Name: 진동 압 관류 장치에서 쥐 간을의 탈세 포화 절차 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 배우세요 쥐 간의 동맥 관류를 통한 균일한 탈세포화 기법을 진동 압력 조건에서. 이 방법은 재생의학 연구에서 조직 공학 및 장기 이식을 위한 스캐폴드 제작에 활용됩니다.

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저자는 이 프로젝트를 진행하는 동안 도움을 준 슈테펜 리퍼트(Steffen Lippert), 칼리드 알리예프(Khalid Aliyev), 코린나 요렌스(Korinna Jöhrens), 카타리나 스트루커(Katharina Struecker)에게 감사의 뜻을 전한다.

동물 실험 의학 (FEM, 샤리 테, 베를린, 독일)의 시설에 보관하고, 모든 실험 프로토콜을 검토하고, 국가 보건 및 지역 담당 사무소 (LAGeSo, 베를린, 독일의 승인을 하였다. 등록 번호 O 0365 / 11). 1. 간 수확 <ol><li> 수술 전 준비 <ol><li> 고정을 위해 코르크 판을 사용합니다. 접시에 의료 드레이프를 넣어. 네 바늘을 사용하여, 수술 흡입 마취의 코르크 판에 흡입 마스크를 고정한다. </li></ol></li><li> 포털 정맥 정맥의 사전 약속 <ol><li> 세 방향 꼭지에 말초 정맥 카테터 (G 20)을 연결합니다. 정맥 카테터는 약의 길이, 비스듬히 절단한다. 1.5 cm. </li><li> 드 에어 링거 용액으로 가득 10 ML의 주사기를 사용하여 시스템. 그것은 신중하게 해제 공기 가스 색전증 부정적인 관류 탈세 포화에 영향을 미칠 수 있기 때문에 매우 중요하다. </li></ol></li><li> 사전 약속동맥 정맥의 <ol><li> 나비 캐 뉼러를 사용하여 5 mm의 길이로 절단 바늘. 5mm 바늘과 superglue로 수정, 5cm 튜브 (외경 0.96 mm ID 0.58 mm)를 장착한다. 더 큰 튜브에와 superglue로 수정, 2cm 길이의 튜브 (외경 0.61 mm ID 0.28 mm)를 삽입합니다. </li><li> 교대로이 공사를 통해 다른 튜브를 미끄러 superglue로 고정합니다. 드 에어 링거 용액으로 채워진 5 ML의 주사기와 동맥 정맥. </li></ol></li><li> 마취와 진통 <ol><li> 1.5 L / min의 유량으로 산소를 3.5 %의 이소 플루 란으로 마취 유도 챔버에서 래트 마취를 유도한다. </li><li> 운전시 안전 진통을 보장하기 위해, 복강 metamizol (100 ㎎ / ㎏ 신체 질량)과 저용량 케타민 / 메데 토미 (kg의 신체 질량 당 10 밀리그램 / 0.1 mg)을 주입. </li><li> 수술 마취 이후의 유지 보수를 위해 흡입 마스크를 통해 1 L / 분 산소 1.5 % 이소 플루 란를 제공합니다. </li></ol></li><li> 수술 전 약정 &lt;OL&gt; <li> 전기 전단 기계와 자유주의로 복부를 면도. 소독 용 70 % 에탄올로 복부에 면도​​ 절개 사이트를 적셔. </li><li> , 준비된 접시에 앙와위에서 동물을 배치 흡입 마스크에 머리를 삽입하고 의료 테이프와 핀 사지를 고정합니다. 거즈 압축과 초과 에탄올과 모피를 제거합니다. </li></ol></li><li> 마취 평가 <ol><li> 호흡을 보면서 마취 깊이를 평가합니다. 마취가 (40 ~ 60 호흡 / 분)만큼 깊은 것 같다 때, 진통 두 뒷다리의 발가락 사이의 피부를 꼬집어하는 수술 집게를 사용하여 발가락 핀치 반사를 트리거하기 위해 시도하여 충분한 지 여부를 확인합니다. </li></ol></li><li> 복부 접근 <ol><li> 방광 위 꼬리 복부 벽에 중간 절개를합니다. V 자형 방식으로 양측 늑골 아치에이 시점에서 잘라. 다이어프램으로 잘라 않도록주의하십시오. 가슴 위에 잘라 복부 벽을 당깁니다. </li&gt; <li> , overholt 클램프와 칼 모양의 수정 두개쪽으로 당겨과 고무 밴드로 고정합니다. 장을 대피 젖은 면봉을 사용합니다. 젖은 거즈 붕대에 장을 감싸. 