November 23rd, 2015
이 프로토콜은 미세유체 소자를 사용하여 자동화된 소량(0.15–1.5ml) 입자 분리를 수행하기 위한 시스템 아키텍처를 설명하고 음향 유체 소자 성능 및 작동을 최적화하는 방법에 대해 설명합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 미세유체 광자 장치를 사용하여 자동화된 소량 입자 분리를 수행하는 것입니다. 이 방법은 바이오 검출 및 임상 연구 응용 분야를 위한 샘플의 강력한 처리 및 분리를 포함하여 생물 의학 공학 분야의 주요 절차를 가능하게 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모듈성, 정밀도, 견고성 및 자동화로 인해 잔류 분리뿐만 아니라 미세유체 분리 장치를 통한 다양한 흐름에 적응할 수 있고 유연합니다.
우리는 먼저 분석물의 상당한 희석이나 손실 없이 밀리미터 미만의 생물학적 시료에 대해 일상적이고 신뢰할 수 있는 분리를 실행할 수 있는 이 기능의 필요성을 인식했습니다. 시료 계량 및 소스에서 수집 파일까지의 자동 라우팅을 표준 주사기 펌프 작업과 함께 통합하는 것은 이 규모에서 성공적으로 작동하는 데 매우 중요합니다. 먼저 음향 retic 장치와 두 개의 포토 마스크에 대한 레이아웃을 함께 제공되는 텍스트 프로토콜의 섹션 1에 설명된 대로 설계합니다.
그런 다음 후면 유체 포트를 양면 연마 된 1 0 0 실리콘 웨이퍼에 패턴화합니다. 표준 포지티브 레지스트 포토리소그래피를 사용하여 350-400마이크로미터 깊이까지 딥 반응성 이온 에칭을 사용하여 이 형상을 에칭합니다. 다음으로, 웨이퍼를 뒤집어 전면 유체 채널 형상을 패턴화합니다.
다시 말하지만, 표준 포지티브 레지스트 포토리소그래피를 사용하여 패터닝된 웨이퍼를 두 번째 블랭크 실리콘 캐리어 웨이퍼에 장착합니다. 이제 포토 레지스트를 사용하여 노출 된 채널을 200 마이크로 미터 깊이로 에칭합니다. 딥 리액션 이온 에칭을 사용하여 장치 웨이퍼를 레지스트 스트리핑 용액에 담궈 블랭크 실리콘 웨이퍼에서 분리합니다.
다음으로, 피라냐 용액을 사용하여 장치 웨이퍼와 특징이 없는 0.5mm 두께의 보로 실리케이트 유리 웨이퍼를 청소합니다. 일단 유체 채널을 완전히 밀봉하고 여기에 표시된 조건을 사용하여 유리와 실리콘 웨이퍼를 이온 적으로 결합합니다. 마지막으로, 2액형 저점도 에폭시 키트의 다이싱 톱에 있는 다이아몬드 블레이드로 개별 칩을 절단합니다.
두 구성 요소의 권장 비율을 측정하고 철저히 혼합하십시오. 그런 다음 리드 Zirkin eight titanate 또는 PCT 피에조 세라믹을 적절한 지그에 놓고 피펫을 사용하여 약 10마이크로리터의 에폭시 혼합물을 고르게 펴서 얇고 균일한 층을 만듭니다. 다음으로, 칩을 지그에 넣고 pizo 세라믹의 에폭시 면을 미세유체 칩과 정렬합니다.
정렬하는 동안 칩을 제자리에 고정하기 위해 테이프로 칩을 고정해야 할 수도 있습니다. Clamp 구성 요소가 깨지지 않도록 주의하고 에폭시 제조업체에서 권장하는 온도와 지속 시간을 경화하도록 주의하면서 어셈블리를 바이스에 넣습니다. 에폭시가 경화된 후 가는 팁 납땜 인두를 사용하여 미세 게이지 와이어 리드를 pizo 세라믹의 각 측면에 부착합니다.
필요한 경우 적절한 플럭스를 사용하여 pizo 표면을 준비하십시오. 열적으로 탈분극되지 않도록 pizo와 가능한 한 짧게 접촉하도록 주의하십시오. CL을 사용하여 칩을 유체 브레드보드에 부착합니다.amp고정 장치.
