June 16th, 2016
여기에서는 고효율 단세포 분리 및 장기 클론 배양을 가능하게 하는 새로운 마이크로웰 설계 개념을 활용하는 미세유체 플랫폼으로 단일 세포를 분리 및 배양하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 고효율 단일 세포 분리 및 배양을 가능하게 하는 미세유체 칩의 제조 및 작동을 입증하는 것입니다. 이 방법은 단일 세포 분리 및 배양의 이점을 얻을 수 있는 모든 영역에 유용한 도구를 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 세포를 대형 마이크로웰 어레이에 적재하는 데 매우 효율적이라는 것입니다.
또한 부드러운 흐름과 중력만 사용하여 장치를 작동시켜 세포 손상을 최소화합니다. 이 기술의 함의는 세포 이질성이 세포의 반응에 영향을 미치는 암과 같은 인간 질병의 최종 진단으로 향하고 있기 때문에 한계 희석 방법이 시간이 많이 걸리고 비효율적이었기 때문에 마이크로웰 세포주를 확립할 때 이 방법을 개발하자는 아이디어를 떠올렸습니다. 이제 이 방법을 통해 개별 세포 분석에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
또한 개별 세포 경로 및 행동의 관찰 설정 및 시간과 같은 다른 응용 프로그램에도 적용될 수 있습니다. 먼저 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표준 포토리소그래피를 사용하여 단일 세포 분리층과 마이크로웰 배양층 모두에 대한 실란화된 마스터 몰드를 제작합니다. 각 마스터 몰드에 대해 일회용 컵에 16g의 PDMS 베이스와 1.6g의 경화제를 결합하고 결합될 때까지 혼합물을 저어줍니다.
그런 다음 마스터 몰드를 150mm 페트리 접시에 넣고 PDMS를 몰드 위에 붓습니다. 페트리 접시를 데시케이터에 넣고 1시간 동안 진공 청소기를 적용하여 PDMS에서 기포를 제거합니다. 1시간 후 건조기에서 접시를 꺼내 섭씨 65도의 일반 오븐에 3-6시간 동안 넣어 PDMS를 치료합니다.
그런 다음 오븐에서 접시를 꺼내 실온으로 식힙니다. 식으면 마스터 몰드에서 경화된 PDMS 캡처 웰 어레이 및 마이크로웰 배양 어레이를 벗겨내고 면도날을 사용하여 장치를 잘라냅니다. 다음으로, 0.75mm 펀치를 사용하여 capture-well 어레이 레이어의 마이크로 채널 각 끝에 하나의 구멍을 만듭니다.
테이프를 사용하여 장치의 내부 표면이 될 것을 청소한 다음 내부 표면이 위를 향하도록 개별 레이어를 플라즈마 클리너에 배치하여 간단한 산소 플라즈마 치료를 수행합니다. 완료되면 플라즈마 클리너에서 PDMS 층을 제거하고 실체 현미경을 사용하여 장치의 상단 및 하단 레이어를 정렬하고 연결합니다. 정렬된 장치를 섭씨 65도의 오븐에 24시간 동안 넣어 PDMS 레이어 사이에 영구적인 결합을 만듭니다.
다음으로, 결합된 PDMS 장치를 탈이온수에 넣고 용기를 진공 상태에서 15분 동안 진공 상태로 건조기에 넣어 장치의 마이크로 채널에서 공기를 제거합니다. 이제 장치에서 모든 공기를 제거한 상태에서 PDMS 장치를 조직 배양 후드에 놓고 자외선을 사용하여 30분 동안 장치 표면을 살균합니다. 다음으로, 장치의 탈이온수를 PBS의 5% 소 혈청 알부민으로 교체하고 장치를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.
이것은 표면을 차단하고 capture-wells에서 culture-well로 분리된 세포의 전달 효율을 향상시킬 것입니다. 30분 후 장치의 차단 용액을 멸균 PBS로 교체합니다. 밀리리터당 250만 개의 세포가 있는 단일 세포 현탁액을 준비하고 50마이크로리터의 현탁액이 있는 피펫을 로드합니다.
그런 다음 장치의 배출 구멍을 통해 셀을 장치로 옮깁니다. 셀 현탁액을 50마이크로리터 더 로드하고 입구 구멍을 통해 장치로 전달하여 전체 마이크로채널을 셀로 균일하게 채웁니다. 로드되면 1mm 직경의 나일론 낚싯줄로 만든 멸균 플러그를 사용하여 장치의 배출구를 밀봉합니다.
