Name: 높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 배우세요 미세유체 칩을 활용한 높은 처리량 단일 세포 분리 및 장기 배양 기술입니다. 이 방법은 세포 손상을 최소화하며 암 연구 등 질병 진단에 활용됩니다.

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이 연구는 국립보건연구원(National Health Research Institutes)의 보조금(03-A1 BNMP11-014)의 지원을 받았습니다.

주 : 우리의 미세 유체 소자의 제작을위한 포토 마스크 설계는 컴퓨터 이용 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 그려졌다. 디자인이어서, 상용 서비스를 이용하여 크롬 포토 마스크를 제조하는데 사용 하였다. PDMS의 장치는 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 제조 하였다. 11 리소그래피에 의해 마스터 금형 1. 제작 <ol><li> 포토 리소그래피 공정 (12) 전에, 기판으로 4 인치 실리콘 웨이퍼를 사용하여 10 분 동안 120 ℃에서 종래의 오븐에서 웨이퍼 탈수. </li><li> 플라즈마 클리너 30 초 100w에서 산소 플라즈마 처리를 이용하여 탈수 한 실리콘 웨이퍼를 클린. </li><li> 다음 베이킹 프로세스에 대해 각각 65 ° C에서 두 개의 핫 플레이트 95 ° C를 예열. </li><li> 스핀 코터에 의해 세정 된 실리콘 웨이퍼 상에 네가티브 포토 레지스트 (PR)를 도포 5g; 30 초 동안 1,200 rpm으로 (SU-8 50)에서 스핀 마이크로 층을 생성한다. </li><li> 홍보를 배치12 분 동안 65 ℃에서 예열 된 핫 플레이트 상에 웨이퍼를 도포하고, 소프트 베이크 공정을 수행하기 위해 (두께 100㎛의 패턴) 33 분 동안 95 ° C에서 다른 예열 된 핫 플레이트로 옮긴다. </li><li> 소성 후, 반자동 마스크 얼 라이너의 홀더에 PR 코팅 된 실리콘 웨이퍼를 배치하고, 25,400 dpi의 해상도 투명 마스크에 정렬. </li><li> 실리콘 웨이퍼의 PR 패턴을 만들 의해 500mJ / ㎠의 도즈에서 UV 광 (365 ㎚)에 PR 코팅 된 실리콘 웨이퍼를 노출시킨다. </li><li> 얼 라이너에서 웨이퍼를 제거하고 12 분 동안 95 ° C에서 후 베이킹을위한 열판에 놓습니다. </li><li> 정렬 마크를 노출 12 분 질소 가스로 가볍게 건조위한 미가 교 PR을 씻어 SU-8 현상액 (프로필렌 글리콜 모노 메틸 에테르 아세테이트, PGMEA) 용액에 웨이퍼를 담근다. </li><li> 다시, 스핀 코터에 의해 웨이퍼 상에 네가티브 포토 레지스트의 코팅 5g; 300 30 초 30 초와 1,200 RPM (SU-8 10) 700 rpm으로 (SU-8 100)에서 스핀# 181; m 두께의 패턴 및 27 μm의 두께 패턴은 각각 마이크로 웰 층을 확인합니다. </li><li> (27 μm의 깊은 캡처 웰 층) 4 분, 8 분 동안 95 ° C에서 65 ° C에서 열판에 PR 코팅 된 웨이퍼를 배치; 40 분 동안 65 ° C에서과 (300 μm의 깊은 문화 잘 층) 110 분 동안 95 ° C에서. </li><li> 냉각 후, UV 광을 구비 한 마스크 얼 라이너에 PR 코팅 된 실리콘 웨이퍼를 배치했다. </li><li> 