Name: 단일 플라즈몬 나노 입자에서 비선형 산란 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 6 s
Description: 배우세요 플라즈몬 나노구조체의 비선형 산란을 활용한 초해상도 현미경 기법으로 해상도 향상 방법을. 이 기술은 광학 현미경의 대비와 해상도 한계를 극복하는 새로운 비블리칭 대비 방식을 제공합니다.

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이 작업은 NSC-101-2923-M-002-001-MY3 및 NSC-102-2112-M-002-018-MY3에 따라 과학기술부의 지원을 받습니다. 이 연구는 또한 과학기술정책협의회(CSTP)와 JSPS 아시아 CORE 프로그램이 주도하는 "차세대 세계 선도 연구자를 위한 자금 지원 프로그램(NEXT 프로그램)"을 통해 일본과학진흥회(JSPS)의 지원을 받고 있습니다.

1. GNS 샘플 준비 <ol><li> LSPR 피크 시프트가 발생할 수의 입자 응집을 방지하기 위해 약 40 kHz에서 적어도 15 분 동안 샘플을 초음파 처리 GNS 1ml의 콜로이드 용액을 준비하기 전에. </li><li> GNSS를 해결하기 위해 상업 마그네슘 알루미늄 실리케이트 (MAS) 코팅 된 슬라이드 글라스에 GNS 콜로이드의 100 ~ 200 μl를 삭제합니다. </li><li> 적어도 1 분 후, 증류수로 세척하여 여분의 콜로이드를 제거합니다. 대기 시간은 GNSS의 요구 분포 밀도에 따라 달라집니다. 전형적으로, 이들 대부분은 서로 분리되어 있기 때문에 입자가 쉽게 식별 될 수 있도록 적절한 밀도에서 1-3 분 결과. 대기 시간이 너무 길면 현저한 응집이 발생할 수있다. </li><li> 질소 가스로 퍼징하여 샘플을 건조. </li><li> (선택 사항), 고해상도에 유리 GNSS 매핑이 단계 (23)에서 주사 전자 현미경 (SEM)을 수행한다. 예를 들어, 이미지가 Figur 제공됩니다E 1, GNSS의 특성 밀도를 나타내는. 화상을 취득하는 전계 방출 SEM을 사용한다. 오일 샘플 (다음 단계)에 추가되면, 그 기름을 제거하고, SEM으로 샘플을 관찰하기 어려울 것이다. </li><li> GNSS 다루 시료에 동일한 굴절률 기름 방울을 첨가하고, 유리 기판에서 강한 반사를 제거하기 위해. </li><li> 샘플의 상단에 커버 유리를 놓고 매니큐어로 밀봉. </li><li> 매니큐어가 건조 될 때까지 적어도 5 분을 기다립니다. 샘플은 준비가되었습니다. </li></ol> 홈 제작 된 공 초점 현미경 2. 정렬 <ol><li> 설정의 방식에 대한 그림 2를 참조하십시오. 현미경 본체 자체의 백색광 조명 경로를 맞 춥니 다. 현미경의 할로겐 광원 켜고 쾰러 조명 조건을 달성하기 위해 현미경 제조업체의 사용 설명서를 따르십시오. 흰색 할로겐 조명 빔의 뒷면에 거의 평행 있는지 확인대물 조리개의 부분적 50/50 빔 스플리터에 의해 반사하고 레이저를 향해 전파. </li><li> 이들이 주사 범위의 중심이다 정확한 초기 위치에서 유지되도록하여 갈바 노 미러를 켜고. </li><li> 할로겐 조명 경로를 따라, 그것에 동심 고리와 종이의 얇은 시트에 의해 두 개 이상의 대상을 놓고 할로겐 빔을 맞 춥니 다. </li><li> 이미징을 수행하려면, 532 nm의 레이저를 선택합니다. 분광 측정을 수행하기 위해, 초 연속 레이저를 선택한다. 정렬 중에, 레이저의 파워는 비선형 성을 피할 목적의 뒤쪽 개구에 10 μW 미만이어야한다. 그리고, 두 타겟의 도움으로 출사 할로겐 빔 입사 레이저 빔을 시준 대향. 이 프로세스가 완료되면, 레이저 빔의 거친 정렬은 달성되었다. </li><li> 대물 렌즈의 후방 개구의 중심을 통해 레이저 빔을 정렬. 통상적으로, OI를 사용L 액침 대물. 오일 침지 대물 렌즈와 GNS 샘플 사이에 오일 한 방울을 추가합니다. GNSS의 산란 신호를 수집하기 위해 검출기로서 광전자 증 배관 (PMT)를 사용한다. </li><li> 신호를 산란 포커스 아웃 차단하는 PMT의 앞에 20 μm의 직경 핀홀를 놓습니다. , 갈바 노 미러 및 (홈 내장 소프트웨어를 통해) PMT를 켜고 GNSS의 후방 산란 신호를 최대화하기 위해 시료 스테이지의 핀홀 위치 및 높이를 조정 한 후 컴퓨터 화면에 개별 GNS 관찰. 올바른 정렬과 GNSS의 샘플 XY 화상도 2b에 도시된다. </li><li> 약간 초점 동심도를 확인 시료 스테이지의 높이를 변경. 이 동심원이 아닌 경우, 시료 스테이지의 높이를 변화시키면서 동일한 위치에 남아 GNS의 중심까지 스캐너 앞의 두 거울 빔을 조정한다. PSF의 XZ 이미지 2C 그림과 유사 있는지 확인정확한 빔 정렬을 보장한다. 저역 통과 및 가우스 부드러운 필터이 두 이미지를 처리​​합니다. </li></ol> 산란 비선형 3. 특성 <ol><li> 낮은 여기 강도 (이하 × 104 W / ㎝ 2)에서 2.6 프로토콜에 따라 금 나노 입자의 화상을 취득. </li><li> ImageJ에의 이미지 (또는 다른 이미지 분석 소프트웨어)를 엽니 다. 이미지 GNSS의 하나에 걸쳐 라인 (도 2b 참조) 그릴과 분석을 사용하여 -&gt; ImageJ에 툴 플롯 프로필 산란 강도 프로파일을 검색한다. 가우스 함수에 의해 선택된 PSF의 프로필에 맞는 : <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/53338/53338eq2.jpg" /> Y는, Y 0 배경 값은 (만약 있다면) PMT 판독 값이고,이 피크 진폭은 폭이 w, x는, 공간 좌표이고,이고, X (C)는 중심 번호 좌표이며가우스 함수의 전자. 해당 PSF의 FWHM은 (½ln2) W입니다. 대물의 개구 수 (NA)에 기초하여, 촛점 PSF의 FWHM은 이론적 L은 여기 파장 약 0.43l / NA 인 것으로 추정 될 수있다. 