Name: 광유전학적으로 표적화된 전뇌 회로의 레이저 스캐닝 광자극 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 배우세요 광유전학적 레이저 스캐닝 광자극을 이용한 전뇌 회로의 기능적 토포그래피와 시냅스 특성 평가 방법입니다. Channelrhodopsin을 활용한 특정 신경세포 타겟팅과 장기 투사경로 분석이 가능합니다.

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이 작업은 NIH/NIDCD 보조금 R03 DC 011361, SVM CORP 보조금 LAV3202, NSF-LA EPSCoR 보조금 PFUND86 및 Leica Microsystems(CCL) 및 NIH/NIDCD 보조금 R01 DC 008794(SMS)의 출판물 보조금의 지원을 받았습니다.

1. 수술과 주사
<ol>
	<li>케타민(100-120mg/kg)과 자일라진(7.5-16mg/kg)의 복강내 주사(22-25G 바늘 권장)를 사용하여 마우스를 마취합니다.
	<ol>
		<li>반응이 나타나지 않을 때까지 강한 발가락 꼬집음을 사용하여 진정제를 평가합니다. 설명된 모든 동물 절차에 대해 필요에 따라 현지 IACUC 지침을 따르도록 수정하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>진정된 마우스를 입체 장치에 놓고 머리와 귀를 각각의 홀더에 고정합니다.
	<ol>
		<li>멸균 안과 연고로 동물을 정위 장치에 넣기 전에 눈을 윤활하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>면도기로 두피를 면도하고 베타딘 면봉으로 해당 부위를 소독합니다.</li>
	<li>메스를 사용하여 정중선 절개를 자르고 주사 부위 위의 피부와 기저 근육을 반사시킵니다.</li>
	<li>메스 날을 트레핀처럼 회전시켜 노출될 부위 위에서 개두술을 수행합니다. 또는 Dremel에 부착된 작은 드릴 비트를 사용하여 개두술을 수행합니다.
	<ol>
		<li>개두술을 수행하려면 메스 날이나 드릴 비트를 두개골 표면에 놓고 아래의 피아 마터가 드러날 만큼 충분한 뼈가 굴착될 때까지 천천히 회전합니다.</li>
		<li>초기 굴착이 이루어지면 미세한 집게를 사용하여 개두술을 확대하여 가장자리에서 뼈를 조심스럽게 제거합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1μl 주사기에 주입할 바이러스 용액을 채웁니다(UNC Vector Core).
	<ol>
		<li>transfection 효능을 향상시키려면 4 μg/ml 폴리브레렌으로 바이러스 용액을 준비합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>주사 부위로 바늘을 내리고 주사기 펌프로 바이러스가 포함된 용액 200nl을 압력 주입합니다.
	<ol>
		<li>주사기를 10분 동안 그대로 두었다가 바늘을 빼냅니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>흡수되지 않는 모노필라멘트 나일론으로 피부를 봉합하고 절개 부위를 항생제 연고로 덮습니다.
	<ol>
		<li>봉합사는 7-10일 후에 제거해야 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>수술 후 진통제를 위해 부프레노르핀(0.05-0.1 mg/kg)을 주사합니다.</li>
	<li>동물이 수술 후 14-21일 동안 회복할 수 있도록 하여 채널 로돕신이 적절하게 발현될 수 있도록 합니다.</li>
</ol>
2. 슬라이스 준비
<ol>