또한, 젖은 붕대 모든 복부 마진을 커버합니다. </li></ol></li><li> 간 준비 <ol><li> 낫 모양의 인대를 해부하다. 두개쪽으로 다이어프램의 돔 아래 중간과 왼쪽 간 로브를 개최 젖은 거즈 붕대를 사용합니다. hepatoduodenal 인대와 상부 대망 간 로브 노출됩니다. </li><li> 로브가 이동 될 때까지 조심스럽게 상단 대망 로브에 부착 된 인대를 해부하는 두 microforceps 봄 가위를 사용합니다. 대신에 중간과 왼쪽 엽을 잡고, 거즈 압축에서 젖은 면봉을 사용하여 로브를 이동합니다. </li><li> 위 대망 간 엽의 동원 후, 왼쪽으로 배를 이동합니다. 클램프와 위장을 수정하고 microforceps 및 스프링 가위로 작은 대망을 해부하다. </li><li> 낮은 omenta를 동원L 간 엽이 이동하고 이후에 그 구멍에 다시 로브를 이동시킬 때까지. 십이지장을 유지하기 위해 박하우스 클램프를 사용합니다. 스트레칭과 hepatoduodenal 인대를 노출 왼쪽으로 십이지장을 이동합니다. 뻗어 hepatoduodenal 인대의 담관을 외접. </li><li> 지방 및 췌장 조직에서 담관을 해부하다. 담관에게 담관 분기에서 1.5 cm를 잘라. 주위의 지방 조직에서 문맥을 해부. 십이지장 정맥을 노출. </li><li> 실크 6-0로 두 번 십이지장 정맥을 결찰하고 2 합자 사이의 정맥을 나눕니다. 모든 동맥 라미가 공개 될 때까지 주변 조직에서 복강 트렁크 및 공통 간 동맥을 해부하다. </li><li> 주변 조직으로부터 십이지장 동맥 해방. 서로 멀리 떨어져있는 관계로, 실크 6-0로 두 번 십이지장 동맥을 묶어. 2 합자 사이의 십이지장 동맥을 해부하다. </li><li> 비장 동맥을 해방주변 조직으로부터. 서로 멀리 떨어져있는 관계로, 실크 6-0로 두 번 비장 동맥을 묶어. 2 합자 사이의 비장 동맥을 해부하다. </li><li> 주변 조직으로부터 왼쪽 위 동맥 해방. 서로 멀리 떨어져있는 관계로, 실크 6-0로 두 번 왼쪽 위 동맥을 묶어. 2 합자 사이의 동맥을 해부하다. </li><li> 오른쪽 신장과 오른쪽 측면 간 엽 사이의 열등한 대정맥 정맥을 외접. 복막 공간에서 정맥을 해부하다. 복강 트렁크에 따라 대동맥을 노출. </li><li> 복막 지방 조직을 해부하다. 하대 정맥에 1 ml의 생리 식염수 1,000 IE의 헤파린을 주입한다. 캐 뉼러를 후퇴와 화장 솜에 절개를 닫습니다. 헤파린의 전신 효과를 1-2 분을 기다립니다. </li><li> 집게로 대동맥을 외접. 대동맥을 해부하고 쥐에게서 피를 뽑다. 또한, 신장에서 원심 하대 정맥을 해부하다. </li></ol></li><li> 포털 정맥로 (사용 섹션 1.2에서 제조 된 정맥) <ol><li> 말단 포털 정맥에 물고기 입 절개를합니다. 집게로 절개를 열고 포털 정맥을 cannulate. 간 탈색 될 때까지 20 ㎖ 링거 용액으로 간을 세척 및 합자 (실크 6-0)와 캐 뉼러를 해결. </li></ol></li><li> 동맥 캐 뉼러 (사용 섹션 1.3에서 제조 된 정맥) <ol><li> 복강 트렁크 위의 대동맥을 해부하다. 복막 공간에서 대동맥 세그먼트를 해방. 대동맥 패치를 생성하기 위해 길이 방향으로 대동맥 세그먼트를 잘라. 정적 홀더에 자체 내장 캐뉼라를 삽입합니다. </li><li> 캐 뉼러를 통해 대동맥 패치를 미끄러 2 집게를 사용합니다. 정맥을 통해 실크 6-0로 간 동맥을 결찰하고 지대치에 패치를 수정합니다. </li></ol></li><li> 간 외식 <ol><li> 다이어프램을 열고 원형 절개를 주변 구조에서 간을 해부하다. </li></ol></li><li> 저장 <ol><li> 스토사용할 때까지 350 ml의 링거 용액으로 가득 멸균 500ml의 탱크에 간 재. </li></ol></li></ol> 2. 세제 솔루션 <ol><li> 10 % 트리톤 X-100 원액 <ol><li> 900 ml의 아쿠아 DEST와 1,000 ml의 병을 채 웁니다. 100 ml의 트리톤 X-100 (99,9 %)를 추가합니다. 트리톤 X-100을 용해 교반기를 사용합니다. 