입자의 공간 추적을위한 멀티 플렉스 전자 감지와 미세 유체 플랫폼

이 절차의 전반적인 목표는 저항성 펄스 센싱과 코드 분할 다중 접속을 결합하여 여러 미세유체 채널 내 입자의 검출 및 크기 측정을 다중화하는 미세유체 플랫폼을 시연하는 것입니다. 마이크로플루이딕 CODES라고 명명된 이 기술은 자원이 제한된 환경에서 생물학적 시료의 현장 진단 검사에 적합하고 완전히 통합된 진정한 휴대용 랩온어칩 장치를 구현하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 미세유체 칩 상에서 입자의 공간적, 시간적 조작을 전자적으로 추적할 수 있어 현미경과 같은 외부 장비가 필요 없다는 점입니다.

본 기술은 소프트 리소그래피와 호환되며, 입자를 분획하여 쿨터 카운터(Coulter counter)와 유사한 직접적인 전자 판독값을 제공하는 미세광학 장치에 쉽게 통합될 수 있습니다. 미세유체 장치 제작을 시작하려면 4세트의 7비트 골드 코드(gold codes)를 생성하십시오. 그런 다음 AutoCAD와 같은 컴퓨터 보조 설계(CAD) 소프트웨어를 사용하여 해당 골드 코드를 기반으로 4가지 고유한 전극 레이아웃을 설계하십시오.

마지막으로, 설계된 전극 레이아웃이 적용된 포토마스크를 포토마스크 공급업체를 통해 제작합니다. 다음으로, 4인치 붕규산 유리 웨이퍼를 120 °C의 5:1 피라냐 용액에 20분 동안 담급니다. 세척 후, 웨이퍼를 핫플레이트에서 200 °C로 20분 동안 가열하여 잔류 수분을 증발시킵니다.

깨끗하고 건조한 웨이퍼를 스핀 코터에 놓습니다. 2 milliliters의 음성 포토레지스트 용액을 웨이퍼에 도포하고 3000 revolutions per minute의 속도로 40 seconds 동안 스핀 코팅합니다. 스핀 코팅된 웨이퍼를 150 degrees Celsius의 핫플레이트에서 1분 동안 건조합니다.

원하는 전극 패턴의 크롬 마스크로 웨이퍼를 덮습니다. 마스킹된 포토레지스트 표면에 365 nm UV 광선을 조사하여 225 mJ/cm²의 에너지를 전달합니다. 노광된 포토레지스트를 핫플레이트에서 100 °C로 1분 동안 베이크합니다.

웨이퍼를 포토레지스트 현상액에 15초 동안 담근 후, 패턴 웨이퍼를 초순수로 가볍게 세척하고 질소 가스 흐름 하에서 건조합니다. 다음으로, 패턴 처리된 웨이퍼를 전자빔 금속 증착기에 넣습니다. 초당 1 Å의 속도로 웨이퍼 위에 20 nm 두께의 크롬 층과 80 nm 두께의 금 층을 증착합니다.

그 다음, 금속이 코팅된 웨이퍼를 아세톤에 넣고 40 kHz, 100% 진폭에서 30분 동안 초음파 가열하여 하부의 포토레지스트를 식각합니다. 다이싱 소(dicing saw)를 사용하여 웨이퍼를 필요한 크기로 작게 절단합니다. 미세 유체 채널 몰드 제작을 시작하려면, 앞서 설명한 붕규산 유리 웨이퍼와 동일한 방식으로 4인치 실리콘 웨이퍼를 세척하고 건조합니다.

실리콘 웨이퍼를 스핀 코터에 넣고 4 mL의 음성 포토레지스트 용액을 도포합니다. 웨이퍼를 500 rpm에서 15초 동안, 이어서 1,000 rpm에서 15초 동안, 마지막으로 3,000 rpm에서 60초 동안 스핀 코팅합니다. 웨이퍼의 뒷면과 가장자리에 남아 있는 포토레지스트를 제거하기 위해 아세톤을 적신 클린룸 와이퍼 위에 웨이퍼의 윗면이 위를 향하도록 놓습니다.

