Name: 멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 배우세요 MACME 어레이를 이용한 다중 인공 세포 미세환경 제작 방법으로 인간 다능성 줄기세포의 고처리량 단일세포 프로파일링을 수행합니다. 이 기술은 줄기세포 공학 연구에 최적의 조건을 식별하는 데 활용됩니다.

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우리는 인간의 ES 세포를 제공 하기 위한 iCeMS, 교토 대학에서 교수 N. 辻를 감사 합니다. 우리는 또한 감사 교수 A. 마루야마 도쿄 기술 연구소에서 원자 힘 현미경의 사용에 그의 지원에 대 한. 자금 아낌없이 제공 했다 일본 사회 과학의 프로 모션에 대 한 (JSP; 22350104, 23681028, 25886006, 및 24656502); 자금 또한 새로운 에너지와 산업 기술 종합 개발 기구 (NEDO)와 Terumo 생명 과학 재단에 의해 제공 했다. WPI iCeMS는 세계 최고의 국제 연구 센터 이니셔티브 (WPI), 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 (MEXT), 일본에 의해 지원 됩니다. 이 작품의 일부는 교토 대학 나노기술 허브와 AIST 나노 처리 시설 "나노기술 플랫폼 프로젝트" 일본 문 부 과학성의 후원에 의해 지원 되었다.