아쿠아 DEST와 병을 채 웁니다. 1000 ml의 총 부피에 도달 할 때까지. </li></ol></li><li> 1 % 트리톤 X-100 <ol><li> 1000 ㎖의 병에 스톡 용액 100 ㎖ (10 %)를 첨가. 900 ml의 아쿠아 DEST를 추가합니다. 두 번 병을 흔들어. 멸균 필터를 통해 1 % 트리톤 X-100 용액 필터. </li></ol></li><li> 10 % SDS 원액 <ol><li> 900 ml의 아쿠아 DEST와 1,000 ml의 병을 채 웁니다. 과 66.99 g을 SDS (99.9 %, 밀도 0.67)를 추가합니다. SDS를 용해 교반기를 사용합니다. 아쿠아 DEST와 병을 채 웁니다. 1000 ml의 총 부피에 도달 할 때까지. </li></ol></li><li> 1 % SDS <ol><li> 1000 ml의 봇에 스톡 용액 100 ㎖ (10 %)을 추가TLE. 900 ml의 아쿠아 DEST를 추가합니다. 두 번 병을 흔들어. 멸균 필터를 통해 1 % SDS 용액을 필터. </li></ol></li></ol> 3. 탈세 포화 <ol><li> 관류 장치의 설정 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig1.jpg" /></li></ol> 그림 1 :. 진동 압력 조건에서 선택적 동맥과 네 쥐 간을 포털 정맥 관류에 대한 관류 장치의 제도 (. Struecker 등에서 수정 14) <ol><li> 삼방 콕 및 충전 레벨을 조절하고 500 mL의 0.9 % NaCl로 반응기를 채우기 위해 Heidelberger 확장 드레인에 링크. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig2.jpg" /></li></ol> 그림 2. (4) 포털 정맥 액세스 통해 버블 트랩 (5) (2) 또는 동맥 AC 통해 선단 관류 셋업의 반응식 관류 챔버를 연결 (1,400cm 3) (1)운 (3). 기포 트랩 (5)의 말단부에서 폐색 (4) 및 배출구 (6)를 구비한다. Heidelberger 확장 (7)에 버블 트랩 (5)를 연결합니다. 펌프 세그먼트 (8)에 Heidelberger 확장을 연결합니다. 또한, 다른 Heidelberger 확장 (9)에 펌프 세그먼트 (8)를 연결합니다. 세제 (10)의 병에 마지막 Heidelberger 확장 (9)를 삽입합니다. (관류 또는 다수의 경우에 압력 유통로) 관류 챔버에 마스크 (11)를 연결한다. 반응기 유체를 배출, 폐기물 용기 (12)에 대한 유출을 연결한다. <ol><li> 펌프로 펌프 세그먼트를 삽입합니다. PBS로주기를 채우기 위해 펌프를 시작, 버블 트랩의 선단을 닫고 환기를 엽니 다. 거품의 바닥 안전하게 PBS (2-3 CM)으로 피복되는 경우, 벤트를 닫고 버블 트랩의 말단부를 연다. </li><li> 간 설치 <ol><li> 관련 반응기 액세스 문맥 캐 뉼러의 삼방 콕 링크. C동맥 액세스 동맥 정맥 connect를. 공기가 시스템에 입력하지 않도록주의하십시오. </li></ol></li><li> 진동 압력 조건의 적용 <ol><li> 15 BPM의 주파수 및 26 밀리바 (분. 4 밀리바, 최대. 30 밀리바)의 진폭 호흡기를 사용합니다. 압력 분포 챔버로 호흡기를 연결하고 반응기 챔버를 연결합니다. 압력 응용 프로그램을 시작합니다. </li></ol></li><li> 탈세 포화 프로토콜 <ol><li> / 분 5 ㎖의 유속으로 관류 단계를 수행한다. 90 분 동안 1 % 트리톤 X-100 간 관류와 탈세 포화를 시작합니다. 관류 챔버 내부 상수 및 관류 된 간 상기 오일 레벨을 유지하기 위해 관류 장치의 유출을 통해 폐기 유출 물을 허용. 90 분 후, 1 % SDS에 세제를 변경합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig3.jpg" /> <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /></li></ol></li></ol> &lt;P&gt; 그림 3 : 모든 실험 그룹의 관류 프로토콜.