또한 냉각 팬을 브레드보드에 연결하여 음향 실험 중에 온도를 조절합니다. 다음으로, 칩을 세계 커넥터에 나사로 고정합니다. 브레드보드를 현미경 스테이지에 장착하고 전 세계와 함께 입구와 출구의 추가 튜브에 대한 커넥터를 칩으로 만들 수 있습니다.
표준 쿼터 28 스레드 유니온 사용. 16인치 튜빙 1개의 경우, 여기에 표시되고 함께 제공되는 텍스트 프로토콜의 그림 4에 설명된 대로 미세유체 칩을 주사기 펌프, 컴퓨터 제어 멀티포트 선택 밸브, PC 인터페이스 유량계 및 튜빙에 연결합니다. 분리를 실행하기 전에 세척 시약 저장소를 채우고 해당 유체 라인을 프라이밍합니다.
또한 칩 배출구에 밸브 3과 4를 설정하여 초기에 폐기물 저장소로 흐르도록 합니다. 그런 다음 냉각 팬을 켭니다. pizo 세라믹 리드를 전원에 연결 ampliifier를 사용하고 사용 중인 어쿠스틱 칩의 공진 주파수에서 함수 발생기를 설정합니다.
RF 증폭기가 원하는 분리에 적절하게 12볼트와 25볼트 사이의 피크 투 피크를 출력하도록 함수 발생기의 전압 설정점을 조정합니다. 그런 다음 적절한 수집 바이알과 버퍼 입력 바이알을 시스템에 연결합니다. 분리할 세포 또는 입자에 적합하거나 분리 후 사용할 분석 분석의 필요에 따라 샘플 버퍼를 사용합니다.
다음으로, 제어 소프트웨어를 로드하고 이를 사용하여 밸브, 유량 센서 및 펌프를 제어하여 완전 자동 프라임 및 분리 루틴을 수행합니다. 분리 절차를 시작하기 직전에 샘플 바이알을 잠시 와류로 처리하여 침전되었을 수 있는 입자를 다시 부유시킵니다. 또는 샘플을 위아래로 10회 피펫팅하여 와류에 의해 손상되거나 뭉치기 쉬운 생물학적 샘플을 혼합합니다.
그런 다음 샘플 바이알을 입력 라인에 부착하고 지체 없이 프라임 및 분리 루틴을 시작합니다. 먼저 소프트웨어를 사용하여 밸브 1과 2의 공기 흡입구를 프라이밍하여 튜브에 유체가 없는지 확인합니다. 동시에 튜빙을 프라이밍하여 버퍼 입력 바이알을 밸브 2에 연결하고 샘플 입력 바이알을 밸브 1에 연결합니다.
주사기 펌프가 두 바이알에서 약 15마이크로리터를 빼내어 튜브를 완전히 채우고 밸브에 연결하도록 합니다. 마지막으로, 밸브 1과 2를 낭비로 전환하여 로딩 코일에 들어간 과도한 유체 또는 공기를 배출합니다. 다음으로, 먼저 분당 50마이크로리터의 속도로 25마이크로리터의 공기를 회수하여 샘플 코일을 로드하도록 프로그램을 설정합니다.
그런 다음 분당 200마이크로리터의 속도로 250마이크로리터의 샘플을 로드한 다음, 분당 200마이크로리터의 속도로 35마이크로리터의 선행 버퍼를 로드하고, 마지막으로 분당 50마이크로리터의 속도로 또 다른 25마이크로리터의 공기를 로드합니다. 그런 다음 적재된 유체 플러그를 분당 100마이크로리터로 주입하도록 주사기 펌프를 설정하고 유량 센서를 사용하여 크고 작은 입자 배출구의 유량을 모니터링합니다. 적절한 유속비는 수반되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 결정될 수 있습니다.
유량 센서가 첫 번째 에어 갭의 통과를 나타내는 유속의 급증을 감지하면 해당 출력 밸브를 폐기물 바이알에서 샘플 수집 바이알로 전환합니다. 샘플이 칩을 통과하고 유량 센서 판독값을 관찰하여 분리될 때 흐름이 안정적인지 확인합니다. 샘플이 칩을 통과할 때 분리된 분획은 출구 밸브에서 수집됩니다.