250 엠제이 / cm 2 (27 μm의 두께 패턴) 700 엠제이 /의 용량 cm 2 (300 μm의 두께 패턴)에 자외선 (365 nm의)에 PR 코팅 된 실리콘 웨이퍼를 노출. </li><li> 각각 5 분 (27 μm의 두께 패턴), 30 분 (300 μm의 두께 패턴) 95 ° C에서 웨이퍼를 굽는다. </li><li> 각각 6 분 (27 μm의 두께 패턴), 25 분 (300 μm의 두께 패턴)의 PGMEA에 의해 가교 PR을 세척 한 후 질소 가스로 건조. </li><li> 패턴의 피처들의 높이를 측정스캐닝 레이저 프로파일로의 XY 스테이지 상에 웨이퍼를 배치함으로써 주사 레이저 프로파일로 갖는 웨이퍼. <ol><li> 명확 패턴은 20X 대물 렌즈에서 &quot;카메라 뷰&quot;관찰 모드를 사용하여 웨이퍼 상에 표시하는 기능의 초점 평면을 조정한다. </li><li> &quot;레이저보기&quot;를 &quot;카메라 뷰&quot;로부터 관찰 모드를 전환 한 기능의 상하 위치를 설정한다. </li><li> 각각 측정 모드, 영역, 품질 및 투명 (위)까지 Z 피치, 1 라인 (1024 × 1), 높은 정확도와 0.5 μm의를 설정하고 측정을 시작하기 시작 바닥을 누릅니다. </li></ol></li></ol> 단일 세포 분리를위한 PDMS 장치 2. 준비 <ol><li> PDMS 주조 전에 쉽게 마스터 몰드에서 PDMS 복제본을 박리하게 소수성 표면을 만들 트리클로로 마스터 주형 silanization합니다. <ol><li> 마스터 주형 및 함유 가중 보트 놓고200 데시 케이 터에서 트리클로로 실란의 μL, 15 분 동안 진공 (-85 kPa의)를 적용합니다. </li><li> 진공을 중지 한 후 적어도 1 시간 동안 실온에서 마스터 주형 silanization합니다하도록 데시 케이 터 내에서 마스터 주형을 떠난다. </li><li> 데시 케이 터에서 마스터 금형을 제거하고 10cm 페트리 접시에 각각의 마스터 몰드를 배치합니다. </li></ol></li><li> 베이스 10의 비율로 함유 경화제 17.6 g PDMS 중합체 키트 총량 믹스 : 1 다음 페트리 접시에서 마스터 주형 상에 PDMS를 붓는다. </li><li> 데시 케이 터에서 페트리 접시를 놓고 PDMS 기포를 제거하기 위해 1 시간 동안 진공 (-85 kPa의)을 적용한다. </li><li> 데시 케이 터에서 페트리 접시를 제거하고 3 ~ 65 ° C에서 기존의 오븐에 배치 - PDMS의 치료를 위해 6 시간. </li><li> 마스터 몰드로부터 경화 된 PDMS 레플리카를 제거하고 공의 내경을 가진 펀치에 의해 캡처 웰 어레이 PDMS 복제본 마이크로 채널의 양단에서 두개의 입구로서 구멍 출구 펀치.유체 채널 (그림 2A) 75 mm이다. </li><li> PDMS의 복제본의 표면을 청소 한 다음 간단한 산소 플라즈마 처리 (14 초 100 와트)에 대한 플라즈마 클리너에 PDMS 복제본을 배치하는 테이프를 사용합니다. </li><li> 산소 플라즈마 시스템에서 PDMS 복제본을 제거합니다. </li><li> 실체 현미경 아래에 손으로 최고 (캡처 마이크로 웰을 포함)과 (문화 마이크로 웰 포함) 바닥 PDMS 복제를 맞추고 접촉을 가져. </li><li> 최종 장치를 형성하도록 PDMS 복제본 간의 영구적 인 결합을 달성하기 위해 24 시간 동안 65 ° C의 오븐에서 배향 PDMS 복제본을 놓는다. </li><li> 