촬상 시스템의 배열을 확인하는 두 숫자를 비교. </li><li> 수동으로도 2a에 감광 (ND) 필터를 변경하여 여진 강도를 증가시키고, 각각의 휘도 레벨에서 산란 이미지를 기록한다. 다른 여진 강도 각 GNS의 중심에서 산란 신호의 값을 취하며, 여기 신호 강도 대 산란 곡선을 플롯. 여기 강도가 충분히 낮은 경우 선형 관계를 보여야 처음 몇 점의 선형성을 확인합니다. 처음 몇 점의 선형 피팅을 기반으로 선을 그립니다. 후속 포인트의 산란 강도는이 선형 추세, saturatio 이하로 떨어질 경우N가 발생했습니다. </li><li> 가포 산란을 관찰 한 후, 서서히 포화 임계치 이하의 강도를 감소시키고, 화상 동일한 GNSS 다시 비선형 행동 가역성을 위해. </li></ol> 단일 금 나노 구체의 산란 스펙트럼 4. 측정 <ol><li> 단일 GNS로부터 산란 스펙트럼을 측정하기 위해, 레이저 광원과 같은 슈퍼 - 연속 레이저를 사용한다. 레이저의 파장은 초기 450 nm 내지 1,750 nm의 범위이다. 샘플 및 광학 부품에 손상을 줄 수있는 과량의 적외선 힘을 제거하고, 가시광을 반사하는 우측 슈퍼 연속체 레이저 후에 하나 또는 두 개의 미러를 배치하고, 빔이 과잉 적외선을 수집 덤프 사용. </li><li> 레이저 스캐닝 공 초점 현미경으로 슈퍼 연속 레이저를 직접 제 2의 정렬 절차를 따르십시오. 전체 가시 범위에 걸쳐 스펙트럼 범위를 보장하기 위해 광대역에게 50/50 BS를 사용합니다. </li><li> 취득유리에 GNSS의 이미지입니다. 이미지에 하나의 GNS를 찾은 입자에 입사 광대역 빛의 초점을 고정. </li><li> 전하 결합 장치가 장착되어있는 분광계 향해 후방 산란 신호를 지시하는 PMT 앞에 반전 거울을 사용하고 상기 선택된 하나의 스펙트럼 GNS 걸릴. 여기 스펙트럼이 GNS 산란과 배경의 혼합물로 인해 다른 표면에서의 반사에 있음을주의해야합니다. </li><li> 다시 PMT 검출기로 전환 한 입자의 위치가 변경되지 않았 음을 확인하는 또 다른 이미지를 촬영합니다. 그리고, 어떤 입자가 존재하지 않는 점에 포커스를 이동. 다시 분광계로 전환 한 배경을 대표하는 또 하나의 스펙트럼을 취할. </li><li> 단일 GNS의 명확한 산란 스펙트럼을 구하는 단계 4.4 단계 4.5에서 스펙트럼으로부터 배경 스펙트럼을 뺀다. </li></ol> SAX 현미경 5. 정렬 <ol><li> 그림 3 참조이상적인 정현파 시간 변조 두 음향 광학 변조기 (버튼 확장 박스 (AOM)) 사이의 비트 주파수에서 얻을 수있다 SAX 현미경의 방식에 대한. 먼저, 다음 버튼 확장 박스 (AOM)의 요건을 충족하도록 상기 레이저 빔의 크기를 조절한다. 50/50 빔 스플리터를 이용하여 두 개의 빔으로 532 nm의 레이저 광을 분할. </li><li> 한 빔이 각 AOM을 통과하여, 두 개의 버튼 확장 박스 (AOM)을 통해 두 개의 빔을 안내합니다. 두 개의 버튼 확장 박스 (AOM)의 변조 주파수는 달라야합니다. 예를 들어, 10 kHz의 주파수 차분을 산출 40.000 MHz 및 40.010 MHz에서 다른에있을 수있다. 이 차이는 주파수 SAX 신호용 기본적인 변조 주파수 (f)의 m 것이다. </li><li> 두 버튼 확장 박스 (AOM)에서 1 차 회절 빔을 받아, 다른 50/50 빔 스플리터를 이용하여 두 개의 빔을 결합한다. 두 개의 빔을 시준하는 버튼 확장 박스 (AOM) 후 거울을 조정합니다. </li><li> 시간적 modulatio을 모니터링하는 오실로스코프에 접속되어, 광 검출기를 추가엔. 슬라이드 유리 레이저의 일부분을 분할하고,도 3에 도시 된 바와 같이, 광 검출기로 보내. 올바른 변조 빔 중첩으로, 주요 주파수 f를 m으로 도시 된 파형과 동일한 정현파 강도 변조 관찰 그림 4. 주 : 변조의 배경이 최대 변조도를 달성하기 위해 가능한 한 낮게 할 필요가있다. 게다가, 변조의 고조파 왜곡이 감소하는지 확인하기 위해 오실로스코프의 푸리에 분석 기능을 사용한다. SAX 성공적인 구현을 달성하기 위해 최소화 된 비선형 성을 가진 초기 완벽한 정현파 여진 강도 변조를 보장한다. </li><li> 오실로스코프에서 광 검출기의 전기 출력을 분리하여 종속 앰프의 레퍼런스 입력에 연결합니다. </li><li> 도 3에 도시 된 바와 같이, 이전의 프로토콜 다음 촛점 시스템에 레이저 빔을 정렬. H감수, 신호 입력으로 종속 증폭기 PMT의 전기 출력을 연결한다. </li><li> 시료로 빈 커버 유리를 사용하고, 검출기는 1 V의 판독 값 이하 선형도 5에 도시 된 바와 같이,, 서서히 여기 전력을 증가시킴으로써 전기 검출 시스템의 선형성을 확인한다. 이후의 모든 측정에서,이 값 이하로 판독을 억제하기 위해주의를 기울입니다. </li><li> 전압 신호의 절대 크기를 내보내려면 종속 증폭기의 출력을 설정합니다. 기준 채널로 설정하는 고조파 성분을 변화시킴으로써, 등등 SAX 신호, 1, 2의 진폭을 구하여. </li><li> 또한 래스터 주사 갈바 노 미러의 구동 전압 신호를 수신하는 데이터 수집 카드에 종속 증폭기의 선형 및 비선형 신호를 내보내. 사용자 정의 된 LabVIEW 프로그램의 도움으로, 잠금에 앰프와의 신호를 동기화갈바는 화상을 형성하는 거울. </li><li> 이미지에서의 신호 대 잡음비를 최적화하도록 적절 종속 증폭기의 화소 취득과 통합 시간을 선택한다. 여기의 주요 변조 주파수 (f)의 m이 10 kHz에서, 기간은 100 마이크로 초 경우, 즉 일 때, 예를 들면, 기간보다 적어도 세 배 이상으로 종속 증폭기의 적분 시간을 설정한다. 갈바 노 미러의 이동 시간을 추가 획득 속도 SAX 촬상 모드에서 초당 1500 픽셀로 설정된다. </li></ol>

