미세 유체 정밀 작은 볼륨 샘플 처리를위한 플랫폼 및 음향 마이크로 디바이스로 구분 생물 입자 크기의 사용

이 절차의 전반적인 목표는 미세유체 광학 장치를 사용하여 소량의 입자 분리를 자동화하여 수행하는 것입니다. 이 방법은 바이오 검출 및 임상 연구 응용 분야를 위한 샘플의 강건한 처리 및 분리를 포함하여, 생명공학 분야의 핵심 절차들을 가능하게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 모듈성, 정밀성, 강건성 및 자동화이며, 이를 통해 망상 분리뿐만 아니라 다양한 유동 미세유체 분리 장치에 적응 가능하고 유연하게 적용할 수 있습니다.

저희는 먼저 분석물의 상당한 희석이나 손실 없이 서브 밀리미터 수준의 생물학적 시료 부피로 일상적이고 신뢰성 있게 분리를 수행할 수 있는 기능의 필요성을 인식했습니다. 시료 계량 및 소스에서 수집 파일까지의 자동 라우팅을 표준 시린지 펌프 작동과 통합하는 것은 이 규모에서 성공적으로 작업하기 위해 매우 중요합니다. 설계를 시작하려면 동반된 텍스트 프로토콜의 섹션 1에 설명된 대로 음향 레티큘레이션 장치와 두 개의 포토마스크 레이아웃을 설계하십시오.

그다음, 양면 연마된 1 0 0 실리콘 웨이퍼 위에 후면 유체 포트를 패턴합니다. 표준 양성 레지스트 포토리소그래피를 사용하여, 심반응성 이온 식각(deep reactive ion etching)으로 이 기하학적 구조를 350 to 400 micrometers 깊이로 식각합니다. 이어서, 웨이퍼를 뒤집어 전면 유체 채널 기하학적 구조를 패턴합니다.

표준 포지티브 레지스트 포토리소그래피를 다시 사용하여 패턴이 형성된 웨이퍼를 두 번째 블랭크 실리콘 캐리어 웨이퍼에 부착합니다. 이제 포토레지스트를 사용하여 노출된 채널을 200 micrometers 깊이로 식각합니다. 딥 리액티브 이온 식각을 수행한 후, 디바이스 웨이퍼를 레지스트 제거액에 담가 블랭크 실리콘 웨이퍼로부터 분리합니다.

다음으로, 피라냐 용액을 사용하여 디바이스 웨이퍼와 특징이 없는 0.5 millimeter 두께의 붕규산 유리 웨이퍼를 세척합니다. 세척이 완료되면 여기에 표시된 조건을 사용하여 유리와 실리콘 웨이퍼를 이온 결합시켜 유체 채널을 밀봉합니다. 마지막으로, 다이싱 쏘의 다이아몬드 블레이드를 사용하여 2성분 저점도 에폭시 키트로 제작된 개별 칩들을 절단합니다.

두 성분을 권장 비율로 정밀하게 측정하여 충분히 혼합합니다. 그런 다음 lead Zirkin eight titanate 또는 PCT piezo ceramic을 적절한 지그에 배치하고, 피펫을 사용하여 에폭시 혼합물 약 10 µL를 그 위에 고르게 도포하여 얇고 균일한 층을 형성합니다. 다음으로, 칩을 지그에 넣고 piezo ceramic의 에폭시 도포면을 미세유체 칩과 정렬시킵니다.

정렬하는 동안 칩이 움직이지 않도록 테이프로 고정해야 할 수도 있습니다. 부품이 파손되지 않도록 주의하며 바이스로 어셈블리를 고정한 후, 에폭시 제조사에서 권장하는 온도와 시간 동안 경화시키십시오. 에폭시가 경화되면, 팁이 가는 인두기를 사용하여 피조 세라믹의 각 측면에 가는 게이지의 와이어 리드를 부착하십시오.