탈 (DI) - 물 채워진 용기에 PDMS 소자를 담가 상기 PDMS 장치의 마이크로 채널로부터 공기를 제거하기 위해 15 분간 진공 (-85 kPa의) 하에서 건조기에서 용기를 배치했다. </li><li> 조직 배양 후드에서 DI 워터 가득 PDMS 소자를 배치하고 UV 광 (광의 파장이 254 나노 미터)를 사용하여 30 마일에 대해 장치의 살균엔. </li><li> 1X PBS 용액에 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)와 함께 PDMS 소자의 DI 물을 장착하고 PDMS 표면에 달라 붙는 것을 방지 세포를 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다. BSA 코팅에서 분리 된 세포의 전달 효율을 개선하는 것이 중요합니다 캡처 웰에 문화를 잘 참고. </li><li> 살균 1X PBS 용액으로 PDMS 장치에서 5 % BSA 용액을 교체합니다. </li></ol> 단일 세포 현탁액 3. 준비 <ol><li> 배양 신경 세포 KT98, 인간 암 세포 A549 및 MDA-MB-435 우리를 줄기 PDMS 소자 세포 실험에서 세포를 제조하는 통상의 세포 배양 용 인큐베이터 (37 ℃, 5 % CO 2, 95 % 습도)에서 페트리 접시 . </li><li> 제거하고 소모 된 배양액 (70)으로 성장 세포 배양 접시에서 (10 % 소 태아 혈청 및 1 % 항생제가 공급 DMEM 기초 배지) 폐기 - 80 % 합류. </li><li> 부드럽게 멸균 PBS로 3 회 세포를 씻는다. &lt;/ 리&gt; <li> (자세한 내용은 자료 목록을 참조하십시오) 제거하고 PBS를 폐기하고, 단백질 분해, collagenolytic 및 DNase의 활동과 재조합 효소 혼합물 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 실온에서 5 분간 배양 접시에 배양 한 후 세포의 분리를 촉진하는 배양 접시를 탭. </li><li> 세포를 분산시키는 멸균 PBS 4 mL를 추가 한 후 15ml의 원뿔형 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> 3 분 300 XG에 튜브를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. </li><li> 부드럽게 PBS 멸균 한 용액에 세포 펠렛을 재현 탁하고 트리 판 블루 표준 제외 방법 (13)을 이용하여 생균 수를 카운트. 주 :이 부유하는 단계는 상기 단일 세포 분리 효율을 향상시키는 것이 잘 해리 된 단일 세포 현탁액을 제조하는 핵심이다. </li></ol> 4. 단일 세포 클론의 분리 및 배양 <ol><li> X10 2.5 - 2.2의 농도 부하 세포 현탁액 50 μL를 <su휴대용 피펫 장치의 배출구를 통해 PDMS 장치의 마이크로 채널로는 P&gt; 106 세포 / ㎖. 주 : 세포 현탁액 로딩은 마이크로 피펫에 기포를 도입하지 않도록 정지 및 정지 제 위치에 유지 될 필요가있다. </li><li> 고르게 세포 전체 마이크로 채널을 채우기 위해 입구 구멍을 통해 세포 현탁액의 또 다른 50 μl를로드합니다. </li><li> 입구 및 출구 구멍에 액 적을에서 정수압에 의한 유동을 방지하기위한 플러그 (3 mm 길이 1 mm 직경 잘라 나일론 낚싯줄)와 배출구를 밀봉. 