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<li>Tzang, O., Pevzner, A., Marvel, R. E., Haglund, R. F., Cheshnovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-Resolution+in+Label-Free+Photomodulated+Reflectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Super-Resolution in Label-Free Photomodulated Reflectivity.</a> Nano Lett. 15 (2), 1362-1367 (2015).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

프로토콜에서, 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 샘플을 준비 할 때 먼저, 나노 입자 밀도는 입자 사이 플라즈몬 결합을 피하기 위해 너무 높은이어야한다. 두 개 이상의 입자가 서로 매우 근접 할 경우, LSPR 파장 결합 결과는 따라서 크게 비선형 성을 감소시키는, 장파장 측으로 시프트. 그러나,이 영상 법은 실제로 입자 자체 대신에, 플라즈몬 모드의 분포를 매핑한다. 따라서, 적합한 여기 파장과, 플라즈몬 모드 커플 링은 또한 강한 산란 비선형 성을 나타낼 수 향상된 해상도로 묘화 될 수있을 것으로 기대된다. 둘째, 이렇게 두 개의 버튼 확장 박스 (AOM) 사이의 박동 동기 사용, 여기 빔 내의 순수 정현파 변조를 생성하기 위해 매우 중요하다. 해상도 향상 비선형 경우, 산란 신호 변조 비선형 부분을 추출 (고조파 성분)에 의존하고 있기 때문에왜곡은 여기에서 변조 한 후 추출이 더 어려울 것이다 존재한다. 또한, 현재의 방식에서, 간섭계 설치 고해 변조를 생성하기 위해 사용되므로, 간섭계의 두 빔의 정렬은 또한 가능한 변조...

