광유전학적으로 표적화된 전뇌 회로의 레이저 스캐닝 광자극

본 절차의 전반적인 목적은 현대적인 광유전학 기술을 적용하여 인비트로(in vitro) 슬라이스 표본 내의 표적 신경 경로를 광자극하는 것입니다. 이는 먼저 관심 있는 신경 세포주에 channel rhodopsin을 발현시킴으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 연구 대상이 되는 관련 뇌 구조의 급성 슬라이스 표본을 제작하는 것입니다.

다음 단계는 채널 로돕신(channel rhodopsin)을 발현하는 섬유의 광자극에 반응하여 슬라이스 표본 내 뉴런의 반응을 기록하는 것입니다. 마지막 단계는 채널 옵신(channel opsin)을 발현하는 뉴런과 섬유의 분포를 이미지화하는 것입니다. 궁극적으로, 이 접근 방식은 광유전학적으로 표적화된 신경 구성 요소에 대한 레이저 스캐닝 광자극을 사용하여 신경 회로의 기능적 지형도와 시냅스 특성을 평가할 수 있게 합니다.

기존의 전기 자극 방식과 비교하여 이 기술이 갖는 주요 장점은 특정 신경세포 유형을 선택적으로 표적화하여 자극할 수 있으며, 이들의 장거리 투사 경로를 in vitro에서 관찰할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 복잡한 신경망의 기능적 조직과 같은 시스템 신경과학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 형질전환 효율을 높이기 위해 mL당 4 µg의 poly가 포함된 바이러스 용액을 주입할 주사기와 바늘을 준비하십시오.

그 후 시린지 펌프를 사용하여 용액 200 nanoliters를 압력 주입합니다. 2~3주가 지나면 채널 로드 Dossin 슬라이스에서 적절한 발현이 나타날 것입니다. 조편 준비는 가능한 한 신속하게 수행해야 합니다. 주입된 뇌를 적출한 후, 깨끗한 면도날을 사용하여 원하는 방향으로 뇌 블록을 만듭니다. 다음으로, 뇌의 블록 처리된 표면을 순간접착제를 사용하여 커팅 스테이지에 고정합니다.

그 후 스테이지를 냉동고로 냉각된 진동 절단 챔버로 옮기고, 얼음처럼 차가운 A CSF를 절단 챔버에 붓습니다. 바이브톰(vibrotome)을 사용하여 뇌 절편을 4~500 µm 두께의 절편으로 자릅니다. 뇌 절편을 산소가 공급되는 유지 챔버로 옮기고, 실험을 진행하기 전 최소 1시간 동안 30 °C에서 배양합니다.

실험을 시작할 준비가 되면, 뇌 절편을 전기생리학적 기록 장치의 스테이지로 옮깁니다. 표준 전세포 패치 클램프(whole cell patch clamp) 기술을 사용하여 뉴런을 기록합니다. 피펫에 양압을 가하면서 기록용 피펫을 뉴런 근처에 짧게 위치시킵니다.

세포와 접촉시킨 후, 압력을 해제하고 흡입을 가하여 기가실(giga seal)을 형성합니다. 그다음 짧게 흡입을 가해 세포막을 파괴하여 whole cell 구성으로 만든 후, 전압 클램프 또는 전류 클램프 모드에서 기록을 수행합니다. 레이저 스캐너는 tidal wave 또는 EFAs 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 작동시키십시오.

레이저 출력을 제어하기 위해 사용 전 소프트웨어를 포토다이오드에 맞게 보정해야 합니다. 레이저 경로에 가변 중성 밀도 휠을 배치합니다. 휠을 회전시켜 후초점면(back focal plane)에서 측정함으로써 레이저 출력을 조절합니다.

출력은 일반적으로 25에서 D milliwatts 사이로 설정합니다. 셔터의 펄스 파라미터는 소프트웨어 내에서 자극의 길이와 타이밍을 제어합니다. 자극할 영역의 이미지는 비디오 캡처 기능을 통해 생성할 수 있습니다.