주 : 플러그 사용 전에 조직 배양 후드 안쪽 UV 살균 하였다. </li><li> 문화 매체와 1 ㎖의 멸균 주사기를 채워 그것에서 기포를 배출하고, 주사기 펌프를 설정합니다. </li><li> 23 G 무딘 바늘과 폴리 tetrafluoroethene (PTFE) 튜브를 통해 PDMS 장치의 입구 구멍 매체로드 주사기를 연결합니다. </li><li> 콘센트 구멍 모두에서 플러그를 제거아우 2 분의 시간 간격이 세포들이 중력에 의해 단일 ​​셀 캡처 웰에 정착 할 수 있도록한다. </li><li> 시린지 펌프 (600)에 의해 구동 μL / 분의 유속으로 배양액 300 μL로 캡처되지 세포를 씻어. </li><li> 장치를 안정화 2 분 동안 기다린 폐쇄 배양 시스템을 형성하기 위해 플러그 입구 및 출구 구멍을 밀봉. </li><li> 배양 마이크로 웰에 캡쳐 된 단일 세포를 전송할 손으로 장치를 플립. </li><li> 100-mm 조직 배양 접시에 PDMS 소자를 배치하고, 마이크로부터 배양액 증발을 방지하기 위해 장치의 주위에 멸균 PBS 10 ㎖를 추가한다. </li><li> 단일 세포의 클론 문화에 대한 기존의 세포 배양 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO 2, 95 % 습도)에 배양 접시를 이동합니다. </li></ol> 5. 문화 매체 보충 <ol><li> 배양 한 후 (D), 셀 (PR)을 향상시키는 새로운 배지로 PDMS 장치에서의 배양 배지를 대체oliferation. </li><li> 다음 단계를 수행하는 동안 미세 기포로 도입되지 않도록 입구 및 출구 구멍 부분 근처 PDMS 소자 위에 배지 두 방울을 놓는다. </li><li> 입구와 마이크로 채널의 양단 근처 PDMS 소자의 상부 및 마이크로 채널의 배출구로부터 2 구멍 펀치. 참고 : PDMS 장치의 전체 두 개의 레이어를 통해 펀치하지 마십시오 대신에, 단지 PDMS의 상부층을 통해 펀치. </li><li> 23 G 무딘 바늘과 PTFE 튜브를 통해 입구에 신선한 매체를 포함하는 1 ML의 플라스틱 주사기를 연결합니다. </li><li> 오래된 배지를 교체 5 분 동안 장치에 120 ㎕의 신선한 배지를 흐른다. </li><li> 입구를 밀봉 구멍 콘센트 및 세포 배양 용 인큐베이터에 장치를 반환 개의 플러그를 삽입한다. </li><li> 5.5 단계 5.4를 반복 한 다음 밀봉 플러그를 제거하여 배지를 문화의 기간 동안 매 2 일을 새로 고칩니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

마이크로 웰 기반 장치 시스템은 6,14 그러한 6 트래핑 대규모 단일 셀 및 단일 조혈 줄기 세포 증식 15 단일 세포 조작 및 분석을 위해 사용되어왔다. 물론 크기, 개수, 형상 비록 특정 애플리케이션을 위해 조절 될 수 있으며, 웰의 크기가 증가 될 때 단일 세포 분리 효율은 항상 노출되어있다. 9,15 마이크로 웰의 크기가 세포의 확산과 성장을 허용하도록 확대하면서 이러한 제한을 극복하기 위해, 공원 등의 알. 높은 단일 셀 포착 비율 (58.34 %)가 삼각 마이크로 웰과 마이크로 유체 칩을보고 하였다. 그러나, (a 측 ~ 50㎛의 길이를 가진)이 마이크로 웰는 최대 2 일 동안 증식을 지원할 수있다. 16 우리 이중 웰 전략은 큰 마이크로 웰의 단일 셀 로딩 포아송 확률에 의해 제한되지 않을 수 있도록 분포는 dilu을 제한에서 발생기 방법과 크기 적...