플라즈몬의 연구로 인해 다양한 분야 1-4의 응용 프로그램에 큰 관심을 끌고있다. 플라즈몬 가장 연구 분야 중 하나는, 표면 플라즈몬,되는 금속과 유전체 사이의 계면에서 외부와 전자파 전도 전자 커플 집단적 진동. 표면 플라즈몬은 서브 파장 광학, 바이오 포토닉스 및 현미경 5,6에서의 응용 가능성에 대해 탐구하고있다. 국소 표면 플라즈몬 공명 (LSPR)에 의한 금속 나노 입자의 매우 작은 체적 강전 향상뿐만 아니라 때문에 입자 크기, 입자 형상, 및 주변 매질 (7)의 유전 특성에 탁월한 감도, 광범위한 주목을 받고 -10뿐만 아니라, 때문에 본질적으로 약한 비선형 광학 효과 (11)을 높일 수있는 능력. 저 채도의 뛰어난 감도는 바이오 센싱과 가까운 헛소리에 대한 가치가있다LD 이미징 기술 (12, 13). 한편, 구조물의 플라즈몬 강화 된 비선형 광학 스위칭 및 전광 신호 처리 애플리케이션 (14, 15) 등의 광 집적 회로에 사용될 수있다. 이것은 잘 플라즈몬 흡수가 낮은 세기 레벨의 여진 강도에 정비례하는 것으로 알려져있다. 여진이 충분히 강한 경우, 흡수가 포화에 도달한다. 흥미롭게도, 높은 강도에서 흡수가 다시 증가한다. 이러한 비선형 효과는 포화 흡수 (SA) 15 ~ 17이라고 각각 포화 흡수 (RSA) (18)을 반대로한다. 그것은 LSPR 때문에, 산란 플라즈몬 구조에서 특히 강한 것으로 알려져있다. 기본적인 전자기학에 기초하여, 입사광의 산란 강도에 비해 응답은 선형이어야한다. 그러나, 나노 입자, 산란 및 흡수 밀접 Mie 이론을 통해 연결되어, 두 전자 일 수있다비유 전율의 실수 부 및 허수 부분의 관점에서 xpressed. 단일 GNS 광 조명하 다이폴로서 동작하는 것으로 가정하여, Mie 이론에 따른 단일 플라즈몬 나노 입자로부터의 산란 계수 (Q의 SCA) 및 흡수 계수 (Q의 절대치)를 19로 표현 될 수있다 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/53338/53338eq1.jpg" /> x가 2이고 πa / λ,이 구 반경이며, m은 2 ε m / ε의 D이다. 여기서, ε를 ε m 및 D는 각각 둘러싸는 금속 절연체의 유전 상수와의 대응. 산란 계수의 형태 번째 이후의 것과 유사전자 흡수 계수, 그것은 따라서 단일 플라즈몬 나노 입자 (20) 가포 산란을 관찰 할 것으로 예상된다. 최근, 고립 된 플라즈몬 입자의 비선형 포화 산란는 처음으로 21 증명되었다. 이 여진 강도가 증가 할 때 포화에서 깊은 사실 산란 강도는 약간 감소하는 것이 현저하다. 여진 강도가 산란을 포화 낳은 후에 계속 증가 할 때 더욱 현저하게, 산란 강도는 가포 리버스 20 산란의 효과를 나타내는, 부활. 파장 - 크기에 의존하는 연구는 21 산란 저 채도 및 비선형 사이에 강한 관계를 보여 주었다. 플라즈몬 산란 강도와 파장 의존성이 비선​​형 행동을 기본 공통 메커니즘을 제안 흡수의 것과 매우 유사하다. 애플리케이션의 관점에서는 물론이다 KNOWN 그 비선형 광학 현미경의 해상도를 개선하는 데 도움이됩니다. 2007에서, 포화가 여진 (SAX) 현미경은 여기 빔 (22)의 시간적 정현파 변조를 통해 포화 신호를 추출함으로써 해상도를 향상시킬 수있는 제안되었다. SAX 현미경은 레이저 초점 스폿, 강도가 주변부보다 중심에서 더 강한 개념에 기초한다. 신호 (형광 또는 산란 중)가 포화 동작을 나타내는 경우 선형 응답 주위에 남아있는 동안, 채도, 중심에서 시작해야한다. 단지 포화 된 부분을 추출하는 방법이 있으면 주변 부분을 차단하면서도 따라서, 그것은 따라서 효과적으로 공간 분해능을 향상에만 중앙부를 떠날 것이다. 원칙적으로, 깊은만큼 포화에 도달 SAX 현미경없이 낮은 해상도 한계가 있고 강한 조명에 의한 시료에는 손상이 없다. 그것은 resolutio 것으로 나타났다형광 이미징의 N 크게 SAX 기술을 이용함으로써 향상 될 수있다. 그러나, 형광 광표백 효과에서 겪고있다. 산란 비선형의 발견과 SAX의 개념을 조합 산란에 기초하여 수퍼 - 해상도 현미경 (21)을 실현할 수있다. 종래의 수퍼 - 해상도 microscopies에 비해, 산란 기반 기술은 신규 한 비 표백 조영 방법을 제공한다. 본 논문에서는 단계별 설명은 획득 및 플라즈몬 산란 비선형를 추출하기 위해 필요한 절차를 간략하게 설명하기 위해 제공된다. 입사 광량 변경에 의해 도입 비선형 산란을 식별하는 방법은 기술된다. 더 자세한 내용은 이러한 비선형 단일 나노 입자의 이미지에 영향을 미치는 방법 및 공간 해상도 것은 SAX 기술에 의해 적절히 강화 될 수있는 방법을 해명하기 위해 제공 될 것이다.