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쥐의 간 수확 및 탈세 포화에 대한 발표 기술은 쉽게 재현 할 수 있지만, 고려해야 할 중요한 특정 단계가 있습니다 : 이 혈액 응고를 활성화하고 간 내 혈전 형성으로 이어질 수 있기 때문에 간 수확을 준비하는 동안, 그것은 심한 출혈을 방지하는 것이 중요하다. 우리의 의견으로, 그 문맥을 통해 관류 동안 간동맥을 통해 혈액의 유입을 방지하기 위해 포털 정맥 삽관 직전 복부 대동맥을 절개하는 것이 바람직하다. 간이 삽관 명확 관류되면, 혈전 형성이 더 이상 문제가 없다. 관류 원형으로 가스 기포의 유입 가스 색전증을 방지하기 위해 회피되어야하기 때문에 관류 장치 간 교통 수확 후 관류 장치 간 연결의 특히 중요한 공정이다. 또한, 삼방 밸브를 미리 기입하는 것이 유용하다 IPBS를 관류 시스템에 밸브를 연결하기 전에 직접 주사기 및 얇은 캐뉼라를 사용하여, 캐 뉼러 간 접속 s는. <p class="jove_conte...

탈세 포화하고 recellularization 시험관에 1 작용 성, 이식 가능한 장기의 생성을 가능하게 할 수있다. 제거 세포와 항원 물질에 의해 (예., DNA는 알파 - 갈 에피토프)에서 기관은 이하 비 - 면역 세포 외 기질 (ECM)을 얻을 수있다. 이 행렬은 기관의 입체 microanatomy을 보존하고 다른 가능성이 이종 기원의 세포 다시 채우기위한 이상적인 biomatrix로서 역할을 할 수있다. 따라서, 탈세 포화 된 쥐 간 매트릭스는 인간 간 세포 증식을 할 수있다. 이 인간화 마이크로 간 질환 (예., 선천성 대사 질환, 바이러스 성 질환 또는 악성 종양) 또는 전임상 제약 테스트 3에 대한 연구를위한 생체 모델이 될 수 있습니다. 쥐의 간 관류 탈세 포화에 대한 몇 가지 다른 프로토콜은 이미 4-13 발표되었다. 모든 프로토콜에서, decellular화는 유관 간문맥 통해 알칼리 이온 성 또는 비이 온성 세제의 관류에 의해 달성 하였다. 우리가 아는 한, 우리는 문맥 및 / 또는 쥐 간 동맥 (14)를 통해 선택적 관류에 의해 쥐의 간 탈세 포화를보고 첫 번째 그룹이었다. 간에서 서로 다른 혈관 시스템의 선택적 관류 활성화 셀룰러 다시 채우기에 중요한 역할을 할 수 있고, 또한, 더 나은 결과 탈세 포화를 가능하게하고있다. 여기에서 설명 된 연구에서, 간은 진동 압력 조건 하에서 관류있게 주문품 독점 관류 장치로 관류 하였다. 이러한 압력 조건은 간 생리적 호흡기 의존 관류 모방 : 시츄, 간은 호흡 운동시 간 혈류에 직접적인 영향을 다이어프램의 접합부 아래에 건다. 영감은 특히 최적화, 다이어프램의 저하 및 간 압박에 이르게간세포 정맥 유출 반면 만료 간 상승 및 포털 정맥 유입 15을 최적화하기 복강 내 압력의 저하로 연결. 우리의 목표는 진동 압력 조건은 복강 내 조건 생체를 모방하여 쥐의 간 관류 탈세 포화의 동질성에 영향이 있는지 여부를 알아보고자 하였다. 탈세 포화 과정의 균질성 관류 탈세 포화의 과소 평가 요소 일 수있다. 알려진 모든 에이전트는 ECM에 간 탈세 포화 원인 변경에 사용됩니다. 다른 영역이 이미 완전히 탈세 포화되는 반면 저조한 관류 영역의 세포는 ECM 내에 남아있다. 남아있는 세포를 용해, 관류 시간 또는 압력은 잘 관류 부위에 더 많은 변경을 일으키는 상승되어야한다. 따라서, 탈세 포화에 대한 세제는 기관 내에서 균일하게 분산되어야한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">자체 제작 동맥 캐뉼라</td></tr><tr><td>&nbsp; Portex 비멸균 폴리에틸렌 튜빙</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/100</td><td>0.28 mm ID 0.61 mm OD&</td></tr><tr><td>nbsp; Portex 비 멸균 폴리에틸렌 튜브</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/200</td><td>0.58 mm ID 0.96 mm OD</td></tr><tr><td>Venodrop Safe butterfly catheter</td><td>Fresenius Kabi</td><td>3275851</td><td>21 G</td></tr><tr><td colspan = "4 "> 포털 정맥 캐뉼라</td></tr><tr><td>주변 정맥 카테터</td><td>BD</td><td>393224</td><td>BD Venflon Pro 20G</td></tr><tr><td>3 방향 스톱콕</td><td>스미스 의료</td><td>888-101RE</td><td></td></tr><<tr>td colspan = "4">수술</td></tr>용 <tr><td>면 스틱</td><td>Hecht-Assistent</td><td>4302</td><td></td></tr><tr><td>면 패드&nbsp;</td><td>Shaoxing Zhengde 외과 드레싱</td><td>13H118-03</td><td></td></tr><tr><td>거즈 붕대</td><td>후베이 Haige&nbsp; 의료 기기</td><td>14388</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ringer Solution</td><td>Fresenius Kabi</td><td>13 HKP022</td><td>1000 ml</td></tr><tr><td>10 ml 주사기</td><td>브라운</td><td>4606108V</td><td>10 ml/ 루어 솔로</td></tr><tr><td>5 ml 주사기</td><td>브라운</td><td>4606061V</td><td>5 ml /루어 솔로</td></tr><tr><td>봉합사 (실크 6/0)</td><td>Resorba</td><td>H1F</td><td>LOT 105001.81</td></tr><tr><td>의료용 드레이프</td><td>Shaoxing Zhengde 외과 드레싱</td><td>D0613011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">surgical 악기</td></tr><tr><td>바늘 홀더</td><td>Geuder</td><td>17570</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 집게</td><td>Inox-Electronic</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 가위</td><td>Martin</td><td>11-740-11</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 집게</td><td>S& 티&nbsp;</td><td></td><td></td>112314</tr><tr><td>클램프</td><td>Aesculap</td><td>BH111R</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>F S T&nbsp;</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>수술용 겸자</td><td>Aesculap</td><td>BD 557</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">탈세포화</td></tr><tr><td>호흡기</td><td>Resmed</td><td>14.24.11.0004</td><td>SmartAIR ST</td></tr><tr><td>관류 장치</td><td>Charite, 의료 공학 연구소</td><td>맞춤형 장치</td><td>탈세포화 장치</td></tr><tr><td>연동 펌프 ismatec reglo ICC</td><td>IDEX</td><td>ISM4408&nbsp;</td><td>4채널</td></tr><tr><td>하이델베르거 연장 75cm&nbsp;</td><td>Fresenius Kabi</td><td>2873</td><td>75 cm</td></tr><tr><td>MS/CA 펌프세그먼트</td><td>IDEX</td><td>IS 3510&nbsp;</td><td>MS/CA/클릭앤고/POM-C</td></tr><tr><td>CA 2-스토퍼 튜브</td><td>Pharmed</td><td>BPT NSF-51</td><td></td></tr><tr><td>버블 트랩&nbsp;</td><td></td><td>맞춤 제작 아이템</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock 호스 커넥터</td><td>Neolab</td><td>No. 02-1887</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">세제</td></tr><tr><td>SDS 펠릿</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>CN30.4&nbsp;</td><td>2.5kg</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>칼 로스&nbsp;</td><td>3051.1&nbsp;</td><td>10</td></tr>리터<tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>DPBS</td></tr><tr><td colspan="4">staining</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Morphisto</td><td>10177</td><td></td></tr><tr><td>Mayer hematoxylin</td><td>AppliChem</td><td>A4840</td><td></td></tr><tr><td>gomori staining</td><td>Morphisto</td><td>11104</td><td></td></tr><tr><td>AlcainBlue-PAS staining</td><td>Morphisto</td><td>11388</td><td></td></tr><tr><td>Direct Red 80&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>365548</td><td></td></tr></tbody></table>