현재 배양 공간에 개별적으로 하나의 셀을 배치는 일반적으로 제한 희석 또는 형광 - 활성화 된 세포 분류 (FACS)를 사용하여 달성된다. 그것은 단지 쉽게 사용할 수 있습니다 피펫 및 조직 배양 플레이트를 필요로 많은 실험실의 경우, 희석을 제한하는 편리한 방법입니다. 이러한 경우에, 세포 현탁액을 연속적으로 적당한 세포 밀도로 희석 한 다음 수동 피펫을 이용하여 배양 웰에 두었다. 이러한 복실 단셀 그런 다음 1 콜로니 형성이 스크리닝 이질성 유전자로서 세포 분석을 위해 사용된다. 한계 희석법의 푸 아송 분포의 특성은 37 % (3)의 최대 확률 단세포 이벤트를 제한하기 때문에,이 방법을 지원하기위한 로봇 팔을 이용하지 않고 낮은 처리량과 노동력이있다. 통합 된 로보트 팔 FACS 기계 정확하게 PLAC으로 푸 아송 분포의 한계를 극복 할 수있다한 번에 4에서 잘 문화에서 하나의 셀을 보내고. 그러나, 높은 기계적 전단 응력은 5 (따라서, 세포 생존 능력을 저하) 및 기계 구입 및 운영 비용은 많은 실험실에서의 사용을 제한하고있다. 고효율 마이크로 웰 (6)에 하나의 셀을로드에 위의 한계를 극복하기 위해, 마이크로 장치가 개발되었다. 그러나, 마이크로 웰은로드 셀 인해 단일 ​​셀 로딩 가능성을 최대화하기 위해 하나의 셀에 가까운 마이크로 웰 각의 크기의 제조가 필요로 증식 할 충분한 공간을 제공하지 않는다. 배양 분석이 더 많은 마이크로 웰 세포 - 기반 애플리케이션 (예를 들면, 클론 원성 분석 7)에 요구되는 바와 같이 (90 - 650 ㎛의 직경 또는 측면 길이) 또한 확장 세포 배양을 허용하기 위해 이용되어왔다. 그러나, 한계 희석법 같이, 또한 (10)에 이르기까지, 낮은 단일 셀 로딩 효율을 갖는다 -. 30 % 89 이전에, 우리는 (10) 장치는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)으로 제작 하였다. 각각의 마이크로 웰에서 단일 세포를 분리하고, 분리 된 세포의 클론 원성 분석에서의 응용을 증명하기 위해 높은 처리량 미세 플랫폼을 개발하고, 마이크로 웰 어레이들의 두 세트를 포함하는 한 대체로 크기가 마이크로 웰의 단일 셀 로딩의 효율을 향상시킬 수있는 다른 마이크로 웰 크기와 세포보다 상당히 크다. 특히,이 &quot;이중 - 웰&quot;개념 배양 영역의 크기는 유동적이 간단 다른 세포 유형 및 애플리케이션에 적합하도록 장치의 설계를 조정할 수있어 단일 세포 포집 효율에 영향을주지 않고 조절 될 수있다. 이 고효율 방법은 세포 이질성 연구 및 모노클로 날 세포주 확립 장기간 세포 배양 실험에 유용 할 것이다.

<table><tbody><tr><td>AutoCAD 소프트웨어</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD LT 2011</td><td>부품 번호 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼&nbsp;</td><td>Eltech corperation</td><td>SPE0039</td><td></td></tr><tr><td>기존 오븐</td><td>영신 회사</td><td>ovp45</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Nordson</td><td>AP-300</td><td>벤치 탑 플라즈마 처리 시스템</td></tr><tr><td>SU-8 50 네거티브 포토레지</td>스트 <td>MicroChem</td><td>Y131269</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 100 네거티브 포토레지스트</td><td>MicroChem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Synrex Co., 주식 회사.</td><td>SC-HMI 2" ~ 6"</td><td></td></tr> <tr><td>핫플레이트</td><td>YOTEC 회사</td><td>YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>Msak aligner</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 개발자</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td><td>프로필렌 글리콜 모노 메틸 에테르 아세테이트</td></tr><tr><td>스캐닝 레이저 프로파일 로미터</td><td>KEYENCE</td><td>VK-X 100</td><td></td></tr><tr><td>Trichlorosilane</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. 위험한. 호흡기를 부식시키고 물과 격렬하게 반응합니다.