	<li>회복 기간이 끝나면 뒷발 및/또는 발가락이 단단히 조여졌을 때 금단 반사가 없는 것으로 확인된 바와 같이 이소플루란 마취로 동물을 깊이 마취합니다.</li>
	<li>참수로 뇌를 절개한 다음 두개골의 정중선과 정면을 절개합니다.</li>
	<li>뇌를 노출시키기 위해 정중선에서 두개골을 떼어냅니다.</li>
	<li>미세한 스쿱 주걱을 사용하여 뇌 신경과 뇌 기저부를 분리하여 조심스럽게 뇌를 제거합니다.</li>
	<li>절개된 뇌를 차갑고 얼음처럼 차가운 인공 뇌척수액(ACSF, mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 25 NaHCO3, 25 포도당)이 들어 있는 작은 100ml 비커에 빠르게 넣습니다.</li>
	<li>ACSF에서 뇌를 제거하고 ACSF가 미리 적신 여과지로 덮인 현미경 슬라이드에 놓습니다.</li>
	<li>깨끗한 면도날을 사용하여 원하는 방향으로 뇌를 차단하여 절단합니다.</li>
	<li>뇌의 막힌 표면을 순간 접착 접착제를 사용하여 절단 단계에 부착합니다.</li>
	<li>스테이지를 비브라톰 절단 챔버로 옮깁니다(절단 준비가 될 때까지 냉동실에 보관).</li>
	<li>얼음처럼 차가운 ACSF를 절단 챔버에 붓습니다.</li>
	<li>진동 조직 슬라이서를 사용하여 400-500 μm에서 뇌 절편을 절단합니다.</li>
	<li>뇌 절편을 산소가 공급된 ACSF가 함유된 보관 챔버로 옮기고 실험 전 최소 1시간 동안 30°C에서 배양합니다.</li>
</ol>
3. 생리학적 기록
<ol>
	<li>배양 기간이 끝나면 변형된 현미경 스테이지의 기록 챔버로 슬라이스를 옮깁니다.</li>
	<li>백금 와이어 슬라이스 홀더에 부착된 몇 개의 나일론 필라멘트 실을 사용하여 실험 중 수조에 슬라이스를 고정합니다.</li>
	<li>ACSF로 슬라이스를 지속적으로 관류합니다.</li>
	<li>127 K-글루코네이트, 3 KCl, 1 MgCl2, 0.07 CaCl2, 10 HEPES, 2 Na2-ATP, 0.3 Na-GTP, 0.1 EGTA를 포함하는 세포 내 용액으로 충전했을 때 기록 피펫을 3-6 MΩ의 팁 저항으로 당깁니다. 세포 내 용액은 pH 7.3을 가져야 하며 KOH 또는 글루콘산으로 조정되고 삼투압은 280-290mOsm이어야 합니다.</li>
	<li>표준 시각화 된 전체 세포 기록 설정을 사용하여 양압22,23을 가하면서 기록 할 뉴런 근처에 기록 피펫을 놓습니다.</li>
	<li>Gigaohm 씰을 형성하기 위해 흡입을 가하는 동안 양압을 해제합니다.</li>
	<li>짧은 흡입을 가하여 멤브레인을 절단하고 전체 세포 구성 기록을 형성합니다.</li>
	<li>전압 또는 전류 클램프에 뉴런의 반응을 기록합니다.</li>
</ol>
4. 레이저 스캐닝 광자극
<ol>
	<li>이전 보고서23-29. 에 설명된 대로 데이터 수집 소프트웨어 및 하드웨어 시작
	참고: 우리는 Matlab으로 작성되고 Janelia Farms30의 Karel Svboda 실험실에서 개발한 Tidelwave26 수집 프로그램과 최근에는 Ephus26 수집 프로그램을 모두 활용했습니다. Ephus의 레이저 스캐닝 광자극에 대한 자세한 설명은 Suter et al.을 참조하십시오.26 및 단계별 가이드30. 
	참고: 이 기사에서 설명하는 설정은 Shepherd (2012)23에서 설명한 설정에서 파생되었습니다. 레이저 빔은 미러의 개방 빔 시스템을 통해 대물 렌즈를 통해 현미경의 상단 포트로 슬라이스로 유도됩니다(그림 2).</li>
	<li>레이저 경로에 배치된 현미경 커버슬립을 사용하여 레이저의 작은 부분을 포토다이오드로 전환하고 이 포토다이오드의 전류 출력을 사용하여 실험 중 레이저 강도를 모니터링합니다.