진동 압 관류 장치에서 쥐 간을의 탈세 포화 절차

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

실질 기관의 탈세포화와 재세포화는 체외에서 기능적 기관의 생성을 가능하게 할 수 있으며, 설치류 간 탈세포화를 위한 여러 프로토콜이 이미 발표되었습니다. 우리는 문맥 및/또는 간 동맥을 통해 선택적 관류를 가능하게 하는 독점적인 관류 장치를 구축하여 탈세포화 과정을 개선하는 것을 목표로 했습니다. 또한, 우리는 탈세포화의 균질성을 개선하기 위해 진동하는 주변 압력 조건에서 관류를 수행하려고 했습니다. 관류 탈세포화의 균질성은 현재까지 과소평가된 요인이었습니다. 탈세포화(decellularization) 과정에서 관류가 잘 되지 않는 기관 내 영역에는 여전히 세포가 포함되어 있을 수 있는 반면, 관류가 잘 되는 영역의 세포외 기질(ECM)은 이미 알칼리성 세제의 영향을 받았을 수 있습니다. 진동 압력 변화는 호흡 중에 발생하는 복강 내 압력 변화를 모방하여 간 내부의 미세 관류를 최적화할 수 있습니다. 여기에 제시된 연구에서 탈세포화된 쥐 간 매트릭스는 조직학적 염색, DNA 함량 분석 및 부식 주조를 통해 분석되었습니다. 간동맥을 통한 관류는 문맥 관류보다 더 균질한 결과를 보여주었습니다. 진동 압력 조건의 적용은 관류 탈세포화의 효과를 향상시켰습니다. 간 동맥을 통해 관류된 간과 진동하는 압력 조건에서 간이 가장 좋은 결과를 보였습니다. 당사의 독점 장치를 사용하여 간 채취, 캐뉼레이션 및 관류를 위해 제시된 기술은 쥐 간에서 탈세포화 및 재세포화 실험을 개선하기 위한 정교한 관류 설정을 가능하게 합니다.