</td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42020-0000</td><td>공간 절약형 진공 탈착기 190&nbsp; mm 화이트 베이스</td></tr><tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS) 키트</td><td>다우 코닝</td><td>실가드 184</td><td></td></tr><tr><td>해리스 유니 코어 펀처</td><td>테드 펠라 Inc.</td><td>15072</td><td>, 0.75mm 내경</td></tr><tr><td>탈착식 테이프</td><td>3M Company</td><td>Scotch 탈착식 테이프 811</td><td></td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica E24</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Bersing Technology</td><td>ALB001.500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 기초 매체</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Thermo Hyclone</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>항생제</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>글루타민-페니실린-스트렙토마이신</td></tr><tr><td>재조합 효소 혼합물</td><td>혁신적인 세포 기술</td><td>AM-105</td><td>Accumax</td></tr><tr><td>DiIC12(3) 세포막 염료</td><td>BD Biosciences</td><td>354218</td><td>세포 추적기로 사용</td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>하버드 장치</td><td>703007</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 주사기(1ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>23게이지 무딘 바늘</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TD21</td><td></td></tr><tr><td>폴리테트라플루오로에텐(PTFE) 튜빙</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TFT-23T</td><td>내경, 0.51&nbsp; 밀리미터; 외경, 0.82&nbsp; 밀리미터</td></tr></tbody></table>

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

단세포의 이질성을 연구하는 것은 많은 생물학적 질문에 매우 중요하지만 기술적으로는 어렵습니다. 따라서 단일 세포 배양 실험을 수행하기 위해 간단하면서도 처리량이 많은 방법이 필요합니다. 여기에서는 고효율 단일 세포 분리(~77%)를 위한 미세유체 칩 기반 전략을 보고하고 클론 생성 분석을 사용하여 장기 단일 세포 배양(최대 7d) 및 세포 이질성 분석을 수행할 수 있는 능력을 입증합니다. 이러한 응용은 KT98 마우스 신경 줄기 세포와 A549 및 MDA-MB-435 인간 암 세포로 입증되었습니다. 높은 단일 세포 분리 효율과 장기 배양 능력은 미세유체 채널의 상단과 하단에 다양한 크기의 마이크로웰을 사용함으로써 달성됩니다. 소형 마이크로웰 어레이는 단일 세포를 정밀하게 분리하도록 설계되었으며, 대형 마이크로웰 어레이는 미세유체 칩에서 단일 세포 클론 배양에 사용됩니다. 이 미세유체 플랫폼은 분리 효율을 저하시키지 않으면서 다양한 배양 전략을 위한 조정 가능한 세포 배양 공간의 유연성으로 인해 단일 세포 배양 응용 분야에 매력적인 접근 방식을 구성합니다.

단일 세포 분리 및 배양 용 마이크로 유체 플랫폼은 마이크로 웰 어레이의 두 세트 (도 2A)와 마이크로 채널 (200 ㎛의 높이)를 포함한다. 마이크로 웰 어레이의 두 세트 캡처 웰 (직경 25 μm의 깊이에 27 μm의) 각각 단일 세포의 분리 및 문화에 대한 문화 웰 (직경 285 μm의 깊이에서 300 μm의), 각 되나된다 탑 뷰 (도 2B)에서 볼 때 캡처 - 웰 배양 웰의 중앙에 위치한다. 장치 조작 (회로도 동작 흐름은 그림 1에 예시되어있다), 필요한 장비 (주사기 펌프, 조직 문화 인큐베이터, 및 현미경) 및 소모품 (주사기, 피펫 및 튜브)를 들어 생물학 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있습니다. 또한, 플랫폼의 휴대 성 및 투명성이 세포가 쉽게 편의와 장치에서 관찰 및 분석을 허용세포 배양 실험 동안적인 현미경. <p class="jove_conten...