	<ol>
		<li>장비 설정23 중에 파워 미터를 사용하여 대물렌즈의 후면 초점면에서 측정된 레이저 출력으로 소프트웨어에 기록된 포토다이오드 전류 출력을 보정합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>가변 neutral density wheel을 회전시켜 레이저 출력을 제어합니다. 실험에서 사용된 레이저 출력은 25-70mW(후방 초점면에서) 사이에서 다양했습니다.</li>
	<li>레이저와 셔터에 대한 펄스 매개변수를 수정하여 레이저 자극의 길이와 타이밍을 설정합니다. 레이저 자극의 길이는 일반적으로 2msec입니다.</li>
	<li>'Grab Video' 기능을 사용하여 자극할 영역의 이미지를 캡처합니다.</li>
	<li>원하는 치수에 따라 자극 그리드를 선택합니다. 일반적으로 인접한 행과 열 사이에 80μm 간격의 16 x 16 자극 어레이를 사용합니다.</li>
	<li>매핑 그리드를 획득한 이미지와 오버레이하고 x, y 및 각도 오프셋을 원하는 위치와 방향으로 조정합니다.</li>
	<li>'매핑' 기능을 활성화하여 데이터 시뮬레이션과 수집을 시작합니다.</li>
	<li>광자극 유발 반응을 획득한 후, Tidelwave25의 오프라인 지도 분석 프로그램 또는 Ephus26의 'MapAnalysis' 프로그램을 사용하여 매핑된 데이터의 분석을 수행합니다.</li>
</ol>
5. 고정 슬라이스 이미징
<ol>
	<li>기록 후 4ºC에서 하룻밤 사이에 0.01M PBS(pH7.4)의 4% 파라포름알데히드(PFA)로 뇌 슬라이스</li>를 전달합니다.
	<li>4ºC에서 하룻밤 동안 4% PFA/0.01M PBS의 30% 자당으로 슬라이스를 옮깁니다.</li>
	<li>저온 유지 장치를 사용하여 50μm 절편을 절단하고 0.01M PBS에 수집합니다.</li>
	<li>실온에서 0.01M PBS로 섹션을 두 번 헹굽니다.</li>
	<li>섹션과 커버슬립을 적절한 퇴색 방지 매체에 장착하십시오.</li>
	<li>단면을 컨포칼 현미경으로 전송합니다.</li>
	<li>백색광을 사용하여 ROI에 집중합니다.</li>
	<li>이미지 획득을 위한 파장, 이미징 크기 및 반복 횟수를 선택합니다. YFP의 경우 514nm(Ex)/527nm(Em)를 사용합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자들은 경쟁하는 이해관계가 없음을 선언합니다.
저자(CCL)는 이 프로토콜의 촬영에 사용되는 장비를 생산하는 Leica Microsystems로부터 출판 보조금을 받았습니다.

설명된 프로토콜은 전뇌 회로, 즉 시상 및 피질의 회로의 조사에 국한되지 않는 신경 회로의 기능적 지형 및 생리학의 시험관 내 평가를 위한 접근법을 자세히 설명합니다. 광유전학적 형질감염을 위한 여러 바이러스 구조가 과학계에 제공되었으며 UNC 벡터 코어에서 쉽게 얻을 수 있습니다. 쉽게 구할 수 있는 바이러스 구조에 대한 설명은 UNC 벡터 코어31, 스탠포드 대학32의 Deisseroth 연구소 및 MIT33의 Boyden 합성 신경생물학 연구실의 광유전학 리소스 페이지를 참조하십시오. 이러한 옵신의 변종은 이러한 실험실에서 개발되었으며 신경 흥분성을 제어하기 위한 광범위한 모드를 가능하게 합니다1,2. UNC 벡터 코어에서 이러한 벡터를 얻으려면 원래 실험실의 재료 이전 계약이 필요합니다. 이 프로토콜에서 우리는 폴리브렌의 첨가가 형질감염 효능을 향상시킨다는 점에 주목합니다. 또한, 발현에 영향을 미치는 또 다른 변수는 수술 후 회복 기간으로, 마우스의 전뇌 경로에서 강력한 발현을 얻기에는 최소 14일의 기간으로 충분하다는 점에 주목합니다.
특정 뉴런 그룹의 표적 형질감염을 위해 개발된 'floxed' 반전 개방형 판독 프레임 바이러스 구조물과 함께 사용할 수 있는 여러 Cre-형질전환 마우스 계통이 개발되었습니다11. 신경과학 연구와 관련된 여러 균주는 돌연변이 마우스 지역 자원 센터34를 통해 사용할 수 있습니다. 이러한 형질전환 계통에서 Cre-재조합효소 발현 패턴의 아틀라스는 GENSAT 데이터베이스(35)를 통해 제공된다. 또한 Jackson Labs는 여러 Cre-형질전환 균주와 특정 신경 그룹에서 옵신을 구성적으로 발현하는 다른 균주를 제공합니다. 이러한 마우스 계통을 활용하는 중요한 단계는 번식 군집을 확보하고 확립하는 데 필요한 시간을 고려하는 것이며, 이는 관심 있는 특정 계통에 따라 달라질 수 있습니다.