균질성 따라서 다른 탈세 포화 프로토콜의 효과를 육안 관찰, 조직 학적 분석, 탈세 포화 간 매트릭스 내의 나머지 DNA 함량 분석에 의해 평가 하였다. 또한, 부식 주조 탈세 포화 후 간 손상의 microanatomy을 시각화 하였다. Macroscopy 탈세 포화 동안, 간 세포는 콘텐츠의 제거를 나타내는, 루슨트된다. 문맥을 통해 관류 된 간을 탈세 포화 동안 및 (흰색 화살표) 후에 육안 가시 나머지 세포, 불균일 해명 (따라서 탈세 포화)를 보였다. 간동맥을 통해 관류 간은보다 균일 한 탈세 포화 코스와 눈에 보이는 남아있는 세포를 보였다. 간은 진동 압력 조건의 적용을 관류 한 경우, 나머지 세포는 무관 관류 경로 보이지 않았다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig4.jpg" /> <strong...

당사의 독점 장치를 사용하여 간 채취, 삽관 및 관류를 위한 제시된 기술은 쥐 간에서 탈세포화 및 재세포화 실험을 개선하기 위한 정교한 관류 설정을 가능하게 합니다.

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

다음 실험의 전체적인 목표는 쥐 간의 관류 탈세포화 과정에서 균질성을 최적화하는 데 있어 관류 경로의 역할을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 신선하게 분리된 쥐 간의 문맥과 간동맥에 캐뉼라를 삽입함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로, 간을 관류 장치에 연결하여 문맥 또는 간동맥을 선택적으로 관류합니다.다음으로, 호흡 중에 발생하는 복강 내 압력 변화를 모방하기 위해 관류 챔버에 진동 압력 변화를 가합니다. 간 미세 관류를 최적화함으로써, 결과적으로 진동 압력 조건 하에서 간동맥을 통해 관류된 간은 거시적 관찰과 조직학적 및 생화학적 분석을 통해 평가했을 때 더 균질하고 빠른 탈세포화를 나타냅니다. 문맥 관류 탈세포화와 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 진동 압력 조건을 이용한 동맥 관류가 더 균질한 탈세포화 결과를 가져온다는 점입니다.비록 짧은 시간이지만, 이 방법은 감속 기술에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 이는 재태양화 실험, 구강 외 관류 장치 및 장기 모델과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람은 적색 간의 적출 및 동맥 캐뉼라 삽입 과정이 복잡할 수 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.간을 적출하기 전, 말단부 G 20 정맥 카테터 1.5 cm 조각의 끝부분을 사선으로 절단합니다. 카테터를 3방향 스톱콕(three-way stop cock)에 연결하고, 링거액(ringer solution)이 채워진 10 mL 주사기를 사용하여 시스템 내의 공기를 제거합니다. 다음으로, 버터플라이 캐뉼라의 바늘을 5 mm 길이로 절단하고 순간접착제를 사용하여 5 cm 튜브를 바늘에 고정합니다.2 cm 길이의 튜브를 더 큰 튜브 안에 삽입하고, 이 튜브 역시 순간접착제로 고정하십시오. 이 구조물 위에 또 다른 튜브를 씌우고 접착제로 고정하여 어버트먼트(abutment)를 만듭니다. 그런 다음 Ringer 용액을 채운 5 mL 주사기를 사용하여, 간 수확을 위해 새로 제작한 동맥 캐뉼라를 세척하십시오.마취된 성체 쥐의 횡격막 돔 아래에 있는 내측 및 좌측 간엽을 고정하기 위해 젖은 거즈 붕대를 사용하여 시작합니다. 이때 간십십인대와 상부 간엽도 함께 노출시킵니다. 다음으로, 두 개의 미세 포셉과 스프링 가위를 사용하여 상부 대망엽에 부착된 인대를 해당 엽이 움직일 수 있을 때까지 조심스럽게 박리합니다.그런 다음 내측엽과 좌엽을 제자리에 고정합니다. 젖은 면봉을 사용하여 엽을 GRE 압박 장치 아래로 옮기고 위를 동물의 왼쪽으로 이동시킵니다. 클램프로 위를 고정하고 소망을 절개합니다.그런 다음 하엽 또는 턱 간엽이 움직일 수 있을 때까지 박리하고, 백하우스 클램프(backhouse clamp)를 사용하여 십이지장을 고정하면서 해당 엽을 강 내로 밀어 넣은 뒤, 십이지장을 왼쪽으로 이동시켜 간십이지장 인대를 노출시킵니다. 