1입니다. MACME 배열의 제작
참고: 모든 재료와 장비 자료 테이블에 나열 됩니다.
<ol><li>
마스크의 nanofiber 배열 및 미세 구조에 대 한 금형에 대 한 준비
	<ol>
<li>Nanofiber 배열 및 3D 컴퓨터 그래픽 소프트웨어 패키지 (표 1)를 사용 하 여 미세 구조에 대 한 금형에 사용 되는 마스크의 3 차원 (3D) 이미지를 만듭니다. 참고: 3D 이미지는 읽었고 3D 프린터에서 인쇄. 인쇄 마스크와 금형 단계 1.1.1에서 그래픽 소프트웨어를 사용 하 여 정의 하는 3 차원 이미지와 같은 크기 있다.</li>
		<li>인쇄 마스크와 3 차원 프린터를 사용 하 여 이러한 설계에 따라 금형. 참고: 이 프로토콜에서 UV 경화 수 지와 잉크 제트 같은 3D 프린터 사용된30이었다. 그러나 프린터 해상도 635 × 400 dpi 및 15 µ m x, Y 및 Z, 각각,, 실제 X Y 해상도 약 4 배 낮 았다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nanofiber 배열 준비 (그림 3A)
	<ol>
<li>전기에 대 한 폴리머 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>9% (w/v)22tetrahydrofuran 13 %PMGI 액체를 희석.</li>
			<li>PS의 0.08 g을 분해 (수 평균 분자량 (Mn): 130000) THF:dimethylformamide (볼륨 1:1 비율)21, 마지막 1 mL (8% (w/v) PS 솔루션)까지 볼륨을가지고 THF:dimethylformamide를 추가 하 고.</li>
			<li>분해 물에 GT의 0.1 g: 아세트산 산: 에틸 아세테이트 (1:1.6:2.1 볼륨 비율), 그리고 물을 추가: 아세트산 산: 에틸 아세테이트로 최종 1 mL (10% (w/v) GT 솔루션)까지 볼륨을가지고 설명23,31.</li>
		</ol>
</li>
		<li>마 그 네트 론 스퍼터 링 기계를 사용 하 여, 폴리스 티 렌 (PS) baseplate (127.7 × 85.5 m m), 전기 설치에 음극 역할에 5 nm 두께 가진 백 금 박막을 예금.</li>
		<li>5 mL 주사기 23 G 스테인리스 스틸 무딘 바늘으로 장착으로 각 폴리머 솔루션을 로드 합니다.</li>
		<li>장소와 앵커 전기 소자의 컬렉터를 제외 하 고 12 cm 주사기 펌프에 바늘 주사기.</li>
		<li>높은 전압 전원 공급 장치에 주사기 바늘을 연결 하 고 11에 적용할 설정 kV.</li>
		<li>0.2 mL/h의 양수 속도 설정 합니다.</li>
		<li>30 ° C와 < 30% (v/v)에서 온도 습도 유지.</li>
		<li>준비 단계 1.2.2 baseplate에 마스크를 넣어.</li>
		<li>전기 시간을 변경 하 여 고유한 밀도와 마스크의 구멍을 통해 baseplate에 nanofibers 조작 (예를 들어, 20, 60, 90, 및 180 s).</li>
		<li>baseplate에서 마스크를 제거 합니다. 참고. 에탄올을 벗 겨 내는 마스크와 함께 GT nanofibers 피하기 위해 마스크를 제거 하기 전에 electrospun GT nanofibers에 살포 될 수 있다.</li>
		<li>단계 1.2.4-1.2.10 nanofiber 배열 제작 완료 될 때까지 반복 합니다.</li>
		<li>나머지 용 매 증발에 16 h 25 ° C에서 desiccator nanofiber 배열 장소.</li>
		<li>0.2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide 염 산 염 (EDC)와 0.2 M N-hydroxysuccinimide (NHS) 25 ° C 4 h23에서 에탄올에 Crosslink GT nanofibers.</li>
		<li>16 h 25 ° C에서 99.5% (v/v) 에탄올 및 진공 건조로 두 번 GT nanofibers 린스.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
미세 구조의 제작 (그림 3B)
	<ol>
<li>에이전트 및 PDMS 자료의 20 g 치료 PDMS의 2 세대 혼합 (1시 10분 무게 비율; Pre-PDMS). 24
</li>
		<li>1.2 단계에서 조작 하는 금형에 사전 PDMS 혼합물을 붓는 다.</li>
		<li>탈 가스에서 30 분 동안 desiccator 사전 PDMS 혼합물.</li>
		<li>16 h 65 ° C에서 오븐에 사전 PDMS 혼합물을 치료.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
어셈블리의 MACME 배열 (그림 3B)
	<ol>
<li>1.3.4 형에서와 70% (v/v) 에탄올과 깨끗 한 단계에서 치료 PDMS 구조를 벗기십시오.</li>
		<li>PDMS 구조32의 하단 측면에 대기 코로나 방전 처리 합니다. 참고: 이 프로토콜에서 코로나는 3 또는 4 번 "핸디" 코로나 방전 장치 층의 전체 표면에 출력 된다. 산소 플라즈마 처리 표면 접착 력 변경 대기 코로나 방전으로 대체 되었다.</li>
		<li>Nanofiber 배열 된 PDMS 구조를 신속 하 게 조립.</li>
		<li>오븐-구워 65 ° C에서 2 일 동안.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. MACME 배열에 hESCs 로드
<ol><li>H9 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 일상 문화에 대 한 셀 이종 무료 화학적 hPSC 유지 보수33 10 µ M Y-27632 바위 억제제34 (hPSC 매체 라는) 35 m m 세포 배양에서 보충에 대 한 문화 매체를 정의 하는 것을 유지합니다 지하실 막 젤 매트릭스 (MG)으로 요리.</li>
	<li>통로 세포 재조합 트립 신 같은 효소를 사용 하 여 4 ~ 7 일 마다.</li>
	<li>10 분 동안 챔버로 로드 하 여 99.5% 에탄올, MACME 배열을 소독 한 다음 에탄올을 제거. 3 번이이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>MG, 10 µ g/mL vitronectin (VN)의 12 µ L를 소개 하 고 컨트롤에 0.1% (w/v) GT 문화 실, 고 실 챔버 표면에 코트를 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어. 참고: 이 프로토콜에 MG, VN, 그리고 GT는 세포 접착 및 문화에 대 한 참조 단백질으로 선정 됐다. MG와 VN 표준 셀 문화 매트릭스 hPSC 자체-갱신 유지에 사용 되는, 때문에 그들은 긍정적인 컨트롤;로 사용 됩니다. 2 차원 GT 코팅 (2DGT) 또는 비 코팅 (NC)는 부정적인 컨트롤으로 사용 되었다.</li>
	<li>MACME 배열의 모든 챔버에 미리 데워 진된 hPSC 매체를 소개 합니다. 37 ° c.에 30 분 동안 챔버를 품 어</li>
	<li>씻어 H9 hESC DPBS, 35 mm 접시에 배양 접시에 재조합 트립 신 같은 효소의 0.5 mL을 추가 하 고 1 분 동안 37 ° C에서 품 어 신중 하 게 발음만 supernatants 효소와 혼합. 참고: 포부 단계에서 세포를 분리 하는 되지.</li>
	<li>부드럽게 반복적으로 세포 분열을 15 mL 원뿔 튜브를 분리 된 세포를 전송 접시 표면에 대 한 매체를 분배, 즉시 hPSC 매체를 추가 합니다.</li>