웨이퍼를 65 °C에서 1분 동안 굽고, 이어서 95 °C에서 2분 동안 굽습니다. 건조된 웨이퍼 위에 미세유체 채널을 위한 크롬 마스크 패턴을 올립니다. 포토레지스트를 365 nm UV 광원에 180 mJ/cm²로 노광한 후, 웨이퍼를 다시 65 °C에서 1분, 95 °C에서 2분 동안 각각 굽습니다.

패턴이 형성된 웨이퍼를 포토레지스트 현상액이 담긴 용기에 넣고 3분 동안 용기를 부드럽게 흔들어 줍니다. 현상된 웨이퍼를 isopropanol로 헹구고 질소 가스 스트림 하에서 웨이퍼를 건조시킵니다. 웨이퍼를 200 °C에서 30분 동안 베이킹한 후, 단차 측정기(profilometer)를 사용하여 패턴 포토레지스트의 두께가 웨이퍼 전체에 걸쳐 균일한지 확인합니다.

웨이퍼를 뚜껑을 열어둔 페트리 접시에 200 µL의 trichlorosilane과 함께 진공 데시케이터에 넣습니다. 웨이퍼 표면을 실란화하기 위해 trichlorosilane과 함께 데시케이터 내에 8시간 동안 둡니다. 장치 조립을 시작하려면, 범용 클린룸 테이프를 사용하여 150 mm 직경의 페트리 접시에 실리콘 웨이퍼 몰드를 고정합니다.

10:1 비율로 혼합된 polydimethylsiloxane 프리폴리머 50 grams를 페트리 접시에 넣고 진공 데시케이터에서 1시간 동안 혼합물의 기포를 제거합니다. 기포가 제거된 혼합물을 65 °C에서 최소 4시간 동안 경화시킵니다. 메스로 경화된 PDMS 층을 잘라낸 후 핀셋으로 몰드에서 경화된 층을 떼어냅니다.

PDMS를 작은 조각으로 자릅니다. 생검 펀치(biopsy puncher)를 사용하여 유체 유입구와 유출구 마이크로플루이딕 채널 구멍을 뚫습니다. 마이크로 가공된 표면을 세척하기 위해 PDMS 층의 패턴 면이 아래로 향하게 하여 투명 룸 테이프 위에 놓습니다.

이전에 준비한 전극 지지 유리 기판을 아세톤, 이소프로판올, 탈이온수로 헹굽니다. 질소 가스 기류 하에서 기판을 건조합니다. PDMS 층과 기판을 마이크로머신 면이 위를 향하게 하여 100 mW로 설정된 RF 플라즈마 발생기에 넣습니다.

산소 플라스마를 이용하여 마이크로머신 표면을 30초 동안 활성화합니다. 다음으로 광학 현미경을 사용하여 패턴 PDMS 층을 표면 전극에 맞게 정렬합니다. 정렬이 완료되면 표면들이 물리적으로 접촉하게 하여 PDMS 층을 유리 기판 위에 밀봉합니다.

유리 기판의 코팅 전극 패턴이 PDMS 미세 유체 채널과 정확하게 정렬되는 것이 매우 중요합니다. 적절하게 정렬되면, 표면 전극과 입자의 상호작용을 통해 다중화를 위한 원하는 코드 파형이 생성됩니다. 조립된 장치를 유리 면이 아래로 향하게 하여 70 °C에서 5분 동안 베이크하십시오.

마지막으로 전극 접촉 패드에 전선을 납땜하여 장치 조립을 완료합니다. 실험을 시작하려면 미세유체 장치를 광학 현미경 스테이지 위에 놓으십시오. 장치의 기준 전극을 락인 앰플리파이어(lock-in amplifier)의 신호 출력 포트에 연결하고 400 kilohertz 사인파를 인가합니다.