총담관 주위를 둘러쌉니다. 그 후 지방 및 췌장 조직으로부터 담관을 박리하고, 담관 분지점에서 1.5 centimeters 떨어진 지점에서 담관을 절단합니다.주변 지방 조직으로부터 sal 정맥을 박리하여 위십이지장 정맥을 노출시킵니다. 그 다음 6-0 봉합사로 위십이지장 정맥을 두 번 결찰하고, 두 매듭 사이의 정맥을 절단합니다. 모든 동맥 분지가 드러날 때까지 주변 조직으로부터 복강동맥과 총간동맥을 박리합니다.모든 동맥의 박리가 완료되면, 우측 신장과 간의 우측 외측 엽 사이의 하대정맥을 둘러싸고 후복막 공간에서 정맥을 박리하십시오. 복강동맥을 따라가며 대동맥을 노출시킵니다. 그런 다음 후복막 지방 조직을 박리하고 복강동맥 상단에서 대동맥을 둘러쌉니다.이제 1mL의 식염수에 희석된 1000 units의 heparin을 하대정맥(inferior vena cava)에 주입하십시오. 절개 부위를 면솜으로 덮고 heparin이 효과를 나타낼 때까지 1~2분 동안 기다립니다. 그 다음 포셉으로 대동맥을 둘러싸고, 신장에서 원위 방향으로 대동맥과 하대정맥을 박리하십시오.간문맥 캐뉼라를 삽입하려면, 원위부 간문맥에 물고기 입 모양의 절개를 가하고 포셉으로 절개 부위를 엽니다. 그 다음 간문맥에 캐뉼라를 삽입하고 간의 색이 빠질 때까지 20 milliliters의 링거액으로 간을 세척합니다. silk 6/0 결찰사를 사용하여 캐뉼라를 고정합니다. 동맥 캐뉼라를 삽입하려면, 대동맥 분절을 후복막 공간에서 분리할 수 있을 때까지 복강동맥 상단의 대동맥을 박리합니다.대동맥 분절을 세로 방향으로 절개하여 대동맥 패치를 만들고, 자체 제작한 캐뉼라를 고정 홀더에 삽입합니다. 그런 다음 포셉 두 개를 사용하여 대동맥 패치를 캐뉼라 위로 미끄러뜨려 씌우고, 캐뉼라 위에서 실크 6-0 봉합사로 간동맥을 결찰합니다. 탈세포화를 수행하기 위해 접합부에서 패치를 고정합니다. 간문맥 캐뉼라의 3방향 스톱콕을 관련 반응기 액세스에 연결하고, 시스템에 공기가 유입되지 않도록 주의하며 동맥 캐뉼라를 동맥 액세스에 연결합니다.다음으로, 호흡기를 압력 분배 챔버에 연결하고 챔버를 반응기에 연결합니다. 압력 가압을 시작합니다. 그 후 탈세포화를 시작합니다.1% Triton X 100을 분당 5 mL의 속도로 간에 관류합니다. 관류 챔버 내부의 액체 수준이 관류되는 간 상단에서 일정하게 유지되도록 관류 장치의 유출구를 통해 폐액이 배출되게 합니다. 90분 후, 세제를 1% SDS로 교체합니다. 문맥을 통해 관류된 간은 균질한 투명도를 보이며, 이는 탈세포화를 나타내지만 과정 중 및 후에 육안으로 보이는 잔여 세포가 관찰됩니다. 반면, 간동맥을 통해 관류된 간은 잔여 세포가 더 적고 더 균질한 탈세포화 과정을 보입니다.진동 압력 조건을 적용하여 간을 관류시킨 경우, 잔존 세포가 관찰되지 않았습니다. 이는 관류 방식과 관계없이 동일했습니다. 탈세포화된 간 매트릭스의 조직학적 평가 결과, 실제로 간동맥을 통해 관류된 간에서 거시적 소견이 뒷받침되었습니다.진동 압력 조건하에서 관류되었는지 여부와 상관없이 잔존 세포가 관찰되지 않았습니다. 그러나 문맥을 통해 관류된 간의 경우 진동 압력 조건하에서 관류되었더라도 잔존 세포 구역이 나타났으며, 다만 이러한 조건이 해당 간의 잔존 세포 질량을 감소시켰습니다. 탈세포화 조건에 관계없이 간의 세포외 기질이 보존되었음에 유의하십시오. 간 기질의 건조 중량당 DNA 함량 또한 모든 실험군에서 천연 간에 비해 감소하였습니다. 이러한 차이는 진동 압력 조건하에서 관류된 군에서만 통계적으로 유의미하였습니다.또한, 탈세포화된 간 매트릭스의 부식 주조(corrosion casting)를 통해 관류 과정 동안 간의 미세 해부학적 구조가 보존되었음을 확인하였습니다. 이 영상을 시청한 후, 재현 가능하고 균일한 탈세포화를 위해 붉은 간을 채취하고 캐뉼라를 삽입하여 관류하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. Triton X 100 및 SDS를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행할 때는 장갑 착용과 같은 주의 사항을 반드시 준수해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

