광유전학적으로 표적화된 전뇌 회로의 레이저 스캐닝 광자극

이 절차의 전반적인 목표는 시험관 내 슬라이스 제제에서 표적 신경 경로를 사진 자극하기 위해 현대 광유전학 기술을 적용하는 것입니다. 이는 관심 신경 세포주에서 채널 막대 Dossin을 먼저 발현함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 연구 할 관련 뇌 구조를 급성 절편으로 준비하는 것입니다.

다음 단계는 섬유를 발현하는 채널의 광 자극에 대한 반응으로 슬라이스 준비에서 뉴런의 반응을 기록하는 것입니다. 마지막 단계는 뉴런과 섬유를 발현하는 채널 옵신의 분포를 이미지화하는 것입니다. 궁극적으로 이 접근 방식은 광유전학적으로 표적화된 신경 구성 요소의 레이저 스캐닝 광 자극을 사용하여 신경 회로의 기능적 지형 및 시냅스 특성을 평가할 수 있습니다.

전통적인 전기 자극 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 특정 신경 세포 유형을 구체적으로 표적으로 삼고 자극하며 체외에서 장거리 투영을 검사할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 복잡한 전쟁 소켓의 기능적 조직과 같은 시스템 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 주사기와 바늘을 준비하여 트랜스펙션을 향상시키기 위해 폴리 1밀리리터당 4마이크로그램이 포함된 바이러스 용액을 주입합니다.

그런 다음 주사기 펌프를 사용하여 용액 200 나노 리터를 압력 주입하고 2-3 주 후에 채널 막대 Dossin 슬라이스의 적절한 발현이있을 것입니다. 준비는 가능한 한 빨리 수행해야 합니다 주입된 뇌를 제거한 후 깨끗한 면도날을 사용하여 원하는 방향으로 뇌 블록을 만듭니다. 다음으로, 즉석 접착 접착제를 사용하여 뇌의 막힌 표면을 절단 단계에 부착합니다.

그런 다음 스테이지를 냉동고 냉각 비브람 절단 챔버로 옮기고 얼음처럼 차가운 A CSF를 절단 챔버에 붓습니다. 바이옴을 사용하여 뇌 부분을 4개에서 500미크론 두께의 부분으로 자릅니다. 뇌 조각을 산소가 공급되는 보관실로 옮기고 실험을 진행하기 전에 최소 섭씨 30도에서 한 시간 동안 배양하도록 합니다.

실험을 시작할 준비가 되면 뇌 절편을 전기생리학적 기록 장비의 단계로 옮깁니다. 표준 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 뉴런을 기록합니다. 기록 피펫을 뉴런 옆에 잠시 배치하면서 피펫에 양압을 가합니다.

셀과 접촉한 후 압력을 해제하고 흡입을 가하여 기가 씰을 형성합니다. 그런 다음 전체 세포 구성을 위해 멤브레인을 분리하기 위해 간단한 흡입을 적용하고 전압 또는 전류 클램프 모드에서 녹음합니다. 해일 또는 EFA 데이터 수집 소프트웨어로 레이저 스캐너를 작동하십시오.

레이저의 출력을 제어하기 위해 사용하기 전에 소프트웨어를 포토 다이오드에 맞게 보정해야 합니다. 가변 중립 밀도 휠이 해당 경로에 배치됩니다. 휠을 회전하면 후면 초점면에서 측정하여 레이저의 출력을 조정합니다.

전력은 일반적으로 25밀리와트에서 D 밀리와트 사이로 설정됩니다. 셔터의 펄스 매개변수는 소프트웨어에서 자극의 길이와 타이밍을 제어합니다. 자극할 영역의 이미지는 비디오 캡처 기능에서 만들 수 있습니다.

다음으로, 80미크론 간격의 16 x 16 그리드와 같은 자극 그리드를 설정합니다. 그런 다음 획득된 이미지에 그리드를 오버레이하고 XY 좌표와 오프셋 정도를 조정하여 방향을 최적화하여 시뮬레이션을 시작합니다. map 함수를 활성화합니다.

데이터는 유지되며 해일에서 오프라인 분석 프로그램을 사용하여 분석하거나 EFA 소프트웨어의 지도 분석 프로그램을 사용하여 분석할 수 있습니다. 슬라이스에 대한 생리학적 기록을 완료한 후 YFP 태그 채널 옵신의 발현 패턴을 문서화할 수 있습니다. 먼저, 섭씨 4도에서 0.01 몰 PBS의 4% PFA로 밤새 슬라이스를 고정합니다.

다음 날, 하룻밤 극저온 보호를 위해 슬라이스를 30%슈크로오스 4%PFA 용액으로 옮깁니다. 다음 날, 저온 유지 장치에서 슬라이스의 50미크론 섹션을 자릅니다. PBS에서 절편을 헹구고 컨포칼 현미경에서 페이드 방지 매체로 이미징하기 위해 장착합니다.

백색광에서 관심 영역을 찾은 후 514 나노미터 여기 파장과 527 나노미터 방출 파장을 사용합니다. 채널 막대 Dobson, EYFP.의 발현을 유도하는 YFPA 바이러스 구조를 이미지화합니다. 흥분성에서 글루타메이터성 뉴런을 BSY 마우스의 1차 시각 피질에 주입했습니다.

바이러스 발현은 1차 시각 피질과 2차 시각 피질 사이의 트랙과 LGN 전체 세포 패치 클램프의 피질 시상 섬유에서 발견되었으며, 별에 의해 표시된 2차 시각 피질의 뉴런에서 기록한 e PSC가 밝혀졌습니다. 채널의 레이저 스캐닝 광 자극에 이어, 1차 체성 감각 피질의 6층에서 V 2개의 코르티코 시상 돌기의 하층에서 섬유를 발현하는 막대 Dossin. 복부 후핵은 CRE LAX 접근법을 사용하여 6층 코르티코 시상 뉴런에서 채널 로드 도신을 발현하고, 예상대로 돌기에서 CRE 형질전환 마우스로 플록된 a V 구조체에 의한 형질주입은 표적 레이어 6 뉴런 및 이들의 섬유가 레이어 4로 확장되는 채널 로드 도신 발현을 초래했습니다.

채널 막대 Dobson, EYFP 발현은 VP 뉴런에서 VP 생리학적 기록으로 투영되는 섬유에서도 관찰되었습니다. 전체 세포 패치 클램프를 사용하여 별에 의해 표시된 기록된 뉴런 근처에서 광 자극을 받은 후 e PSC를 유도할 수 있음을 밝혔습니다. 오프라인 분석은 VP의 광 자극에 대한 평균 반응 진폭을 묘사합니다 절제된 6층 코르티코 시상 뉴런 50미크론 슬라이스 발현 채널 Rodin EYFP는 6층에서 4층으로 횡단하는 표지된 섬유의 미세한 패턴을 보여주었습니다.

또한, 코르티코 시상 섬유(cortico thalamic fibers)가 백질로 들어가 시상(thalamus)을 향해 횡단하는 것이 관찰되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 시험관 내 절편 제제에서 표적 신경 경로를 사진 자극하기 위해 현대 광유전학 기술을 적용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 레이저로 작업하는 것은 이 절차와 관련된 보정 단계를 수행할 때 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

보호 안경을 착용하십시오.