Optogenetic 기능 MRI

이 영상 기법의 전반적인 목표는 f-MRI와 광유전학적 자극을 결합하여, 살아있는 뇌 전체에 걸쳐 기능적 신경 회로 및 그 역동성을 세포 유형별로 매핑하는 것입니다. 이 방법은 특정 뇌 회로 요소가 전뇌 활동을 유도하는 데 어떤 역할을 하는지 결정하는 것과 같이 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 유형별 자극이 가능하며, 전뇌 활동을 상대적으로 높은 공간 해상도로 판독할 수 있다는 점입니다.

이 절차는 제 실험실의 대학원생인 Jia Liu와 Zhongnan Fang이 시연하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 동물을 마취한 후, 전기 면도기로 머리를 깎고 Betadine과 70% ethanol 린스를 사용하여 피부에 3중 외과적 세척을 실시합니다. 다음으로, 정위 고정 장치에 동물의 두개골을 고정합니다.

메스로 두피 중앙선을 따라 15에서 20mm 길이로 절개합니다. 골막에 외과용 지혈鉗(hemostats)를 부착하여 두피를 젖힙니다. 두개골에서 람다(Lambda)와 브레그마(Bregma)의 위치를 확인한 다음, 드릴 비트를 관심 영역(ROI) 위에 위치시킵니다.

치과용 드릴을 사용하여 뇌를 뚫지 않도록 주의하면서 관심 영역(ROI) 위에 작은 천공술을 실시합니다. 마이크로리터 시린지가 연결된 바늘을 천공 부위를 통해 뇌의 ROI로 천천히 삽입합니다. 그 다음 마이크로시린지 펌프 컨트롤러를 사용하여 2 µL의 벡터 용액을 ROI에 주입합니다.

주입이 완료되면 10분 동안 기다린 후, 분당 0.5 mm의 속도로 서서히 주사기를 제거합니다. 주입 후 두개골 표면을 건조시킵니다. ROI 좌표를 확인하고 페룰 임플란트를 분당 0.5 mm의 속도로 목표 깊이까지 삽입합니다.

마지막으로, 치과용 시멘트를 사용하여 페룰 임플란트를 두개골에 고정합니다. 치과용 시멘트가 응고되면 치과용 시멘트 캡 주변의 절개 부위를 봉합사로 봉합합니다. 먼저 광섬유 패치 케이블을 레이저 광원에 연결하고, 파워 미터를 사용하여 패치 케이블 배럴 끝단의 출력을 측정합니다.

뇌 내부에 삽입된 광섬유 케이블 팁에서 원하는 출력이 나오도록 적절한 출력 레벨을 조정하십시오. 동물의 눈을 가려 임플란트로부터 빛이 새어 나오는 것을 방지하십시오. 그런 다음, 동물의 머리 위에 코일을 배치하십시오.

페룰 슬리브를 사용하여 광섬유 케이블을 페룰 임플란트에 컵 형태로 고정합니다. 동물이 들어 있는 크레이들을 스캐너의 보어(bore) 안에 삽입합니다. 인공 호흡기를 조정하여 생리적 수치를 적정 범위 내로 유지함으로써, 실험 전반에 걸쳐 호흡률, 조석 CO2 및 체온을 모니터링합니다.

MRI 스캐너의 트리거 포트에서 함수 발생기로 BNC 케이블을 연결하십시오. 포지셔닝 시퀀스를 선택하고 조작 창에서 'scan'을 클릭하십시오. 'continue'를 클릭하여 동물의 머리 위치를 영상화하십시오.

뇌가 등중심(isocenter)에 위치하지 않은 경우, 동물의 머리 위치를 조정하고 뇌가 등중심에 올 때까지 포지셔닝 스캔을 반복하십시오. 뇌의 전반적인 무결성을 확인하고 광섬유 임플란트의 위치를 확인하기 위해 고해상도 해부학적 영상을 획득하십시오. 그 다음, T2 강조 시퀀스를 선택하십시오.

슬라이스 수를 조절한 후, 'scan'을 클릭하여 T2 강조 고해상도 관상면 해부학적 영상을 획득합니다. 마지막으로 다중 슬라이스 gradient recalled echo-sequence를 선택한 다음, 'continue'를 클릭하여 기능적 영상을 획득합니다. 이 프로토콜은 동물 모델의 운동 피질을 자극하기 위해 광유전학적 fMRI를 사용합니다.

이 활성화 맵은 운동 피질과 시상에서 활성화된 복셀을 보여주며, 이는 두 영역 간의 장거리 시냅스 연결을 나타냅니다. 여기에서는 운동 피질의 광유전학적 자극 동안 운동 피질과 시상에서 활성화된 복셀이 굵은 신호로 표시되어 있습니다. 시상의 혈역학적 반응 함수는 자극 후 운동 피질의 반응에 비해 지연된 반응을 보여줍니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 이식 수술 및 광유전학적 기능적 자기공명영상(fMRI) 수행 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙련되면 이 영상 촬영 절차는 2시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 동물을 세심하게 관찰하고 생리학적 상태를 정상 범위 내로 유지하는 것이 매우 중요합니다.

이 절차 이후에, 신경 활동의 시간적 역동성을 조사하기 위한 전기생리학이나 옵신의 발현 및 특이성을 검증하기 위한 면역조직화학법과 같은 보완적인 방법을 사용할 수 있습니다. 이 기술의 개발은 신경과학자들이 살아있는 온전한 뇌에서 기능적 연결성을 조사할 수 있는 길을 열어주었습니다. MRI 스캐너를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.

본 절차를 수행하는 동안에는 자기 장비를 스캐너로부터 충분히 멀리 떨어뜨려 놓는 것과 같은 주의 사항을 항상 준수해야 합니다.