<table><tbody><tr><td>현미경 본체</td><td>Olympus, 일본</td><td>BX-51</td><td></td></tr><tr><td>대물 렌즈</td><td>Olympus, 일본</td><td>UPlanSapo, 100X, NA 1.4</td><td></td></tr><tr><td>80nm 금 콜로이드</td><td>BBI 솔루션, 영국</td><td>EM. GC80</td><td></td></tr><tr><td>supercontinuum laser</td><td>Fianium, 영국</td><td>SC400-2-PP</td><td></td></tr><tr><td>광대역 유전체 미러</td><td>Thorlabs, 미국</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>전계 방출 SEM</td><td>JEOL, 일본</td><td>JSM-6330F</td><td>옵션</td></tr><tr><td>분광계</td><td>Andor Technology, 영국</td><td>Shamrock 163</td><td></td></tr><tr><td>전하 결합 장치</td><td>Andor Technology, 영국</td><td>iDus DV420A-OE</td><td></td></tr><tr><td>음향 광학 변조기</td><td>IntraAction Corp., USA</td><td>AOM-402AF1</td><td></td></tr><tr><td>락인앰플리파이어</td><td>Stanford Research Systems, USA</td><td>SR-830</td><td></td></tr><tr><td>MAS 코팅 슬라이드 유리</td><td>Matsunami Glass, 일본,</td> <td>S9215</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 플라즈몬 나노 입자에서 비선형 산란 측정

Measurement of Scattering Nonlinearities from a Single Plasmonic Nanoparticle

Plasmonics는 광 여기로 인한 전자의 집단 진동을 기반으로 하며, 크게 향상된 국소 전기장을 포함하므로 탁월한 광학 강도를 필요로 하는 비선형 광학에 잠재적으로 응용할 수 있습니다. 플라즈모닉에서 가장 많이 연구된 비선형성 중 하나는 포화 및 역 포화 거동을 포함한 비선형 흡수입니다. 나노 입자의 산란 및 흡수는 Mie 이론과 밀접한 상관 관계가 있지만, 아주 최근까지 플라즈몬 산란의 비선형성에 대한 보고는 없었습니다. 
작년에 고립된 플라즈몬 입자에서 산란의 포화뿐만 아니라 역포화도 처음으로 입증되었습니다. 그 결과, 포화 산란은 명확한 파장 의존성을 나타내는 것으로 나타났으며, 이는 국소 표면 플라즈몬 공명(LSPR)과 직접 연결된 것으로 보입니다. 강도 의존적 측정과 결합된 결과는 산란 및 흡수의 비선형 거동을 기저에 하는 공통 메커니즘의 가능성을 시사합니다. 단일 금 나노구(GNS)에서 산란의 이러한 비선형성은 초고해상도 현미경 및 광학 스위치를 포함하여 널리 적용할 수 있습니다. 
본 논문에서는 단일 GNP에서 산란의 비선형성을 측정하는 방법과 super-resolution 기법을 사용하여 saturable scattering을 기반으로 광학 이미징 해상도를 향상시키는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 이 발견은 비선형 산란을 기반으로 하는 최초의 초고해상도 현미경을 특징으로 하며, 이는 l/8의 낮은 해상도를 달성할 수 있고 생물 의학 및 재료 연구에 잠재적으로 유용할 수 있는 새로운 비표백 대비 방법입니다.

그림 6은 80 nm의 GNS에서 측정 된 스펙트럼을 보여줍니다. Mie 이론에 기초하여 계산 된 곡선이 잘 일치를 보여주는, 같은 플롯에 제시되어있다. LSPR 피크는 580 nm의 주위이다. 다음 실험에서, 레이저는 파장이 플라즈몬 광 산란 효과를 향상시키고 포화 21 산란 활성화 플라즈몬 밴드 안에 위치로 선정 된 532 나노 미터였다. 그림 7 다른 여기 강도에 하나의 금 나노 입자의 이미지를 산란 선물 및 하단 행은 비선형 성을 강조하기 위해 각 입자의 라인 프로파일을 제공합니다. 이미지 크기는 600 나노 미터 × 600 ㎚이며, 화소 사이즈는 13.8 ㎚이다. 수집 속도가 정상 XY 촬상 모드에서 초당 234,000 픽셀이었다. 각 이미지는 신호 대 잡음비를 향상시키기 위해 다섯 이상의 인수를 평균화 하였다. 여진 강도가보다 낮을 때...