다음으로, 80 micron 간격의 16 by 16 그리드와 같이 자극 그리드를 설정합니다. 그런 다음 획득한 이미지 위에 그리드를 겹치고 XY 좌표와 오프셋 정도를 조정하여 자극을 시작하기 위한 방향을 최적화합니다. 맵 기능을 활성화합니다.

데이터는 보존되어 tidal wave의 오프라인 분석 프로그램을 통해 분석하거나, EFAs 소프트웨어의 맵 분석 프로그램을 사용하여 분석할 수 있습니다. 슬라이스에서 생리학적 기록을 완료한 후, YFP 태그가 부착된 채널 옵신의 발현 패턴을 기록할 수 있습니다. 먼저, 4°C에서 0.01 M PBS 내 4% PFA로 슬라이스를 하룻밤 동안 고정하십시오.

다음 날, 슬라이스를 30% sucrose 4% PFA 용액으로 옮겨 하룻밤 동안 동결 보호 처리합니다. 그다음 날, 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 슬라이스를 50 micron 두께로 절편합니다. 절편을 PBS로 헹군 후, 공초점 현미경으로 이미징하기 위해 항퇴색제(anti fade medium)와 함께 마운팅합니다.

백색광으로 관심 영역을 찾은 후, 514 nanometer 흥분 파장과 527 nanometer 방출 파장을 사용하십시오. 흥분성 글루타메이트 작동성 뉴런에서 channel rod Dobson의 발현을 유도하는 YFPA 바이러스 구조체 EYFP를 시각화하기 위해, 이를 BSY 마우스의 일차 시각 피질에 주입하였습니다.

바이러스 발현은 일차 및 이차 시각 피질 사이의 경로와 LGN의 피질-시상 섬유에서 발견되었습니다. 별표로 표시된 이차 시각 피질 뉴런의 전체 세포 패치 클램프 기록 결과 e PSC가 나타났습니다. 채널 로돕신의 레이저 스캐닝 광자극 이후, V2 하층에서 채널 로돕신을 발현하는 섬유와 일차 체성감각 피질 6층에서 유래한 피질-시상 투사 경로가 확인되었습니다. 복측 후핵은 CRE LAX 접근법을 사용하여 6층 피질-시상 뉴런 및 그 투사 경로에 채널 로돕신을 발현시켜 연구하였습니다. 예상대로 CRE 형질전환 마우스에 flp-AAV 구조체를 도입하여 형질전환시킨 결과, 표적이 된 6층 뉴런과 4층까지 뻗어 있는 섬유에서 채널 로돕신 발현이 나타났습니다.

Channelrhodopsin-2 EYFP 발현은 VP로 투사되는 섬유에서도 확인되었으며, VP 뉴런의 생리학적 기록이 수행되었습니다. whole-cell patch clamp를 이용한 분석 결과, 별표로 표시된 기록 뉴런 인근에서 광자극을 주었을 때 ePSC가 유도될 수 있음이 밝혀졌습니다. 오프라인 분석은 VP에서 광자극에 대한 평균 반응 진폭을 보여줍니다. Channelrhodopsin-2 EYFP를 발현하는 6층 피질-시상 뉴런의 50 µm 두께 절편을 분석한 결과, 6층에서 4층으로 가로지르는 라벨링된 섬유의 미세한 패턴이 나타났으며, 이들은 4층에서 종단되어 광범위하게 분지되었습니다.

또한, 피질시상 섬유가 백질로 진입하여 시상 방향으로 가로지르는 것이 관찰되었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 인비트로(in vitro) 절편 표본에서 표적 신경 경로를 광자극하기 위해 현대적인 광유전학 기술을 적용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 본 절차와 관련된 보정 단계를 수행할 때 레이저 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.

보호 안경을 착용하십시오.