높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

본 프로토콜의 전반적인 목표는 고효율 단일 세포 분리 및 배양이 가능한 미세유체 칩의 제작과 작동 방법을 시연하는 것입니다. 이 방법은 단일 세포 분리 및 배양이 필요한 모든 연구 분야에 유용한 도구를 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 대규모 마이크로웰 어레이에 단일 세포를 매우 효율적으로 로딩할 수 있다는 점입니다.

또한, 장치 작동에는 완만한 흐름과 중력만이 사용되므로 세포 손상을 최소화할 수 있습니다. 이 기술은 세포의 이질성이 세포 반응에 영향을 미치는 암과 같은 인간 질병의 최종 진단에 적용될 수 있습니다. 저희는 마이크로웰 세포주를 구축하던 중 한계 희석법이 매우 시간이 많이 걸리고 비효율적이라는 점 때문에 이 방법을 개발한다는 아이디어를 얻게 되었습니다. 이제 이 방법은 개별 세포 분석에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

또한 단일 세포의 경로 및 행동에 대한 구축과 시계열 관찰과 같은 다른 응용 분야에도 적용할 수 있습니다. 먼저, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 표준 포토리소그래피를 사용하여 단일 세포 분리층과 마이크로웰 배양층 모두를 위한 실란화 마스터 몰드를 제작하십시오. 각 마스터 몰드에 대해, 일회용 컵에 16 g의 PDMS base와 1.6 g의 경화제를 혼합하고, 혼합물이 잘 섞일 때까지 저어주십시오.

그 다음, 마스터 몰드를 150 millimeter 페트리 접시에 넣고 몰드 위에 PDMS를 붓습니다. 페트리 접시를 데시케이터에 넣고 1시간 동안 진공 상태를 유지하여 PDMS 내부의 기포를 제거합니다. 1시간 후, 접시를 데시케이터에서 꺼내 65 °C의 일반 오븐에 3~6시간 동안 넣어 PDMS를 경화시킵니다.

그런 다음, 디쉬를 오븐에서 꺼내 실온까지 식힙니다. 식으면 경화된 PDMS 캡처 웰 어레이와 마이크로웰 배양 어레이를 마스터 몰드에서 떼어내고, 면도날을 사용하여 디바이스를 잘라냅니다. 다음으로, 0.75 millimeter 펀치를 사용하여 캡처 웰 어레이 층의 마이크로채널 양 끝에 구멍을 하나씩 뚫습니다.

테이프를 사용하여 장치의 내부 표면이 될 부분을 세척한 다음, 각 층의 내부 표면이 위를 향하게 하여 플라스마 세척기에 넣고 짧게 산소 플라스마 처리를 수행합니다. 처리가 완료되면 플라스마 세척기에서 PDMS 층을 꺼내고, 실체 현미경을 사용하여 장치의 상단 층과 하단 층을 정렬하고 결합합니다. 정렬된 장치를 65 °C의 오븐에 24시간 동안 두어 PDMS 층 사이에 영구적인 결합을 형성합니다.

다음으로, 결합된 PDMS 장치를 탈이온수에 넣고 용기를 데시케이터에 넣어 15분 동안 진공 상태로 유지하여 장치의 미세유체 채널 내 공기를 제거합니다. 장치에서 모든 공기가 제거되면, PDMS 장치를 조직 배양 후드에 넣고 UV 램프를 사용하여 장치 표면을 30분 동안 멸균합니다. 그다음, 장치 내부의 탈이온수를 PBS에 희석한 5% bovine serum albumin으로 교체하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.

이렇게 하면 표면이 블로킹되어 캡처 웰(capture-wells)에서 배양 웰(culture-wells)로 분리된 세포가 옮겨지는 전이 효율이 향상됩니다. 30분 후, 장치 내의 블로킹 용액을 멸균된 PBS로 교체합니다. 밀리리터당 2.5 million cells 농도의 단일 세포 현탁액을 준비하고, 피펫에 현탁액 50 µL를 흡입합니다.