광자극을 위해 우리는 최근 프로토콜29에 설명된 Northwestern University의 Shepherd Lab에서 개발한 설정을 활용하고 조정했습니다. 글루타메이트 언케이징에 최적화되어 있지만 이 설정은 수정 없이 채널로돕신의 광자극에도 적합합니다. 이 설정은 광자극 유전자좌의 정확한 공간 제어 및 위치 지정을 가능하게 하여 기록된 뉴런의 채널로돕신 신경 분포의 기능적 지형을 평가할 수 있습니다. 공간 제어는 이러한 광자극 방법으로 향상되지만, LED 기반 필드 조명(20)을 이용하는 방법보다 비용이 더 많이 든다. 또한 뇌 조직의 불균일성은 광유전학 또는 빛 조작과 관련된 모든 기술의 한계입니다. 그러나 실제로는 결과가 대부분 정성적 방식으로 해석되기 때문에 요인이 되는 경우는 거의 없습니다. 뇌 영역 간의 보다 정량적인 비교가 필요한 경우 항상 최대 광도를 사용하여 "포화된" 반응을 달성할 수 있습니다.
또한, 우리는 레이저 스캐닝 광자극 및 데이터 수집을 제어하기 위해 Matlab으로 작성된 Tidelwave 및 Ephus 소프트웨어 프로그램을 모두 사용했습니다25,26. 그러나, 유사한 시스템을 설정하는 이들은 Janelia Farms 개발 사이트(30)를 통해 이용할 수 있는 지원을 갖는 새로운 Ephus 소프트웨어(26)를 사용하는 것이 권장된다. 핵심 단계는 하드웨어 요구 사항이 약간 다르기 때문에 사용할 소프트웨어 패키지를 선택하는 것입니다. 또한 지도 분석 프로그램은 각각의 데이터 수집 프로그램에 맞게 조정됩니다.
이러한 단계 중 일부는 의사의 특정 설정에 맞게 수정할 수 있습니다. 바이러스 용액의 주입은 주사기 이외의 전달 메커니즘을 사용하여 수행할 수 있으며, 예를 들어 ~40μm의 팁 직경으로 당겨진 모세관 유리 피펫도 잘 작동합니다. 수술의 경우, 주사 안내에 이러한 좌표가 필요하지 않은 경우 비정위 고정 헤드홀더를 대체할 수 있습니다. 또한, ACSF 및 세포내 용액 조성물은 특정 실험 요구 사항에 따라 변경될 수 있으며, 예를 들어, 억제 전류를 분리하기 위해 세슘 또는 고염화물 세포내 용액을 대체하는 것. 또한, 고정된 슬라이스에서 발현 패턴의 이미징에 대한 대안은 목욕 관류 시스템이 있는 적절한 이미징 장비의 라이브 슬라이스에서도 수행될 수 있습니다.
요약하면, 이 프로토콜을 통해 의사는 시험관 내 투영의 기능적 지형 및 시냅스 생리학을 특성화할 수 있으며, 이는 표준 방법( 예: 슬라이스에 보존할 수 없는 장거리 투영을 특성화합니다. 기재된 형질감염 프로토콜은 전달 메커니즘이 동일하기 때문에 생체 내 광유전학적 실험1-3,12,14에 적용될 수 있습니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 마우스의 형질감염을 설명하지만, 이용 가능한 많은 바이러스 벡터는 이론적으로 광범위한 포유류 종에서 이러한 옵신을 형질감염 및 발현하는 데 사용될 수 있으므로 무수한 비교 및 종별 연구가 가능해집니다1-3.