포화 및 역포화 산란은 분리된 플라즈몬 입자에서 발견되었으며 초고해상도 현미경에서 새로운 비표백 대비 방법으로 채택되었습니다. 여기에서는 비선형 산란을 검출하고 추출하는 실험 절차와 포화 여기 현미경을 사용하여 해상도를 향상시키는 방법에 대해 자세히 설명합니다.

Plasmonics, which are based on the collective oscillation of electrons due to light excitation, involve strongly enhanced local electric fields and thus ...

이 실험의 전반적인 목표는 플라스모닉 나노구조의 비선형 산란을 이용한 해상도 향상을 입증하는 것입니다. 광학 현미경 분야에서 대비(contrast)와 해상도는 가장 중요한 요소입니다. 본 기술은 대비에 기반한 새로운 산란 방식을 통해 초고해상도 영역으로 확장됩니다.이 기술의 주요 장점은 나노입자의 산란이 강하고 매우 비선형적이며 탈색되지 않는다는 점입니다. 시연은 저희 실험실의 우수한 학생인 Hsuan Lee가 진행하겠습니다.실험은 광학 벤치에서 수행됩니다. 이곳에는 현미경과 두 개의 레이저 광원이 있습니다. 첫 번째 레이저 광원은 이미징에 사용되는 532 nanometer 연속파 레이저입니다.두 번째는 분광 측정에 사용되는 슈퍼 컨티뉴엄 레이저입니다. 이것은 이미징과 분광법 모두를 위한 기본 설정의 모식도입니다. 시료는 공초점 현미경의 피에조 전기 정밀 스테이지 위에 장착됩니다.532 nm 레이저의 빛이 중성 밀도 필터를 통과합니다. 빔 분할기에 의해 유도된 빔은 갈바노 미러로 향하며, 이 미러는 공초점 현미경 대물렌즈의 초점 평면에서 래스터 스캐닝을 수행합니다. 후방 산란광은 대물렌즈에 의해 수집되어 검출기에 집중됩니다.먼저 현미경의 백색광 조명 경로를 정렬하십시오. 커러 조명(curler illumination) 아래의 할로겐 광원을 사용하십시오. 내부 조리개의 정렬 상태를 확인하려면, 접안렌즈나 CCD를 통해 팔각형의 가장자리가 뚜렷하게 보이는지 반드시 확인하십시오.다음으로, 종이 한 장을 사용하여 외부 광로를 확인합니다. 종이를 광로를 따라 이동시키며 빔 분할기에 의해 빔이 부분적으로 반사되어 레이저 방향으로 전파되는지 확인합니다. 이제 추가 정렬에 도움이 될 종이 타겟을 준비합니다.타겟은 동심원이 그려진 얇은 종이여야 합니다. 이 타겟들을 할로겐 빔과 일직선이 되도록 빔 경로를 따라 배치하십시오. 여기서는 타겟이 대물렌즈의 후방 개구부에 위치해 있습니다.이것은 광로를 따라 배치된 또 다른 타겟입니다. 다음으로, 정렬을 위해 이미징에 사용되는 532 nanometer 레이저를 켭니다. 할로겐 빔 반대편의 입사 레이저 광을 콜리메이션하는 데 종이 타겟을 활용하십시오.타겟을 제거하고 진행하기 전에 레이저 빔의 정렬을 더 세밀하게 조정하십시오. 레이저 정렬 후, 실험을 위해 준비된 금 나노구체 샘플을 준비합니다. 이 샘플은 오일에 분산된 80 nanometer 크기의 금 나노구체로 구성되어 있습니다.혼합물을 두 개의 유리 플레이트 사이에 밀봉합니다. 샘플을 현미경 스테이지에 장착하고 대물렌즈 오일을 추가하여 계속 진행합니다. 이 시점에서 이미징을 위해 검출 시스템을 준비하십시오.광학 경로 끝에 있는 광전증배관을 사용하여 산란광을 수집합니다. 광선 경로를 따라 역방향으로 20 µm 직경의 핀홀을 배치하여 초점이 맞지 않는 산란광이 광전증배관으로 들어오는 것을 차단합니다. 갈바노 미러와 광전증배관의 전원을 켜서 이미징을 진행합니다.컴퓨터 모니터를 통해 금 나노입자의 신호에 대한 후방 스캐너를 관찰하십시오. 핀홀 위치와 샘플 스테이지의 높이를 조정하여 후방 스캐너 신호를 최대화하십시오. 공초점 현미경의 정렬을 마친 후, 샘플의 산란 비선형성을 특성화하십시오.이를 위해, 우선 파워 미터를 사용하여 대물렌즈 후단의 레이저 출력을 측정하십시오. 측정값은 10 µW 미만이어야 하며, 이는 10⁴ W/cm² 미만의 여기 강도에 해당합니다. 그런 다음, 광전증배관(PMT)을 사용하여 금 나노입자의 이미지를 획득하십시오.캡처한 이미지를 이미지 분석 소프트웨어로 열어 산란 강도 프로파일을 특성화합니다. 이미지 내의 금 나노구체 중 하나를 선택하여 그 가로 방향으로 선을 긋습니다. 