여기에서는 고효율 단세포 분리 및 장기 클론 배양을 가능하게 하는 새로운 마이크로웰 설계 개념을 활용하는 미세유체 플랫폼으로 단일 세포를 분리 및 배양하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 고효율 단일 세포 분리 및 배양이 가능한 미세유체 칩의 제작과 작동 방법을 시연하는 것입니다. 이 방법은 단일 세포 분리 및 배양이 필요한 모든 연구 분야에 유용한 도구를 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 대규모 마이크로웰 어레이에 단일 세포를 매우 효율적으로 로딩할 수 있다는 점입니다.또한, 장치 작동에는 완만한 흐름과 중력만이 사용되므로 세포 손상을 최소화할 수 있습니다. 이 기술은 세포의 이질성이 세포 반응에 영향을 미치는 암과 같은 인간 질병의 최종 진단에 적용될 수 있습니다. 저희는 마이크로웰 세포주를 구축하던 중 한계 희석법이 매우 시간이 많이 걸리고 비효율적이라는 점 때문에 이 방법을 개발한다는 아이디어를 얻게 되었습니다. 이제 이 방법은 개별 세포 분석에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.또한 단일 세포의 경로 및 행동에 대한 구축과 시계열 관찰과 같은 다른 응용 분야에도 적용할 수 있습니다. 먼저, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 표준 포토리소그래피를 사용하여 단일 세포 분리층과 마이크로웰 배양층 모두를 위한 실란화 마스터 몰드를 제작하십시오. 각 마스터 몰드에 대해, 일회용 컵에 16 g의 PDMS base와 1.6 g의 경화제를 혼합하고, 혼합물이 잘 섞일 때까지 저어주십시오.그 다음, 마스터 몰드를 150 millimeter 페트리 접시에 넣고 몰드 위에 PDMS를 붓습니다. 페트리 접시를 데시케이터에 넣고 1시간 동안 진공 상태를 유지하여 PDMS 내부의 기포를 제거합니다. 1시간 후, 접시를 데시케이터에서 꺼내 65 °C의 일반 오븐에 3~6시간 동안 넣어 PDMS를 경화시킵니다.그런 다음, 디쉬를 오븐에서 꺼내 실온까지 식힙니다. 식으면 경화된 PDMS 캡처 웰 어레이와 마이크로웰 배양 어레이를 마스터 몰드에서 떼어내고, 면도날을 사용하여 디바이스를 잘라냅니다. 다음으로, 0.75 millimeter 펀치를 사용하여 캡처 웰 어레이 층의 마이크로채널 양 끝에 구멍을 하나씩 뚫습니다.테이프를 사용하여 장치의 내부 표면이 될 부분을 세척한 다음, 각 층의 내부 표면이 위를 향하게 하여 플라스마 세척기에 넣고 짧게 산소 플라스마 처리를 수행합니다. 처리가 완료되면 플라스마 세척기에서 PDMS 층을 꺼내고, 실체 현미경을 사용하여 장치의 상단 층과 하단 층을 정렬하고 결합합니다. 정렬된 장치를 65 °C의 오븐에 24시간 동안 두어 PDMS 층 사이에 영구적인 결합을 형성합니다.다음으로, 결합된 PDMS 장치를 탈이온수에 넣고 용기를 데시케이터에 넣어 15분 동안 진공 상태로 유지하여 장치의 미세유체 채널 내 공기를 제거합니다. 장치에서 모든 공기가 제거되면, PDMS 장치를 조직 배양 후드에 넣고 UV 램프를 사용하여 장치 표면을 30분 동안 멸균합니다. 그다음, 장치 내부의 탈이온수를 PBS에 희석한 5% bovine serum albumin으로 교체하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.이렇게 하면 표면이 블로킹되어 캡처 웰(capture-wells)에서 배양 웰(culture-wells)로 분리된 세포가 옮겨지는 전이 효율이 향상됩니다. 30분 후, 장치 내의 블로킹 용액을 멸균된 PBS로 교체합니다. 밀리리터당 2.5 million cells 농도의 단일 세포 현탁액을 준비하고, 피펫에 현탁액 50 µL를 흡입합니다.그런 다음, 장치의 배출구 구멍을 통해 세포를 장치 내부로 옮깁니다. 세포 현탁액 50 µL를 추가로 로딩하여 유입구 구멍을 통해 장치로 옮김으로써 마이크로채널 전체를 세포로 균일하게 채웁니다. 로딩이 완료되면, 직경 1 mm 나일론 낚싯줄로 만든 멸균 플러그를 사용하여 장치의 배출구 구멍을 밀봉합니다.그 다음, 1 mL 멸균 주사기에 배양액을 채우고 남아 있는 기포를 제거한 후 주사기 펌프에 장착합니다. 