재관류의 decellularization는 기관의 세포외 기질 구성과 마이크로 아키텍처를 유지 전체 간 공사장 공중 발판을 생산하는 새로운 기술입니다. 여기에, hepatocytes과 재관류의 decellularization 이후 repopulation를 사용하여 전체 오르간 공사장 공중 발판을 준비하는 방법이 설명되어 있습니다. 기능 및 transplantable 간 이식이 기술을 사용하여 생성할 수 있습니다.

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Subnormothermic의 기술<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 간 스토리지, 평가를위한 관류 및 한계 간 이식의 수리

상당한 간 기증자 부족 이며 간 기증자에 대 한 기준을 확대 했습니다. Normothermic ex vivo 간 관류 (NEVLP)를 평가 하 고 장기의 기능을 수정 개발 되었습니다. 이 연구 NEVLP의 쥐 모델을 보여 줍니다 고 간 보존 부상 완화 pegylated catalase의 능력을 테스트 합니다.

Ex Vivo Normothermic 간 관류의 작은 동물 모델

우리 더 vivo에서 부분 간 미래에 엔지니어링을 공부에 대 한 전제 조건으로 쥐에서 vivo에서 단일 간 엽 관류 모델에 대 한 새로운 수술 기법을 설정 합니다.

Vivo에서 부분 간 엔지니어링을에서 위한 쥐를 기초로 새로운 수술 기법

이 프로토콜은 특수 정맥 내 카테터, 표준화 된 멸균 일회용 튜브, 실시간 모니터링으로 보완 된 온도 제어 및 분리 된 일차 쥐 간세포의 생존력, 수율 및 기능의 일관성을 향상시키기 위해 두 단계 콜라게나제 관류 절차를위한 경보 시스템의 사용을 자세히 설명합니다.

다중 파라미터 관류 조절을 통한 원발성 쥐 간세포의 분리

이 프로토콜은 맞춤형 관류 생물 반응기에서 플랩 혈관 구조를 통해 나트륨 도데 실 설페이트 세제의 관류에 의한 혈관 화 된 돼지 플랩의 외과 적 조달 및 후속 탈세포화를 설명합니다.

맞춤형 관류 생물 반응기에서 돼지 혈관 플랩의 조달 및 관류-탈세포화

우리는 복합 쥐 뒷다리에 대한 수술 기술과 탈세포화 과정을 설명합니다. 탈세포화는 생체 외 기계 관류 시스템을 통해 저농도 도데실 황산나트륨을 사용하여 수행됩니다.

혈관화된 복합 동종 이식을 위한 생체 내 관류 기반 생물반응기를 사용한 쥐 뒷다리의 조달 및 탈세포화

정상 체온 생체 외 간 관류(NEVLP) 시스템이 마우스 간을 위해 만들어졌습니다. 이 시스템은 미세 수술에 대한 경험이 필요하지만 재현 가능한 관류 결과를 허용합니다. 마우스 간을 활용하는 능력은 새로운 관류액 첨가제를 식별하기 위한 분자 경로의 조사를 용이하게 하고 장기 복구에 중점을 둔 실험의 실행을 가능하게 합니다.

마우스의 Normothermic Ex Vivo 간 기계 관류

이 프로토콜은 쥐 모델에서 최적화된 2단계 콜라겐분해효소 간 관류 기술을 제시하고 3D 오가노이드의 시험관 장기 배양을 위해 분리된 간세포의 사용을 보여줍니다.

쥐의 간 관류 및 일차 간세포 분리: 최첨단 3D 오가노이드 배양에 중요한 오래된 절차

배우세요 쥐 간의 동맥 관류를 통한 균일한 탈세포화 기법을 진동 압력 조건에서. 이 방법은 재생의학 연구에서 조직 공학 및 장기 이식을 위한 스캐폴드 제작에 활용됩니다.

진동 압 관류 장치에서 쥐 간을의 탈세 포화 절차

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