그런 다음, 소프트웨어의 절차에 따라 산란 프로파일을 추출합니다.프로파일을 가우시안 분포에 맞추어 이미징 시스템의 정렬 상태를 추가로 확인합니다. 이제 여기 강도를 체계적으로 스캔하기 시작합니다. 먼저, 중성 농도 필터를 변경하여 여기 강도를 높입니다.새로운 여기 강도를 결정하고 해당 강도 수준에서 후방 산란 이미지를 기록합니다. 이전과 동일하게 이미지를 사용하여 나노구체의 산란 프로파일을 추출합니다. 산란 프로파일을 도식화하고 구체 중심에서의 값을 산란 신호로 식별합니다.산란 신호와 여기 강도의 관계를 나타내는 그래프를 작성하기 위해 이 단계들을 여러 번 반복하십시오. 이 그림에서 파란색 점은 데이터를 나타내며, 빨간색 선은 다항식 피팅 결과입니다.산란 신호와 낮은 값의 들뜸 에너지 사이에는 선형 관계가 존재합니다. 이 선형 관계 아래로 신호가 떨어지는 것은 포화가 일어났음을 나타냅니다. 다음 단계는 단일 금 나노구에 대해 분광법을 수행하는 것입니다.이 모식도는 장치 구성의 개요를 제공합니다. 파장 범위가 450-1750 nanometers인 슈퍼컨티뉴엄 레이저 광원을 사용하십시오. 또한, 가시광선 영역 전체에 걸친 스펙트럼 커버리지를 확보하기 위해 광대역 50/50 빔스플리터를 사용하십시오.광전증배관 앞에 플리핑 미러를 배치하여 빛을 분광계로 유도합니다. 이 분광계에는 전하결합소자가 장착되어 있습니다. 슈퍼컨티뉴엄 레이저는 532 nanometer 레이저와 동일한 절차를 사용하여 정렬해야 합니다.슈퍼컨티뉴엄 레이저의 출력단에서 시스템의 과도한 적외선 전력을 제거하기 위해 몇 가지 예방 조치를 취하십시오. 빔을 현미경으로 보내기 전, 레이저 출력 직후의 광로에 가시광선 반사 거울을 배치하십시오. 거울과 함께 빔 덤프를 사용하여 시스템에 손상을 줄 수 있는 적외선 복사 에너지를 수집하십시오.레이저 정렬이 완료되면, 금 나노구체의 이미지를 획득합니다. 이미지를 살펴보고 연구 대상이 될 단일 나노구체를 식별합니다. 입사되는 광대역 광의 초점을 선택한 나노구체에 맞춥니다.다음으로, 분광계가 광경로 내에 있는지 확인하십시오. 이 위치에서 플리핑 미러(flipping mirror)는 입사광을 광증배관(photo multiplier tube)으로 유도합니다. 미러의 방향을 조정하여 입사광이 분광계로 향하도록 하십시오.단일 금 나노입자의 산란 스펙트럼 데이터를 수집하십시오. 본 예시와 같이, 측정된 스펙트럼은 나노구체 산란과 반사로 인한 배경 신호가 혼합된 형태가 됩니다. 스펙트럼 측정을 마친 후, 플리핑 미러를 원래 위치로 되돌리십시오.광전증배관(photo multiplier tube)을 향해 직접 빛이 가도록 조절하십시오. 금 나노입자의 위치가 변하지 않았는지 확인하기 위해 이미지를 다시 촬영하십시오. 다음으로, 광대역광(broadband light)의 초점을 입자가 없는 지점으로 이동시키십시오.거울을 다시 조정하여 분광계로 빛을 유도하고, 또 다른 스펙트럼 측정을 진행합니다. 이 새로운 스펙트럼은 배경 스펙트럼입니다. 이는 금 나노구체(gold nanosphere)의 스펙트럼에서 차감될 것입니다.금 나노구체가 포함된 스펙트럼에서 배경 스펙트럼을 차감하여 얻은 선명한 후방 산란 스펙트럼입니다. 시료의 포화 여기 현미경 관찰에는 다른 설정이 필요합니다. 이것은 포화 여기 현미경의 모식도입니다.레이저 광원은 532 nanometer 레이저입니다. 50/50 빔 분할기를 사용하여 레이저 광원에서 두 개의 빔을 생성합니다. 각 빔을 별도의 음향 광 변조기로 통과시킵니다.서로 다른 변조기 주파수는 포화 여기 신호의 변조 주파수로 사용될 맥놀이 주파수를 생성합니다. 음향 광 변조기에서 회절된 1차 빔들을 또 다른 50/50 빔 분할기로 결합하십시오. 시간적 변조를 모니터링하려면 유리 슬라이드를 사용하여 레이저 광의 일부를 광검출기로 분리하십시오.시스템을 점검하려면 광검출기를 오실로스코프에 연결하십시오. 샘플이 배치되지 않았는지 확인하십시오. 오실로스코프에서 광검출기 신호를 평가하십시오.변조와 빔 중첩이 정확하다면 신호는 비트 주파수에서 사인파 형태여야 합니다. 본 실험에서 예상되는 비트 주파수는 10 kilohertz입니다. 비선형성을 최소화하여 가능한 한 완벽한 사인파를 얻도록 노력하십시오.