	<li>200 x g 3 분 Aspirate는 상쾌한에 centrifuge 고 미리 데워 진된 hPSC 매체에 셀 중단.</li>
	<li>각 미세 챔버에 세포 현 탁 액 (1.2 × 106 셀/mL)의 12 µ L를 소개 합니다. 참고: micropipette를 사용 하 여 다른 한 챔버에 세포를 소개 합니다. 셀 챔버에 시드 수 챔버 바닥 위에 열 밀도에 비례 이기 때문에 불구 하 고 동일한 세포 현 탁 액에서 샘플 사용 되었다 초기 셀 시드 밀도 제어할 수 수 있습니다. 부드럽게 이루어집니다 pipetting 확인 합니다. 목화로 만들어진 지팡이 사용 하 여 로드 후 약 실에서 초과 매체를 제거 합니다. MACME 배열이 일반적으로 사용 되는 실험실 펫와 자동된 피 펫 시스템, 그리고 그것은 어떤 특별 한 장비가 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>변경 hPSC 매체 마다 12 h와 문화 4 일. 참고: 매체의 지속적인 볼륨 (1.6, 3.2, 그리고 6.4 µ L) 다른 크기의 챔버를 사용 하 여 유지 된다. 문화 세포 세포 배양 매체35,36의 교환 제외한 전단 응력을 최소화 하기 위해 정적 조건 하에서.</li>
</ol>3. 양적 단일 셀 프로 파일링
<ol><li>
접시에 형광 세포 염색 참고: hPSCs 자기 갱신의 phenotypic 변화를 분석,이 프로토콜 선택이 프로토콜에 대 한 세 가지 주요 phenotypic 마커: OCT4, deoxyuridine (듀),-5-ethynyl-2'와 Annexin V pluripotency, 확산, 및 apoptosis의 상태를 측정 하 각각 (그림 2b). 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 세포 핵을 식별 하는 데 사용 됩니다. OCT4는 pluripotency의 중요 한 녹음 방송 요인 중 하나입니다.<ol>
<li>30 분 동안 37 ° C에서 10 µ M 듀 alkyne 보충 hPSC 매체에 MACME 배열에서 H9 hESCs를 품 어.</li>
		<li>씻은 후 annexin 바인딩 버퍼 (10 mM HEPES (pH 7.4), 140 m NaCl, 2.5 m CaCl2m m), 셀 한 오렌지 형광 염료 Annexin V 공액 20 ° c에서 15 분을 얼룩.</li>
		<li>15 분 동안 20 ° C에서 4% (v/v) paraformaldehyde와 PBS에서 셀을 수정 하 고 PBS 가진 셀을 두 번 씻어.</li>
		<li>0.3% (v/v) 트라이 톤 X-100 16 h 20 ° C에서 PBS를 사용 하 여 셀 permeabilize 참고: Paraformaldehyde 플라스틱 베이스 플레이트 및 PDMS 미세 구조 사이의 유대를 약화. 따라서, 단계 3.2.1에서 배열에서 PDMS 층의 초연 직후에이 단계도 수행할 수 있습니다.</li>
		<li>30 분 동안 20 ° C에서 빨간색 형광 염료 아 지 드와 트리 기반 반응 버퍼에 세포를 품 어.</li>
		<li>셀 16 h 4 ° C에서 블로킹 버퍼 (PBS 5% (v/v) 정상 염소 혈 청, 혈 청 5% (v/v) 정상 당나귀, 3% (w/v) 소 혈 청 알 부 민, 0.1% (v/v) 트윈-20, 그리고 0.1% (w/v) N-라우릴-β-D-maltoside)에 품 어.</li>
		<li>0.5% (v/v) 트라이 톤 X-100 솔루션 PBS에 인간의 OCT3/4 항 체 (마우스 IgG) 16 h 4 ° C에서 품 어.</li>
		<li>60 분 동안 37 ° C에서 녹색 형광 염료 라는 당나귀 안티 마우스 IgG (H + L) 블로킹 버퍼에서 품 어.</li>
		<li>30 분 동안 20 ° C에 DAPI와 PBS에서 품 어.</li>
		<li>PBS에 PBS DAPI 바꿉니다.</li>
		<li>이미지 수집까지 4 ° C에서 MACME 배열을 유지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수집 이미지 (그림 4)
	<ol>
<li>MACME 배열에서 PDMS 미세 구조를 벗기십시오.</li>
		<li>MACME 배열에서 잔여 PBS를 제거 하 고 세포를 PBS에서 90%(v/v) 글리세롤 적용 스테인드 셀 coverslips 장소.</li>
		<li>거꾸로 거꾸로 형광 현미경의 스테이지에 접시를 설정 합니다.</li>
		<li>모든 자동화 된 구성 요소 (무대, 필터, 셔터, 및 초점 시스템) 현미경 이미징 소프트웨어에 의해 통제 되었다를 사용 하 여 자동으로 12-비트 컬러 이미지를 취득 합니다. 참고. 이 프로토콜에서 노출 시간 최대 강도 값 근처에 도달 하도록 조정 됩니다 (높은 픽셀 강도: 4096), 각 이미지, DAPI, OCT4, Annexin V와 듀 채도 없음 하지만.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
컴퓨터 기반 영상 처리 및 형광 신호 정량화 (그림 5) 참고: 다음 셀 이미지 분석37앞에서 설명한 방법 따라 수행 됩니다.<ol>
<li>컬러 이미지를 회색조로 변환 합니다.</li>
		<li>오쓰 방법으로 각 DAPI 이미지에 대 한 단일 임계값 값을 계산 하 고 임계값을 전경으로 하 고 아래 픽셀 분류 배경으로. 전경색 값 DAPI의 형광 강도에 해당 함을 확인 하십시오. 참고: 5 단계;를 포함 하는 이미지 분석 프로세스 DAPI에서 기본 개체의 식별 이미지, 각각, OCT4, Annexin V에 듀 이미지, 보조 개체의 식별 및 개체 강도의 측정. 그림 3 이미지 처리 설정에 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)의 이미지를 제공합니다.</li>
		<li>각 이미지에 OCT4 및 듀의 형광 강도 측정 합니다.</li>
		<li>전파 방법 Annexin v 스테인드 영역을 식별 하 고 형광 강도 측정.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3.4. 통계 분석을 시각화 하는 단일 셀 이미징에 개별 세포 고기
	<ol>
<li>중심으로 하 고 그들에 게 동등한 무게를 주고 이러한 변수를 확장 하 여 각 phenotypic 마커의 입력된 형광 강도 정상화.</li>
		<li>통계 컴퓨팅 및 그래픽 이전 연구38,39에 의해 설명 된 대로 소프트웨어 환경을 사용 하 여 자체 조직 지도 (SOM) 분석을 수행 합니다.<ol>
<li>독특한 4 개의 "스트림과 벡터" 해당 4 마커, DAPI, 듀, Annexin V 및 OCT4 형광 강렬 하로 25 솜 노드를 만듭니다.</li>
			<li>각 microenvironment 개별 셀 "승리" (가장 유사한) 노드에 할당 하 고는 승리 노드 스트림과 벡터 업데이트 무게는 학습 속도가 중된 평균을 사용 하 여 셀 주파수로 플롯 (여기, 0.05로 기본값)입니다. 참고: 몇 셀을 포함 하는 데이터 집합은 통계적으로 관련성이 높은 솜 결과 제공 하지 않았다 때문에 미만 1000 셀을 포함 하는 약 실에서 데이터를 생략 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>클러스터링 소프트웨어40여 피어슨 상관 관계에 따라 평균 연결 방법을 사용 하 여 솜 노드 값 자동 계층적 클러스터링을 수행 합니다.</li>
		<li>Dendrogram와 heatmap 조회41에 클러스터링 데이터를 렌더링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