그런 다음, 장치의 배출구 구멍을 통해 세포를 장치 내부로 옮깁니다. 세포 현탁액 50 µL를 추가로 로딩하여 유입구 구멍을 통해 장치로 옮김으로써 마이크로채널 전체를 세포로 균일하게 채웁니다. 로딩이 완료되면, 직경 1 mm 나일론 낚싯줄로 만든 멸균 플러그를 사용하여 장치의 배출구 구멍을 밀봉합니다.

그 다음, 1 mL 멸균 주사기에 배양액을 채우고 남아 있는 기포를 제거한 후 주사기 펌프에 장착합니다. 23 gauge 뭉툭한 바늘(blunt needle)을 주사기에 연결하고, 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene) 튜브를 사용하여 바늘과 장치의 입구를 연결합니다. 튜브를 연결한 후, 출구 구멍의 플러그를 제거하고 세포들이 중력에 의해 단일 세포 포집 웰(capture-wells)에 가라앉을 때까지 2분 동안 기다립니다.

다음으로, 시린지 펌프를 600 µL/min으로 설정합니다. 배출구 플러그를 제거하고 캡처되지 않은 세포를 30초 동안 씻어냅니다. 압력이 안정화될 때까지 2분간 기다립니다.

그런 다음 장치의 유입구에서 튜브를 제거하고, 유입구와 유출구 구멍을 모두 플러그로 밀봉하여 밀폐 배양 시스템을 형성합니다. 이제 장치를 손으로 뒤집어 포획된 단일 세포를 장치 반대편의 배양 마이크로웰로 이동시킵니다. 그 후, 장치를 100 millimeter 조직 배양 접시에 넣고 장치 주변에 10 milliliters의 멸균된 PBS를 추가한 다음 접시를 배양기에 넣습니다.

배양액을 교체하려면, 먼저 마이크로채널 내에 기포가 유입되는 것을 방지하기 위해 PDMS 장치의 입구와 출구 근처 상단에 배양액 두 방울을 떨어뜨립니다. 그런 다음, 0.75 millimeter 생검 펀치(biopsy puncher)를 사용하여 마이크로채널 양 끝단 근처의 PDMS 장치 상단에서 구멍 두 개를 뚫습니다. 이때 반드시 장치의 상단 층만 뚫리도록 주의하십시오.

다음으로, 미리 데워둔 신선한 배지를 1 mL 플라스틱 주사기에 채운 후, 23 gauge 뭉툭한 바늘과 PTFE 튜브를 사용하여 이를 새로 만든 유입구 포트에 연결합니다. 5분 동안 약 120 µL의 신선한 배지를 장치 내부로 천천히 흘려보내 기존의 배지를 교체합니다. 작업이 완료되면 플러그 두 개를 사용하여 유입구와 유출구 포트를 밀봉하고, 장치를 세포 배양 인큐베이터로 다시 옮깁니다.

포획 웰(capture-wells)에 최종적으로 들어가는 세포의 수는 세포 종류에 따라 약 68%에서 85% 범위입니다. 또한, 세 가지 세포 유형 모두에서 대부분의 포획 웰에는 단일 세포만 포함되어 있었습니다. 포획된 KT98 세포를 배양 웰(culture-wells)로 옮긴 후, 약 77%의 웰에는 단일 세포만 있었고, 16%는 세포가 없었으며, 6%는 두 개의 세포가 있었고, 1% 미만의 웰에 세 개 이상의 세포가 있었습니다.

7일 동안 분리된 단일 세포들은 이질적인 성장 패턴을 보였습니다. 일부 세포는 증식한 반면, 다른 세포들은 증식하지 않았습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 약 20분 이내에 완료할 수 있습니다.

이 영상을 시청하신 후, 여러분은 이 고처리량 단일 세포 분리 내분비 배양 플랫폼을 사용하여 단일 세포 실험의 생산성을 높이는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때, 마이크로채널 내에 기포가 유입되지 않도록 주의하고 시간이 지남에 따라 세포가 서로 응집되는 것을 방지하는 것이 중요합니다.