다음 단계는 시스템에 락인 증폭기(lock-in amplifier)를 통합하는 것입니다. 포화 여기 현미경법(saturated excitation microscopy)에서 락인 증폭기는 광검출기와 광전증배관으로부터 입력을 받습니다. 오실로스코프에서 광검출기의 출력을 분리하여 증폭기의 기준 입력(reference input)에 연결하십시오.광전증배관(photo multiplier tube)의 출력을 록인 앰플리파이어(lock-in amplifier)의 신호 입력단에 연결하십시오. 앰플리파이어의 출력을 데이터 수집 카드로 전송하십시오. 이 시점에서 시료를 현미경 스테이지에 장착하십시오.두 유리판 사이에 오일로 밀봉된 80 nanometer 금 나노구체가 포함된 동일한 샘플을 사용하십시오. 측정하는 동안 락인 앰프(lock-in amplifier)로 되돌아가십시오. 앰프가 전압 신호의 절대 크기를 출력하도록 설정하십시오.이 경우, 채널 1 디스플레이 패널에서 R"을 선택합니다. 기준 채널의 고조파 성분 설정을 변경하여 포화 여기 단일 진폭을 얻습니다. 이 컬러 이미지들은 록인 증폭기의 신호와 갈바노 모터의 구동 전압을 동기화하고 결합하기 위해 제작된 전용 소프트웨어를 사용하여 생성되었습니다.주사 전자 현미경 이미지는 비교용입니다. 해당 이미지들은 서로 다른 고조파 성분에 따른 해상도 향상을 보여줍니다. 80 nanometer 금 나노구체의 측정된 스펙트럼은 빨간색으로 표시되어 있습니다.Mie 이론을 사용하여 계산한 실선 곡선은 매우 일치하는 결과를 보여줍니다. 국소 표면 플라스몬 공명은 580 nanometers에서 나타납니다. 위의 산란 이미지와 아래의 라인 프로파일은 들뜸 강도에 따라 서로 다른 특징을 보입니다.낮은 강도에서 점 확산 함수는 표준 가우시안 프로파일을 나타냅니다. 강도가 높아지면 함수가 평탄해지고 넓어지며 이는 포화를 의미합니다. 더 높은 값에서는 중심 강도가 최대치가 아니게 되어 도넛 모양의 점 확산 함수가 나타납니다.결국, 역포화 과정 동안 중심 강도가 다시 정점에 도달하게 됩니다. 서로 다른 들뜸 강도에서의 중심 강도를 나타낸 이 그래프의 파란색 데이터 포인트는 포화 및 역포화 거동을 모두 보여줍니다. 데이터 포인트는 빨간색으로 표시된 5차 다항식으로 피팅되었습니다.이 데이터는 조화 주파수 성분을 추출하는 데 사용할 수 있습니다. 조화 성분은 락인 앰플리파이어(lock-in amplifier)를 사용하여 직접 찾을 수도 있습니다. 왼쪽 그래프는 실험 데이터입니다.오른쪽 그래프는 5차 다항식 피팅을 이용한 계산 결과입니다. 두 그래프 모두 곡선을 따라 특정 강도에서 딥(dip)이 나타납니다. 예를 들어, 2차 고조파에서 세 개의 딥이 관찰됩니다.또한 각 그래프에서 각 고조파 차수에 대해, 첫 번째 하강 지점 이후 기울기가 증가합니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행할 경우 3시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 정현파 변조의 품질, 검출 시스템의 선형성 및 시료의 기계적 안정성을 확인하는 것이 중요합니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 플라스모닉 나노구조의 비선형 산란을 기반으로 한 해상도 향상을 달성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 초고해상도 현미경 분야의 연구자들이 다른 기본적인 빛-물질 상호작용에서 새로운 대비(contrast)를 탐구할 수 있는 유망한 샘플을 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Engineering

공학

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배우세요 플라즈몬 나노구조체의 비선형 산란을 활용한 초해상도 현미경 기법으로 해상도 향상 방법을. 이 기술은 광학 현미경의 대비와 해상도 한계를 극복하는 새로운 비블리칭 대비 방식을 제공합니다.

단일 플라즈몬 나노 입자에서 비선형 산란 측정

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