없음입니다.

이 프로토콜 자격 갖춘된 hPSCs의 유지 보수에 대 한 강력한 문화 시스템 구축 첫 번째 심사 메서드를 보여 줍니다. 첫째, 우리는 다양 한 인공 소프트웨어와 통합 nanofiber 배열, MACME 배열 된 미세 장치를 사용 하 여 밀도 시드 셀 플랫폼을 준비 하는 방법을 설명 합니다. 두 번째, 양적 이미지 기반 단일 셀 형질 개별 세포 결과 및 다른 생 화 확 및 생물 기능에 의해 변경 하는 동작 수행된50 이었다. 이 프로토콜에서 GT nanofiber 시드 밀도 높은 초기 세포의 상태에 긍정적인 제어 ECM 단백질의 구성 된 환경 undifferentiated 상태;의 기능 특징 이었다 급속 한 확산45 와 안정적인 OCT4 식51. 이 관측은 "세포-기질" 및 "셀" 상호 작용 하는 분자 메커니즘 hPSCs의 pluripotency 영향을 미칠 수 표시.
<p class="jove_...

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)1,2 자체 unlimitedly 확장 한다 갱신 하 고 신약 개발, 세포 기반 치료, 조직 공학 및 재생 의학 혁명을 수 있는 다양 한 조직 혈통으로 차별화 3 , 4 , 5 , 그러나 6. 일반 문화 요리와 결정 판,, 세포 확장을 위한 중요 한 요소는 정확한 물리적, 화학적 셀 조작 범위의 나노를 마이크로-미터, 세포 수준에서 사용 하도록 설계 되지 않았습니다 셀프-갱신, 그리고 감 별 법입니다. 이 단점을 해결 하기 위해 연구 세포 운명 결정 및 셀 기능4규제에 세포 microenvironments의 역할 조사 했습니다. 최근 몇 년 동안, 연구의 증가7,8 체 외에서세포 microenvironments를 재구성 하기 위해 실시 되었습니다. 나노 및 마이크로 제작 공정 화학9,10,,1112,13의 조작을 통해 이러한 microenvironments 설립 14,15,,1617 및 실제18,,1920 환경 신호. 지금까지 세포 운명 결정 및 단일 플랫폼 내에서 기능에 화학적 및 물리적 환경 단서의 기본 메커니즘을 체계적으로 조사를 보고 했다.
여기에 심플한 디자인 원칙 강력한 심사 플랫폼 (그림 1)을 설정 하는 전략을 소개 합니다. 우리가 nanofiber 배열 및 미세 구조를 사용 하 여 다재 다능 한, 인공 세포 microenvironments를 만들기 위한 통합된 플랫폼의 개발 절차를 설명 하는 첫째,: 더 다중화 인공 세포 MicroEnvironment (MACME) 배열 (그림 1A 그리고 2A). Nanofiber 배열 nanofiber 재료와 밀도의 다양 한 조합에서 12 다른 microenvironments를 있다. 전기 조작 nanofibers 하 사용 되었다. 폴리스 티 렌 (PS)21,22, polymethylglutarimide (PMGI) 젤라틴 (GT)23, 같은 nanofiber 재료 세포 접착 및 pluripotency ( 의 유지 보수에 영향을 미칠 수 있습니다 그들의 화학 재산을 테스트 하도록 설계 되었습니다. 그림 2B). Nanofiber 밀도 했다 전기 시간을 변경 하 여 다양 하 고 생성 된 nanofibers 그들의 밀도 따라 정의 된 (DNF, d = XLow/낮은/중간/높은). 미세 구조입니다 (PDMS) 48 세포 배양 챔버, 96-잘 microplate의 표준 치수에 따라 배치 될 수 있습니다 있는 은닉의 구성 됩니다. PDMS는 일반적으로 미세 장치24를 조작 하는 데 사용 하는 생체 및 가스 교환 중합체 이다. 각 미세 채널 설계 되었습니다 700 µ m 폭 및 8.4 m m 길고 가장자리 (표 1)에서 2 개의 후미를 했다. 약 실 다른 고소 했다 (250, 500 및 1000 µ m)에서 초기 셀 시드 밀도 (0.3, 0.6, 1.2 × 105 셀/cm2), 생존, 확산, 그리고 hPSCs25의 연관 시킬 수 있는 조작 (그림 2C). 챔버로 시드 셀 수 챔버 바닥 위에 열 밀도에 비례 이며 따라서 밀도 시드 초기 셀 문화 실로 서로 다른 높이와 동일한 세포 현 탁 액을 도입 하 여 통제 되었다. 모든 채널 ≥ 250 µ m 높이26 셀에 낮은 산소 긴장27 및 전단 응력28 의 효과 최소화 하기 위해 되도록 설계 되었습니다. 250, 500 및 1000 µ m의 채널 높이 여기 약식 x XCD = 낮음, 중간, 그리고 높은, 각각. 고유한 nanofiber 밀도와 초기 셀 시드 밀도 환경 "Material_NF density_Cell 밀도"로 단축 되었다 (예를 들어, GT_HighNF_HighCD: 고밀도 GT nanofibers 및 높은 초기 셀 시드 특징 환경 밀도)입니다.
그 후, 우리는 단일 셀 셀 동작 환경 요인 (그림 1B)에 대 한 응답을 체계적으로 조사 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 의 증거-개념, 우리 식별 hPSC 자체 재생을 위한 최적의 세포 환경 hPSC 유지 보수 (그림 1B)29에 대 한 주요 기능입니다. 이미지 기반 cytometry, 통계 분석, 이어서 세포 환경 개별 세포 phenotypic 응답의 정량적 해석 할 수 있습니다. 다양 한 세포 기능 가운데이 종이 hPSC 자기 갱신을 유지 하기 위한 최적의 조건을 식별 하는 자세한 절차를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>폴리스티렌 (PS)</td><td>Sigma</td><td>#182435</td><td>평균 MW: 290,000, 평균 Mn: 130,000</td></tr><tr><td>폴리메틸글루타리미드(PMGI)</td><td>MicroChem</td><td>G113113</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴(GT)</td><td>Sigma</td><td>G2625</td><td>돼지 가죽에서 추출한 A형</td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Doe Corning Toray</td><td>#1064291</td><td>PDMS 경화제 및 실리콘 엘라스토머 베이스가 이 키트의 구성 요소입니다.</td></tr><tr><td>OpenSCAD</td><td></td><td></td><td>이것은 미세유체 장치의 금형을 설계하는 데 사용되는 무료 3D 컴퓨터 그래픽 소프트웨어(http://www.openscad.org/)입니다.</td></tr><tr><td>AutoCAD 2014</td><td>Autodesk</td><td></td><td>나노 섬유 어레이 준비에 사용되는 마스크 설계에 사용되는 3D 컴퓨터 그래픽 소프트웨어 (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview)입니다.