샘플 플러그의 끝에서 유량 센서를 관찰하고 두 번째 에어 갭을 감지합니다. 이 시점에서 출력 밸브를 다시 waste로 전환하십시오. 전체 부피가 분주된 후 주사기 펌프 주입을 중지하고 자동화 루틴을 종료합니다.
분리 실험이 완료된 후 소형 및 대형 입자 시료 수집 바이알을 분리하고 후속 분석을 위해 적절하게 보관합니다. 빈 바이알에 샘플 픽업 튜브를 고정하여 튜브를 통해 플러시될 여분의 세척 용액을 수집합니다. 그런 다음 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 자동화된 시스템 청소 루틴을 시작합니다.
이 과정에서 프로그램은 밸브와 주사기 펌프를 제어하여 유지 코일에 세척 시약을 순차적으로 로드하고 시스템을 통해 플러시합니다. 자동화된 세척 및 오염 제거 프로세스가 완료되면 생물학적 또는 화학적 폐기물 처리를 위한 적절한 절차에 따라 과도한 세척 용액과 수집된 바이알을 폐기하십시오. 여기에 표시된 것은 잘 결합된 pizo 및 microfluidic 장치의 대표적인 주파수 스캔입니다.
pizo와 microfluidic 장치 사이의 결합이 양호하면 입자가 공진 주파수에 단단히 초점을 맞추어 형광 강도의 명확한 피크를 생성하고 예상되는 초점 위치로 이동합니다. 대조적으로, 커플링이 불량한 곳에서는 입자가 잘 초점을 맞추지 못하며 필요한 응용 분야에 고품질 초점 또는 빠른 흐름이 중요한 경우 장치가 적합하지 않습니다. 이 그래프의 각 선은 다양한 폴리스티렌 입자 크기와 pizo 구동 전압을 사용한 분리 결과를 나타냅니다.
일반적으로 더 작은 입자를 추출하려면 더 높은 전압이 필요합니다. 그러나 건조 전압은 더 큰 열 방출과 음향 스트리밍의 증가 효과로 인해 무한정 증가할 수 없습니다. 생물학적 입자 분리를 위한 이 플랫폼의 유용성을 입증하기 위해 평균 직경이 8-10마이크로미터인 인간 라지 세포에 약 50나노미터 직경의 뎅기열 바이러스를 스파이크한 다음 음향 미세유체 장치를 사용하여 분리했습니다.
이와 같은 시스템이 조립되고 프로그래밍되면 약 5분 안에 일상적으로 분리를 수행할 수 있습니다. 시간당 약 3개의 시료를 시료 사이의 완전한 세척 및 오염 제거로 처리할 수 있습니다. 이 절차에 따라 세포 계수, 웨스턴 블로팅 또는 차세대 염기서열분석과 같은 다른 방법을 수행하여 분리의 순도를 확인하고 생물학적 중요성을 밝힐 수 있습니다.
이 비디오를 시청한 후에는 일반적인 미세유체 분리 장치를 제조하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. world to chip 연결을 사용하여 하드웨어와 인터페이스하고 정확하고 견고한 방식으로 자동화된 분리 절차를 실행할 수 있습니다. 감염성 물질을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으며 생물학적 안전을 위해 제도적으로 규정된 적절한 장비 및 절차를 사용하여 적절하게 훈련된 직원만 수행해야 한다는 점을 잊지 마십시오.
이 프로토콜은 미세 유체 장치를 사용한 소량 입자 분리의 자동화된 시스템 아키텍처를 설명합니다. 이는 음향 유체 장치의 성능 및 작동을 향상시키는 방법에 중점을 둡니다.
This microfluidic platform enables precise, automated processing of small-volume biological samples (0.15–1.5 mL), reducing reagent waste and preserving precious analytes in early discovery workflows. By integrating modular device design with closed-loop fluid handling, it supports robust, reproducible particle separation—critical for target validation and assay development where sample integrity directly impacts data quality. The system’s adaptability to various microfluidic devices, including acoustofluidic chips, allows seamless integration into discovery pipelines requiring high-confidence, low-input separations for mechanistic de-risking and lead identification.
The platform integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical studies, particularly where low-volume, high-purity particle separation is required for downstream analysis.