양극 및 음극 센서 전극을 두 개의 독립적인 트랜스임피던스 증폭기에 연결합니다. 두 트랜스임피던스 증폭기를 록인 증폭기의 차동 전압 입력단에 연결하며, 이때 양극 센서 신호가 음극 센서 신호에서 감해지도록 합니다. 록인 증폭기의 복조기 출력을 데이터 수집 장치에 연결합니다.

데이터 수집 소프트웨어에서 락인 증폭기 출력의 샘플링 속도를 1 Megahertz로 설정합니다. 현미경으로 관찰되는 장치의 작동 모습을 광학적으로 기록할 수 있도록 고속 카메라를 설치합니다. 준비된 세포 현탁액을 주사기로 흡입합니다.

시료 주사기를 주사기 펌프에 고정하고 주사기를 입구 채널에 연결합니다. 출구 채널은 폐기물 용기로 향하게 합니다. 임피던스 변조 신호를 기록하는 동안 주사기 펌프를 사용하여 일정한 유속으로 세포 현탁액을 장치로 흘려보냅니다.

실험 완료 후, 분석 소프트웨어를 사용하여 전기 데이터를 처리하십시오. 처리된 전기 신호를 고속 카메라의 이미지와 비교하여 세포 크기에 대한 검량선을 작성하십시오. 직교 센서 코드에서 유도된 네 가지 고유한 전극 패턴이 있는 미세유체 센서 장치에 세포 현탁액을 흘려보냈습니다.

네 가지 센서 신호 모두 단일 전기 출력에서 기록되었습니다. 기록된 각 신호와 연관된 개별 센서는 기록된 센서 신호와 모든 가능한 코드 간의 상관관계를 통해 식별되었으며, 이를 통해 명확하게 구별 가능한 자기상관 피크가 생성되었습니다. 네 개 채널 모두에서 세포가 동시에 검출되어 간섭 신호에 의해 생성된 파형은 반복 알고리즘을 통해 분해되었습니다.

기록된 파형을 가능한 모든 코드와 상관 분석하고, 가장 큰 자기상관 피크를 식별하였습니다. 이에 해당하는 개별 센서 신호를 재구성하여 입력 파형에서 뺐습니다. 잔여 신호를 다음 반복 단계의 입력값으로 전달하였으며, 잔여 신호에서 더 이상 자기상관 피크가 나타나지 않을 때까지 이 과정을 반복하였습니다.

추정된 신호는 최소제곱법(least squares approximation)을 사용하여 재구성된 파형과 원래 기록된 파형 사이의 최적 적합도를 찾는 최적화 알고리즘을 기반으로 정밀하게 조정되었습니다. 이후 추정된 센서 신호의 채널 번호, 진폭, 지속 시간 및 상대적 타이밍을 통해 세포의 위치, 크기, 센서를 통과하는 시간을 결정하였습니다. 이 절차는 전기적 신호를 고속 카메라의 광학 측정값과 비교함으로써 검증되었습니다.

이 기술은 하드웨어 관점에서 매우 단순하기 때문에, 일단 숙달되면 구현하기가 매우 쉽습니다. 칩 상에 활성 구성 요소가 없으며, 소프트 리소그래피와 직접적으로 호환되고 신호 처리는 간단한 계산 알고리즘에 의존합니다.

본 프로토콜을 통해 코드 기반 다중 전기 센서가 포함된 미세유체 칩을 제작하고, 생분석 측정을 위한 전기 신호를 해독할 수 있습니다. 이 다재다능하고 확장이 가능한 전자 감지 기술은 다양한 미세유체 장치에 쉽게 통합되어, 칩 상에서 처리되는 입자들을 시공간적으로 추적함으로써 정량적 분석을 구현할 수 있게 합니다. 이 영상을 시청한 후에는 미세유체 CODES 기술을 설계, 제작 및 구현하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.