</td></tr><tr><td>3D 프린터, AGILISTA-3000</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV 경화 수지, AR-M2</td><td>Keyence</td><td></td><td>Agilista의 3D 프린팅에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>시그마</td><td>#338826</td><td>&ge; 99.99%</td></tr>에<tr><td>틸 아세테이트</td><td>Sigma</td><td>#270989</td><td>무수, 99.8%</td></tr><tr><td>테트라하이드로퓨란(THF)</td><td>시그마</td><td>#401757</td><td></td></tr><tr><td>MSP-30T</td><td>진공 장치</td><td></td><td>마그네트론 스퍼터링 머신</td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#242811</td><td>이것은 나노 섬유 어레이가 생성되는 폴리스티렌 베이스 플레이트입니다. 이 플레이트 크기는 일반적으로 127.7 x 85.5mm입니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>건형 코로나 방전 가공기</td><td>신코전기(주) 계측</td><td>CFG-500</td><td>이 편리한 장치는 프로토콜의 1.5단계 "MACME 어레이 어셈블리"에서 PDMS 계층의 바닥 표면을 활성화하기 위한 코로나를 생성하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>5mL 주사기</td><td>Terumo</td><td>SS-05SZ</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 무딘 바늘(23게이지)</td><td>Nipro</td><td>#2166</td><td>외경과 길이는 각각 0.6mm와 32mm입니다.</td></tr><tr><td>고전압 전원 공급 장치</td><td>TechDempaz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride</td><td>Dojindo</td><td>W001</td><td></td></tr><tr><td>N-Hydroxysoxynimide</td><td>Sigma</td><td>#56480</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel hESC 인증 Matrix</td><td>Corning</td><td>#354277</td><td>이 단백질은 프로토콜에서 기저막 겔 매트릭스로 언급됩니다.</td></tr><tr><td>CellAdhere Vitronectin, Human, Solution</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#07004</td><td></td></tr><tr><td>TeSR-E8</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#05940</td><td>인간 ES 및 iPS 세포 유지를 위한 무공급, 무이종 배양 배지</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>#253-00513</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#12605028</td><td>이것은 부착 포유류 세포의 해리를 위한 재조합 트립신 유사 프로테아제입니다.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Azides가 포함된 Click-iT EdU 이미징 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10086</td><td>온플레이트(on-plate) 형광 염색에서 증식 세포의 형광 라벨링은 이 키트의 제품 설명서에 따라 수행되었습니다.</td></tr><tr><td>Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A13203</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 항체 (C-10)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-5279</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 IgG H& L (DyLight 488)</td><td>abcam</td><td>ab96875</td><td>이것은 온-플레이트 형광 세포 염색에 사용되는 2차 항체입니다.</td></tr><tr><td>ECLIPSE Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td>CFI Plan Fluor 4&times;/0.13 N.A. 대물 렌즈(Nikon), CCD 카메라(ORCA-R2, Hamamatsu), 수은 램프(Intensilight, Nikon), XYZ 자동화 스테이지(엔코더가 있는 Ti-S-ER 전동 스테이지, Nikon) 및 4개의 형광 채널(DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)</td></tr><tr><td>NIS-Elements Advanced</td><td>Research Nikon</td><td></td><td>은 자동 이미지 획득에 사용되는 현미경 이미징 소프트웨어입니다.</td></tr><tr><td>CellProfiler, 버전 2.1.0</td><td></td><td></td><td>이것은 세포 이미지 분석(http://cellprofiler.org/)을 위한 무료 개방형 소프트웨어입니다.</td></tr><tr><td>R</td><td></td><td></td><td>SOM 분석은 이 소프트웨어의 kohonen 패키지에 의해 수행됩니다. 이것은 무료로 사용할 수 있습니다(https://www.r-project.org/).</td></tr><tr><td>Cluster 3.0</td><td></td><td></td><td>오픈 소스 클러스터링 소프트웨어(http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm)입니다. 비지도 계층적 클러스터링은 이 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다.</td></tr><tr><td>Java TreeView</td><td></td><td></td><td>: 이 오픈 소스 소프트웨어(http://jtreeview.sourceforge.net/)는 클러스터링 데이터를 히트맵 및 덴드로그램으로 시각화하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>H9 인간 배아 줄기 세포</td><td>WiCell 줄기 세포 은행</td><td>WA09</td><td></td></tr></tbody></table>