그런 다음 1mL 멸균 주사기에 배양 배지를 채우고 잔류 기포를 배출한 다음 주사기 펌프에 넣습니다. 23 게이지 뭉툭한 바늘을 주사기에 연결하고 폴리테트라플루오로에틸렌 튜브를 사용하여 바늘을 장치의 입구에 연결합니다. 튜브를 연결한 후 콘센트 구멍에서 플러그를 뽑고 세포가 중력에 의해 단일 세포 포획 웰에 정착할 때까지 2분 동안 기다립니다.
다음으로, 주사기 펌프를 분당 600마이크로리터로 설정합니다. 콘센트 플러그를 제거하고 포집되지 않은 셀을 30초 동안 씻어냅니다. 압력이 안정될 때까지 2분 정도 기다립니다.
그런 다음 장치의 입구에서 튜브를 제거하고 입구와 출구 구멍을 모두 플러그로 밀봉하여 폐쇄 배양 시스템을 형성합니다. 이제 장치를 손으로 뒤집어 캡처된 단일 세포를 장치 반대편에 있는 배양 마이크로웰로 이동합니다. 그런 다음 장치를 100mm 조직 배양 접시에 넣고 장치 주위에 10ml의 멸균된 PBS를 추가한 다음 접시를 인큐베이터에 넣습니다.
배양 배지를 교체하려면 먼저 입구와 출구 근처의 PDMS 장치 상단에 두 방울의 배양 배지를 놓아 마이크로 채널로 기포가 유입되지 않도록 합니다. 그런 다음 0.75mm 생검 펀처를 사용하여 PDMS 장치 상단에서 마이크로 채널 끝 근처에 있는 두 개의 구멍을 뚫습니다. 장치의 최상층만 뚫
어야 합니다.다음으로, 예열된 새 매체가 들어 있는 1밀리리터 플라스틱 주사기를 채우고 23게이지 무딘 바늘과 PTFE 튜브를 사용하여 새로 생성된 입구 포트에 연결합니다. 약 120마이크로리터의 새 매체를 5분에 걸쳐 장치에 천천히 주입하여 기존 매체를 교체합니다. 완료되면 두 개의 플러그를 사용하여 입구와 출구 포트를 밀봉하고 장치를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다.
포획 웰에서 끝나는 세포의 수는 세포의 유형에 따라 약 68%에서 85%까지 다양합니다. 또한 대부분의 포획 웰에는 세 가지 세포 유형 모두에 대해 단일 세포만 포함되어 있습니다. 포획된 KT98 세포를 배양 웰로 옮긴 후, 웰의 약 77%는 단일 세포만 가지고 있었고, 16%는 세포가 없었으며, 6%는 2개의 세포를 가지고 있었고, 웰의 1% 미만은 3개 이상의 세포를 가지고 있었습니다.
7일 동안 고립된 단일 세포는 이질적인 성장 패턴을 보였습니다. 일부 세포는 증식했지만 다른 세포는 증식하지 않았습니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 약 20분 안에 완료할 수 있습니다.
이 동영상을 시청한 후에는 이 고처리량 단일 세포 분리 내분비 배양 플랫폼을 사용하여 단일 세포 실험의 생산성을 높이는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 기포가 마이크로 채널로 들어가는 것을 방지하고 시간이 지남에 따라 세포가 함께 응집되는 것을 방지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
이 프로토콜은 고효율 단일 세포 분리 및 배양을 위해 설계된 미세 유체 칩의 제작 및 작동을 시연합니다. 이는 부드러운 흐름과 중력을 활용하여 세포 손상을 최소화합니다.
This microfluidic platform addresses a critical bottleneck in single-cell analysis by enabling high-efficiency isolation and long-term culture without compromising cell viability. By reducing reliance on labor-intensive limit dilution methods, it accelerates hypothesis testing in target validation and phenotypic screening workflows. The system supports mechanistic de-risking through clonal expansion and heterogeneity assessment, directly informing go/no-go decisions in early discovery.
The platform integrates into early discovery workflows by providing a reproducible source of clonal cells for target engagement and phenotypic assays, bridging isolation to functional validation.