필요한 경우, 적절한 플럭스를 사용하여 피조 표면을 처리하십시오. 열적으로 인한 탈분극을 방지하기 위해 피조와의 접촉 시간을 최대한 짧게 유지하십시오. 클램핑 고정 장치를 사용하여 칩을 유체 브레드보드에 부착하십시오.

또한, 음향 실험 중 온도를 조절하기 위해 브레드보드에 냉각 팬을 부착하십시오. 다음으로, 칩을 월 커넥터(world connectors)에 나사로 고정합니다. 브레드보드를 현미경 스테이지 위에 장착하고, 월-칩 커넥터를 입구와 출구의 추가 튜빙에 연결하십시오.

표준 1/4-28 나사산 유니온을 사용합니다. 1/16인치 튜빙을 사용하여, 여기에서 보여지는 바와 같이 그리고 동봉된 텍스트 프로토콜의 그림 4에 설명된 대로 미세유체 칩을 시린지 펌프, 컴퓨터 제어 다포트 선택 밸브, PC 인터페이스 유량계 및 튜빙에 연결합니다. 분리를 실행하기 전에 세척 시약 저장조를 채우고 해당 유체 라인을 프라이밍합니다.

또한 칩 배출구의 3번 및 4번 밸브를 처음에 폐액 저장조로 흐르도록 설정하십시오. 다음으로 냉각 팬을 켭니다. 피조 세라믹 리드를 전력 증폭기에 연결하고, 사용 중인 음향 칩의 공진 주파수에 맞춰 함수 발생기를 설정하십시오.

원하는 분리 조건에 맞게 RF 증폭기의 출력이 12~25 Vpp(peak to peak)가 되도록 함수 발생기의 전압 설정값을 조정하십시오. 그런 다음 적절한 수집 바이알과 버퍼 입력 바이알을 시스템에 연결하십시오. 분리할 세포 또는 입자에 적합한 샘플 버퍼를 사용하거나, 분리 후 수행할 분석 분석법에서 요구하는 버퍼를 사용하십시오.

다음으로, 제어 소프트웨어를 로드하고 이를 사용하여 밸브, 유량 센서 및 펌프를 제어함으로써 완전 자동 프라이밍 및 분리 루틴을 수행합니다. 분리 절차를 시작하기 직전에, 샘플 바이알을 짧게 볼텍싱하여 침전되었을 수 있는 입자들을 재부유시키십시오. 또는 볼텍싱에 의해 손상되거나 응집되기 쉬운 생물학적 샘플의 경우, 피펫으로 샘플을 10회 정도 위아래로 섞어줍니다.

그 다음 샘플 바이알을 입력 라인에 연결하고 지체 없이 프라이밍(prime) 및 분리 루틴을 시작하십시오. 먼저 소프트웨어를 사용하여 밸브 1과 2의 공기 흡입구를 프라이밍하여 튜빙 내에 액체가 없는지 확인합니다. 동시에 완충액 입력 바이알에서 밸브 2로 연결되는 튜빙과 샘플 입력 바이알에서 밸브 1로 연결되는 튜빙을 프라이밍하십시오.

시린지 펌프를 사용하여 두 바이알에서 약 15 µL를 흡입하여 밸브에 연결된 튜빙을 완전히 채웁니다. 마지막으로, 밸브 1과 2를 waste 쪽으로 전환하여 로딩 코일에 유입된 과잉 액체나 공기를 배출합니다. 다음으로, 분당 50 µL의 속도로 공기 25 µL를 먼저 흡입하여 샘플 코일을 로드하는 프로그램을 설정합니다.

그 다음, 200 µL/min의 속도로 시료 250 µL를 로딩하고, 이어서 200 µL/min의 속도로 리딩 버퍼 35 µL를, 마지막으로 50 µL/min의 속도로 공기 250 µL를 추가로 로딩합니다. 그런 다음 시린지 펌프를 설정하여 로딩된 유체 플러그를 100 µL/min의 속도로 주입하고, 유량 센서를 사용하여 소입자 및 대입자 배출구의 유량을 모니터링합니다. 적절한 유량비는 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 결정할 수 있습니다.