멀티플렉스 인공 세포 microenvironment 배열의 제작

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

단서, 성장 인자, 세포 외 매트릭스, 세포 상호 작용 등의 다양 한 세포 microenvironments에 의하여 이루어져 있다. 이러한 신호 잘 조율 된 그리고 생활 시스템에서 세포 기능 조절에 중요 한. 연구자의 숫자는 환경 요인과 원하는 세포 기능 간의 상관 관계를 조사 하려고 했습니다, 많은 알 수 없는 남아 있다. 이것은 같은 환경 신호에 vitro에, 모방 하 고 셀에 다른 환경 신호를 테스트 하는 동시에 적절 한 방법론의 부족 때문에 크게 이다. 여기, 우리는 미세 채널 및 높은 콘텐츠 단일 셀 분석, 줄기 세포 고기 다른 환경 요인에 의해 변경 될 검사를 다음 nanofiber 배열의 통합된 플랫폼을 보고 합니다. 설명 하기 위해이 플랫폼의 응용 프로그램,이 연구는 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs) 자기 갱신의 고기에 집중 한다. 여기, 우리 다중화 인공 세포 MicroEnvironment (MACME) 배열의 제작에 nanofiber 배열 및 미세 구조에 대 한 준비 절차를 제시. 또한, 프로 파일링, 여러 형광 마커, 여러 형광 이미징, 그리고 통계 분석, 얼룩 셀 단일 셀의 전체 단계 설명 합니다.

MACME 배열: 설계 및 제조: Nanofiber 기술 함께, 우리는 미세 세포 배양 및 심사 기술을 이전 hPSC 자체 갱신 또는 차별화35,36 (그림 1)에 대 한 최적의 조건을 식별 하기 위해 사용. 이것은 세포 배양 챔버와 조건을 정확 하 게 제어 하 고 확장 가능한42,,4344때문에 강력한 높은 처리량 세포 기반 분석을 설정 하는 데 적합. 여기, nanofiber 배열 간단한 nanofiber 증 착 방법, 3D 인쇄 마스크와 전기에 의해 준비 되었다. 미세 부품 쉽게 많은 시련과 오류를 통해 챔버 구조...

이 문서에서는 물리와 화학의 높은 처리량 조작 신호 세포 microenvironments vivo에서 흉내 낸 고을 다중화 인공 세포 MicroEnvironment (MACME) 배열 준비 하 상세한 방법론 단일 셀 프로 파일링 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)를 위한 최적의 휴대폰 환경을 식별 합니다.

멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

이 방법은 세포 미세 환경이 세포 표현형과 기능을 어떻게 변화시키는지와 같은 줄기 세포 공학 분야의 핵심 질문에 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 마이크로 콘택트 플레이트에서 기존 방법으로는 수행할 수 없는 단일 플레이트의 세포에 인위적으로 생성된 여러 환경을 제공한다는 것이며, 이 절차는 우리 실험실의 기술자인 Koki Yoshimoto와 Risako Sakai가 시연할 것입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 미세유체 구조에서 나노 섬유 어레이 및 몰드용 마스크의 3D 이미지를 생성한 후.3D 프린터를 사용하여 마스크와 금형을 인쇄합니다. 전기 방사를 위한 고분자 용액을 준비하려면 13% PMGI 액체를 테트라히드로푸란으로 9%로 희석합니다. 0.08g의 PS를 THF와 디메틸포름아미드의 1:1 부피 비율로 용해시키고 액체 리젠트를 사용하여 부피를 PS 용액당 8% 중량의 최종 1밀리리터까지 가져옵니다.0.1g의 GT를 물, 산성 산 및 에틸 아세테이트에 용해시키고 혼합 용매 용액을 사용하여 부피를 10 % 중량 기준 GT 용액의 최종 1 밀리리터까지 가져옵니다. 다음으로, 마그네트론 스퍼터링 기계를 사용하여 전기 방사 설정에서 음극 역할을 하는 폴리스티렌 베이스 플레이트에 5나노미터 두께의 백금 층을 증착합니다. 각 폴리머 용액을 23게이지 스테인리스강 무딘 바늘이 장착된 5ml 주사기에 넣습니다.그런 다음 전기 방사 장치의 수집기에서 12cm 떨어진 주사기 펌프에 주사기를 고정합니다. 주사기 바늘을 고전압 전원 공급 장치에 연결하고 11k볼트로 설정합니다. 그런 다음 펌핑 속도를 시간당 20밀리리터로 설정하고 온도와 습도를 각각 섭씨 30도와 부피 기준으로 30% 미만으로 유지합니다.이제 베이스 플레이트에 마스크를 놓습니다. 그런 다음 마스크의 구멍을 통해 전기 회전 시간을 변경하여 베이스 플레이트에 뚜렷한 밀도의 나노 섬유를 제작합니다. 베이스 플레이트에서 마스크를 제거하고 나노 섬유 제작을 반복합니다.어레이가 완성되면 섭씨 25도의 데시케이터에 16시간 동안 넣어 남은 용매를 증발시킵니다. GT 나노 섬유를 가교하려면 에탄올에서 0.2 몰 EDC 및 0.2 몰 NHS로 처리하십시오. 그리고 샘플을 섭씨 25도에서 4시간 동안 배양합니다.GT 나노 섬유를 헹구려면 99.5% 에탄올을 두 번 사용하고 플레이트를 섭씨 25도에서 16시간 동안 진공 건조합니다. 미세유체 구조를 제조하려면 PDMS 경화제 2g과 PDMS 염기 20g을 혼합합니다. 그런 다음 pre-PDMS 혼합물을 제작된 금형에 붓습니다.데시케이터에서 30분 동안 pre PDMS 혼합물을 탈기합니다. 그런 다음 pre PDMS 혼합물을 섭씨 65도의 오븐에서 16시간 동안 경화시킵니다. Macme 어레이를 조립하려면 금형에서 경화된 PDMS 구조를 벗겨내고 70% 에탄올을 사용하여 청소합니다.그런 다음 PDMS 구조의 바닥면에서 대기 코로나를 방전합니다. 나노 섬유 어레이로 PDMS 구조를 빠르게 조립할 수 있습니다. 그런 다음 어셈블리를 섭씨 65도에서 이틀 동안 오븐에서 굽습니다.DPBS를 사용하여 35mm 접시에서 배양된 H9HESC를 세척합니다. 그런 다음 0.5ml의 재조합 트립신 광 프로테아제를 접시에 넣고 섭씨 37도에서 1분 동안 배양합니다. 상등액 프로테아제 혼합물을 조심스럽게 흡인합니다.즉시 HPSC 배지를 추가하고 배지를 접시 표면에 반복적으로 부드럽게 분배하여 세포를 해리합니다. 그런 다음 분리된 셀을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 튜브를 중력의 200배로 3분 동안 원심분리한다.상등액을 흡입하고 예열 된 HPSC 배지에 세포를 현탁시킵니다. 그런 다음 12마이크로리터의 세포 현탁액을 각 미세유체 챔버에 피펫팅합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 형광 라벨링한 후 Macme 어레이에서 PDMS 미세유체 구조를 벗겨냅니다.그런 다음 Macme 어레이에서 잔류 PBMS를 제거하고 PBS의 글리세롤 90%를 염색된 세포에 첨가한 다음 커버 슬립을 적용합니다. 마지막으로, 도립 형광 현미경의 스테이지에 플레이트를 거꾸로 놓습니다. 그리고 현미경 이미징 소프트웨어를 사용하여 12비트 컬러 이미지를 획득합니다.여기에 표시된 것은 젤라틴 나노 섬유에서 높은 초기 파종밀도로 배양되고 3개의 세포 표현형 마커로 염색된 H9HPSC의 면역형광 이미지입니다. SOM 분석을 사용하여 각 데이터 세트에 있는 4개의 표현형 마커에 대한 발현 수준의 동질성과 이질성을 비교하기 위해 고차원 다중 파라메트릭 데이터 세트를 저차원 2D 맵으로 변환하고 SOM 노드에 대해 비지도 계층적 클러스터링을 수행했습니다. 여기에서 지적된 바와 같이, 모든 그룹은 기저막 겔 매트릭스 또는 MG에서 관찰된 것보다 더 높은 OCT4 발현을 보였습니다. 그룹 1은 높은 EdU 신호를 보였는데, 이는 대부분의 세포가 활발하게 증식하고 있음을 나타냅니다.따라서 그룹 1의 미세환경은 세포주기 갭 단계가 단축될 때 미분화된 HPSC가 빠르게 증식하기 때문에 HPSC 유지 관리에 적합했습니다. 그룹 2에는 불충분한 초기 밀도에서 파종된 세포와 HPSC 자가 재생을 지원하지 않는 2D GT 스캐폴드에서 성장한 세포가 포함되었습니다. 예를 들어, 이 샘플의 EdU 신호가 손실되고 아넥신 V 수치가 약간 증가하여 세포가 줄기성을 잃고 점차 세포사멸이 되었음을 나타냅니다.PMGI 나노 섬유 매트릭스를 구성하는 미세환경을 나타내는 그룹 3의 PMGI MidNF HighCD는 다른 조건에 비해 OCT4 및 EdU 신호에서 더 큰 변화를 보였습니다. 개발 후 이 기술은 줄기세포 분야의 연구자가 조직 공학 및 고급 스크리닝을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

fabrication-multiplexed-artificial-cellular-microenvironment

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 단백질 배열의 표현을위한 마이크로 유체 접근 방식을 제시한다. 이 장치는 마이크로 기계 밸브에 의해 제어 반응 챔버의 수천으로 구성되어 있습니다. 마이크로 유체 장치는 microarray 인쇄 유전자 도서관에 결합되어 있습니다. 이러한 유전자 그런 다음 베꼈 및 실험 사용할 준비가 단백질 배열의 결과로, 칩에 번역되어 있습니다.