23 gauge 뭉툭한 바늘(blunt needle)을 주사기에 연결하고, 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene) 튜브를 사용하여 바늘과 장치의 입구를 연결합니다. 튜브를 연결한 후, 출구 구멍의 플러그를 제거하고 세포들이 중력에 의해 단일 세포 포집 웰(capture-wells)에 가라앉을 때까지 2분 동안 기다립니다.다음으로, 시린지 펌프를 600 µL/min으로 설정합니다. 배출구 플러그를 제거하고 캡처되지 않은 세포를 30초 동안 씻어냅니다. 압력이 안정화될 때까지 2분간 기다립니다.그런 다음 장치의 유입구에서 튜브를 제거하고, 유입구와 유출구 구멍을 모두 플러그로 밀봉하여 밀폐 배양 시스템을 형성합니다. 이제 장치를 손으로 뒤집어 포획된 단일 세포를 장치 반대편의 배양 마이크로웰로 이동시킵니다. 그 후, 장치를 100 millimeter 조직 배양 접시에 넣고 장치 주변에 10 milliliters의 멸균된 PBS를 추가한 다음 접시를 배양기에 넣습니다.배양액을 교체하려면, 먼저 마이크로채널 내에 기포가 유입되는 것을 방지하기 위해 PDMS 장치의 입구와 출구 근처 상단에 배양액 두 방울을 떨어뜨립니다. 그런 다음, 0.75 millimeter 생검 펀치(biopsy puncher)를 사용하여 마이크로채널 양 끝단 근처의 PDMS 장치 상단에서 구멍 두 개를 뚫습니다. 이때 반드시 장치의 상단 층만 뚫리도록 주의하십시오.다음으로, 미리 데워둔 신선한 배지를 1 mL 플라스틱 주사기에 채운 후, 23 gauge 뭉툭한 바늘과 PTFE 튜브를 사용하여 이를 새로 만든 유입구 포트에 연결합니다. 5분 동안 약 120 µL의 신선한 배지를 장치 내부로 천천히 흘려보내 기존의 배지를 교체합니다. 작업이 완료되면 플러그 두 개를 사용하여 유입구와 유출구 포트를 밀봉하고, 장치를 세포 배양 인큐베이터로 다시 옮깁니다.포획 웰(capture-wells)에 최종적으로 들어가는 세포의 수는 세포 종류에 따라 약 68%에서 85% 범위입니다. 또한, 세 가지 세포 유형 모두에서 대부분의 포획 웰에는 단일 세포만 포함되어 있었습니다. 포획된 KT98 세포를 배양 웰(culture-wells)로 옮긴 후, 약 77%의 웰에는 단일 세포만 있었고, 16%는 세포가 없었으며, 6%는 두 개의 세포가 있었고, 1% 미만의 웰에 세 개 이상의 세포가 있었습니다.7일 동안 분리된 단일 세포들은 이질적인 성장 패턴을 보였습니다. 일부 세포는 증식한 반면, 다른 세포들은 증식하지 않았습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 약 20분 이내에 완료할 수 있습니다.이 영상을 시청하신 후, 여러분은 이 고처리량 단일 세포 분리 내분비 배양 플랫폼을 사용하여 단일 세포 실험의 생산성을 높이는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때, 마이크로채널 내에 기포가 유입되지 않도록 주의하고 시간이 지남에 따라 세포가 서로 응집되는 것을 방지하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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미생물 단일 세포 분석을 위한 미세유체 피콜리터 바이오리액터: 제작, 시스템 설정 및 작동

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Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System을 사용한 자동화된 High-throughput Microbial Monoclonal Cultivation and Picking

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배우세요 미세유체 칩을 활용한 높은 처리량 단일 세포 분리 및 장기 배양 기술입니다. 이 방법은 세포 손상을 최소화하며 암 연구 등 질병 진단에 활용됩니다.

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

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