기 펌프를 실행하여 바늘을 프라이밍합니다. 맨드릴이 60RPM으로 계속 회전하면서 바늘 끝과 맨드릴 사이에 14킬로볼트 전위를 적용하고 주사기 펌프가 압출할 총 부피를 2밀리리터로 설정합니다.

8% PET 용액 2밀리리터가 전기 방사될 때까지 4시간 동안 전기 회전합니다. 전기 회전이 완료되면 전원 공급 장치와 맨드릴을 회전시키는 모터를 끕니다. 맨드릴 너비를 따라 블레이드로 biphasic 스캐폴드를 절단하여 맨드릴 표면적 크기의 2D 스캐폴드 시트를 생성합니다.

정렬된 PET 스캐폴드를 준비하려면 10% PET 용액이 포함된 주사기를 바늘 끝이 바닥에 오도록 하여 주사기 펌프에 넣습니다. 그런 다음 악어 클립을 바늘에 연결합니다. 유속을 시간당 0.5밀리리터로 설정하고 PET 용액으로 바늘을 프라이밍합니다.

그런 다음 모터를 켜고 맨드릴 회전 속도를 2000RPM으로 설정합니다. 다음으로 주사기 펌프를 켭니다. 전압 공급을 14킬로볼트로 설정하고 2밀리리터의 용액이 전기 회전될 때까지 4시간 동안 전원 공급 장치 전기 스핀을 켭니다.

전기 방사가 완료되면 전원 공급 장치와 모터를 끕니다. 맨드릴의 너비를 따라 블레이드로 스캐폴드를 잘라 정렬된 2D 스캐폴드 시트를 만듭니다. 정전기 전하를 줄이기 위해 전기 방적 골격을 알루미늄 호일에 보관하십시오.

0.8mm 직경의 생검 펜을 사용하여 SPU 시트에서 이위상 또는 정렬된 골격 디스크를 펀칭합니다. 그런 다음 무독성 수족관 접착제를 사용하여 biphasic 비계 디스크를 개스킷에 붙입니다. 개스킷과 스캐폴드를 12웰 조직 배양 플레이트에 놓습니다.

골격의 각 측면에서 30분 동안 자외선 I 방사선을 사용하여 개스킷과 골격을 살균합니다. 그런 다음 다음날 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 20%의 항생제 항진균 용액에 담그십시오. PP S3로 스캐폴드를 세척하고 사용할 때까지 섭씨 4도의 PBS에 스캐폴드를 보관합니다.

PBS의 biphasic 스캐폴드를 새로운 12 Well 플레이트로 옮기고 10% FCS가 보충된 DMEM 매체에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 가열합니다. DMEM 보충 매체를 제거하고 섬유아세포가 골격으로 침투할 수 있도록 돕기 위해 DMEM 보충 배지 30마이크로리터에 있는 골격의 극세사 상 15, 000 MRC 5개의 섬유아세포 씨를 각 골격에 놓습니다. 플레이트를 오비탈 셰이커에 놓고 100RPM으로 2시간 동안 스캐폴드를 교반합니다.

그런 다음 각 스캐폴드에 2밀리리터의 DMEM 보충 매체를 추가하고 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 밤새 스캐폴드를 배양합니다. 다음 날, 우물에서 매체를 제거하고 골격의 나노 섬유 상이 정점을 향하도록 골격을 뒤집습니다. 다음 30, 000 Cali 3개의 상피 세포를 30 마이크로리터의 D-M-E-M-F 12 매체에 씨를 뿌린 10%FCS는 비계의 nanofiber 단계에 보충했다.

섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 2시간 동안 골격을 배양한 후 D-M-E-M-F 12 및 DMEM 보충 배지의 70:30 혼합물에 골격을 담그고 추가로 12시간 동안 정적 배양을 계속하여 기도를 배양합니다. 평활근 세포먼저 PBS에서 정렬된 골격을 새로운 12웰 플레이트로 옮기고 섭씨 37도에서 1시간 동안 DMEM과 보충 매체를 가열합니다. DMEM에 의하여 보충된 매체를 제거하고 25의 기도 평활근 세포를 각 비계에 DMEM에 의하여 보충된 매체의 30 마이크로리터에 있는 추가하고 37 섭씨 온도와 5%carbon 이산화탄소에 2 시간 동안 그(것)들을 배양하십시오.

일단 부착되면 DMEM 보충 매체에 골격을 담그십시오. 인큐베이터로 다시 넣고 생물 반응기에서 트라이 배양을 설정하기 전에 밤새 그대로 두십시오. 다음 날, biphasic seed 골격을 상피상이 챔버 안을 향하도록 하여 bioreactor 챔버에 놓습니다.

그런 다음 정렬된 골격을 biphasic 골격 아래에 배치하여 biphasic 골격의 극세사 상에 인접하도록 합니다. 생물 반응기의 두 챔버를 함께 잠급니다. 그런 다음 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 인큐베이터 내에서 두 개의 관류 흐름 회로를 조립하고 일주일 후에 연동 펌프를 사용하여 분당 약 0.1밀리리터의 속도로 두 회로 주위의 매체를 펌핑합니다.

정점 챔버와 배양에서 배지를 제거합니다. 생물반응기에서 2주 후 분석하기 전에 추가로 일주일 동안 공기 액체 계면에서 상피 세포, 여기에 표시된 트라이 배양 골격을 고정하고 절단하여 구성 세포핵의 3개 층 모두에 분포된 세포핵이 DPI로 염색되고 골격 물질이 회색으로 나타나는 곳에서 파란색으로 나타납니다. 다음은 상피 세포, 섬유아세포 및 평활근 세포를 각각 파종하기 위해 준비된 전기 방적 나노섬유 극세사와 정렬된 골격의 주사 전자 현미경 이미지입니다.

세 가지 세포 유형 모두 2주 동안 개별 골격에서 배양했을 때 생존율이 증가한 것으로 나타났습니다. 그들은 또한 각각 2주간의 배양 기간 후에도 세포 유형 특이적 단백질을 계속 발현했습니다. 이 절차를 시도하는 동안 전기 섬유로 재현하려는 원시 세포 외 기질을 연구해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

셀은 다른 3D 지형에 부착할 때 다르게 동작합니다. 예를 들어, 상피 세포는 나노 섬유에서 배양될 때만 기능적 장벽을 형성합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 동적 배양 환경 내에서 세포 간 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있는 다층 공동 배양 시스템을 구축하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 수행하는 동안 사용하려는 폴리머 및 용매 시스템에 맞게 유량 및 전압과 같은 전기 방사 매개변수를 조정하는 것이 중요하다는 것을 잊지 마십시오. 이것은 원하는 섬유를 생성하는 데 중요합니다. 또한 용제가 적절하게 추출될 수 있도록 통풍이 잘 되는 후드나 찬장을 회전시키는 것을 잊지 마십시오.