마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

세포 기능에 microenvironments의 분자 구성의 영향에 통찰력을 얻기위한 조합 기능 검사 방법을 설명합니다. 방법은 세포 접착 및 기능 분석을 지원하는 정의 조합 microenvironments의 배열을 생성하기 위해 기존의 microarray 기반 기술을 활용합니다.

제조 및 MicroEnvironment의 microArrays의 사용 (MEArrays)

이 원고는 공간적으로 제한, 기능적으로 상호 연결된 신경 회로로 구성된 체외 모듈 형 네트워크에서 성장하는 프로토콜을 설명합니다. 마스크는 폴리머 기판 위에 배양 세포 접착을 촉진하는 단백질 패턴 층을 사용한다. 도금 뉴런 코팅 분야 자발적인 연결을 설정 및 전기 생리 활성을 나타내는에서 성장.

설계, 치료, 세포 도금 및 기능적으로 간 연결 회로의 구성, 모듈 형 신경 네트워크의 배양 표면

이 프로토콜은 세포 신호 전달 연구와 바이오 마커 검출 잠재적 인 응용 프로그램과 대규모의 제조, 다중화 된 두 차원의 DNA 또는 항체 배열을 설명합니다.

고밀도 바코드 항체 마이크로 어레이의 흐름 패턴 가이드 제작

세포 분화를 모두 매트릭스 조성물과 기판의 재료 특성을 포함한 미세 환경 요인의 호스트에 의해 조절된다. 우리는 여기에 세포 분화 및 미세 환경 콘텍스트의 함수로서 생체 역학적 세포 기질 상호 작용 모두를 평가 견인력 현미경과 함께 세포의 마이크로 어레이를 이용하는 방법을 설명한다.

세포 분화 및 견인 힘의 상관 관계 분석을위한 높은 처리량 세포 마이크로 어레이 플랫폼

미생물 군집의 개발은 환경 구조, 구성원의 풍부 성, 형질 및 상호 작용을 포함하는 여러 요소의 조합에 달려있다. 이 프로토콜은 틈새 크기 및 감금과 같은 핵심 요소가 근사 될 수있는 femtoliter 우물에 포함 된 수천 개의 공동체를 동시에 추적하기위한 합성, 미세 제작 환경을 설명합니다.

마이크로 웰 어레이 플랫폼 내 미생물 공동체 개발의 구성 및 추적

두 슬라이드를 간단 하 게 스냅 하 여 교차 reactivity 무료 다중화 샌드위치 immunoassays를 수행 하기 위한 스냅 칩 기술을 설명 합니다. 스냅 기구 시 약 microarray microarray에서 안정적으로 전송 하는 데 사용 됩니다. 어떤 생 화 확 적인 반응을 교차 오염 없이 다른 시 약의 colocalization를 요구에 대 한 스냅 칩을 사용할 수 있습니다.

교차 reactivity 무료 및 정찰 병 무료 스냅 칩 샌드위치 Immunoassays 다중화

여기에 제시된 방법의 목적은 미세 환경 마이크로어레이(MEMA)가 배양된 세포의 표현형에 대한 수천 개의 간단한 조합 미세 환경의 영향을 심문하기 위해 제조되고 사용될 수 있는 방법을 보여주는 것입니다.

마이크로어레이를 사용하여 암 세포 표현형에 대한 미세 환경적 영향을 심문

우리는 1500 배양 장치, 향상된 연동 펌프의 배열및 현장 믹싱 계수로 구성된 복잡한 생명 기계에 대한 높은 처리량 연구를위한 미세 유체 시스템을 제시합니다. 미세 유체 칩은 생체 내 매우 복잡하고 역동적인 미세 환경 조건을 분석할 수 있게 해줍니다.

고처리량 미세 유체 장치를 사용하여 동적 환경 조건의 생성

본 프로토콜은 맞춤형 UV 조명 장치를 사용하여 3D 매트릭스-모방 배양물에서 환자 유래 교모세포종 세포의 화학요법 반응에 대한 기계적 및 생화학적 단서의 영향을 평가하기 위한 실험 플랫폼을 기술하며, 조정 가능한 기계적 특징을 갖는 하이드로젤의 고처리량 광가교를 용이하게 한다.

하이드로겔 어레이는 3D 종양 모델에서 매트릭스 성분 및 치료제의 스크리닝 효과를 위한 처리량 증가를 가능하게 합니다.

전통적으로, 세포 배양은 생체 내에서 세포의 자연 환경을 잘 모방하지 못하는 평면 기질에서 수행됩니다. 여기서 우리는 생리적으로 관련된 곡선 기하학과 미세 패턴화 된 세포 외 단백질을 가진 세포 배양 기질을 생산하는 방법을 설명하여 이러한 세포 외 단서의 세포 감지에 대한 체계적인 조사를 가능하게합니다.

삼차원 세포 배양 기질의 UV-광패터닝에 의한 다큐 세포 미세환경 생성

배우세요 MACME 어레이를 이용한 다중 인공 세포 미세환경 제작 방법으로 인간 다능성 줄기세포의 고처리량 단일세포 프로파일링을 수행합니다. 이 기술은 줄기세포 공학 연구에 최적의 조건을 식별하는 데 활용됩니다.

멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작

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