유량 센서가 첫 번째 공극(air gap)의 통과를 나타내는 유량 급증을 감지하면, 해당 출력 밸브를 폐액 바이알에서 시료 수집 바이알로 전환하십시오. 유량 센서 측정값을 관찰하여 시료가 칩을 통과하고 분리되는 동안 유량이 안정적인지 확인하십시오. 시료가 칩을 통과함에 따라 분리된 분획들이 배출 밸브에서 수집됩니다.

샘플 플러그의 끝부분에서 유량 센서를 관찰하여 두 번째 공기 갭을 감지하십시오. 이 시점에서 출력 밸브를 다시 폐액 쪽으로 전환하십시오. 전체 부피가 분주되면 시린지 펌프 주입을 중단하고 자동화 루틴을 종료하십시오.

분리 실험이 완료되면 소입자 및 대입자 시료 수집 바이알의 연결을 해제하고, 이후 분석을 위해 적절하게 보관하십시오. 튜브를 통해 흘러나오는 과잉 세척액을 수집할 수 있도록 빈 바이알에 시료 픽업 튜브를 고정하십시오. 그런 다음 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 자동 시스템 세척 루틴을 시작하십시오.

이 과정 동안 프로그램이 밸브와 시린지 펌프를 제어하여 세척 시약을 홀딩 코일에 순차적으로 로드하고 시스템 전체로 플러싱합니다. 자동 세척 및 오염 제거 프로세스가 완료되면, 생물학적 또는 화학적 폐기물 처리의 적절한 절차에 따라 과잉 플러싱 용액과 이를 수집한 바이알을 폐기하십시오. 여기에는 잘 결합된 pizo 및 미세유체 장치의 대표적인 주파수 스캔 결과가 표시되어 있습니다.

피에조(pizo)와 미세유체 장치 간의 결합이 양호하면 공진 주파수에서 입자들이 밀집되어 집중되며, 그 결과 형광 강도에서 뚜렷한 피크가 나타나고 예상된 집중 위치로 이동합니다. 반면 결합이 불량한 경우 입자들이 제대로 집중되지 않으며, 고품질의 집중이나 빠른 유속이 필수적인 응용 분야에 해당 장치를 사용하기에는 부적합합니다. 이 그래프의 각 선은 다양한 크기의 폴리스티렌 입자와 피에조 구동 전압을 사용하여 얻은 분리 결과를 나타냅니다.

일반적으로 더 작은 입자를 추출하기 위해서는 더 높은 전압이 필요합니다. 그러나 건식 전압은 열 방산이 심해지고 음향 스트리밍 효과가 증가하기 때문에 무한히 높일 수 없습니다. 생물학적 입자 분리에 대한 이 플랫폼의 유용성을 입증하기 위해, 평균 직경 8~10 µm의 인간 raji 세포에 직경 약 50 nm의 뎅기 바이러스를 혼합한 후 음향 미세유체 장치를 사용하여 분리하였습니다.

이와 같은 시스템을 조립하고 프로그래밍하면, 약 5분 만에 일상적인 분리를 수행할 수 있습니다. 샘플 간의 완전한 세척 및 오염 제거 과정을 포함하여 시간당 약 3개의 샘플을 처리할 수 있습니다. 이 절차 이후에 세포 계수, western blotting 또는 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing)과 같은 다른 방법들을 수행하여 분리된 샘플의 순도를 확인하고 생물학적 의미를 규명할 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면 전형적인 미세유체 분리 장치를 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 월드-투-칩(world to chip) 연결부를 사용하여 하드웨어와 인터페이스하고, 정밀하고 견고한 방식으로 자동화된 분리 절차를 수행하십시오. 감염성 물질을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으며, 반드시 적절한 교육을 받은 인원이 기관에서 규정한 생물학적 안전 장비 및 절차를 사용하여 수행해야 함을 잊지 마십시오.