포유류 전뇌의 정교한 회로는 얽혀 있는 구성 요소의 기능적 역할을 해부하는 데 실험적인 도전을 제기합니다. 이러한 관계를 푸는 것은 최근 신경 세포 집단과 그 투영을 특별히 흥분시키고 억제하기 위한 광유전학적 방법의 개발에 의해 도움이 되었습니다1-3. 이러한 접근법은 빛4-6에 반응하는 막 채널의 유전적으로 제어된 발현을 사용합니다. 특히 주목할 점은 광 개폐 이온 채널인 채널로돕신(channelrhodopsin)은 광학 자극에 따라 뉴런 막을 탈분극시켜 발현 뉴런과 그 돌기의 흥분을 유발한다는 것입니다4,7. 반대로, 광개폐식 염화물 펌프인 할로호도핀(halorhodopin)은 멤브레인을 과분극화하여 표적 돌기를 억제합니다6,8,9. 이러한 옵신의 여러 변이체가 엔지니어링되었으며, 관심 뉴런 집단에서 형질주입 및 발현을 위해 생성된 여러 벡터, 이러한 옵신을 구성적으로 발현하거나 이들의 발현에 대한 cre-lox 매개 제어를 가능하게 하는 형질전환 마우스주가 엔지니어링되었습니다1,2,10,11.
이러한 광유전학적 방법과 물질의 유용성은 현대 실험 신경과학에 혁명을 일으켜 유기체의 생리학과 행동에서 특정 신경 회로의 역할을 해부할 수 있게 했습니다12-15. 특히, 이러한 방법은 시험관 내 절편 제제16-20을 사용하여 뇌 회로의 기능적 해부에 강력하게 적용될 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 이 방법의 주요 장점 중 하나는 대뇌 피질 반구 사이의 커미셔널 연결(commissural connections)과 같이 두꺼운 조각으로 보존하기 어렵거나 불가능하지는 않더라도 장거리 투영의 생리학을 특성화할 수 있는 능력입니다16. 또한, 이 기술은 할로로돕신6,8,9를 사용하여 미세한 시간적 정밀도로 투영을 선택적으로 억제하는 것과 같은 다른 방법으로는 불가능한 조작을 가능하게 합니다. 더욱이, 이러한 옵신의 세포 유형 특이적 발현은 신경 회로의 고립된 구성 요소가 선택적으로 자극되거나 억제될 수 있도록 합니다1,2,11,15,21. 이와 같이, 이러한 새로운 광유전학 도구는 생리학과 행동에 대한 뉴런의 기여도에 대한 전례 없는 분석을 가능하게 합니다.
여기에서는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터1,2를 사용하여 마우스 뇌에서 채널로돕신을 발현하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 표적 뉴런 집단의 특이적 형질주입은 관심 있는 표적 뉴런에서 Cre-recombinase를 발현하는 프로모터 구조체 또는 형질전환 마우스의 적절한 선택과 '플록스드' 바이러스 구조체1,11,15,21(그림 1)를 사용하여 이 프로토콜을 사용하여 달성할 수 있습니다. 예를 들어, 1차 시각 피질(V1)과 2차 시각 피질(V2) 사이의 피질 피질 투영을 조사하고, 1차 수면 감각 피질(S1)에서 복부 후방 내핵(VPm)까지의 6층 피질 피질 투영도 조사합니다. 우리는 이 특정 발현을 in vitro에서 레이저 스캐닝 광자극과 결합하여 시냅스 생리학 및 기능적 지형을 평가합니다. 여기에 제시된 설정은 광자극 유전자좌의 정확한 공간 위치 지정과 제어를 가능하게 합니다. 마지막으로, 컨포칼 현미경을 사용하여 발현 패턴의 시각화를 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC134220</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 32% 용액</td><td>EMS</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD</td><td>Vector Labs</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>AAV 바이러스 구조</td><td>UNC Vector Core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mouse stereotactic headholder</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Nanocool injector</td><td>Harvard 장치</td><td>703040</td><td></td></tr><tr><td>UV 레이저: 355 nm, Nd:YVO4; 1 W;</td><td>DPSS Lasers, Inc</td><td>3500</td><td></td></tr><tr><td>검류계</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6210</td><td></td></tr><tr><td>미러</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6m2003S-A</td><td></td></tr><tr><td>마운트</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6102103L</td><td></td></tr><tr><td>케이블</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6010-19-120</td><td></td></tr><tr><td>드라이버/컨트롤러</td><td>Cambridge Scanning</td><td>67121-1</td><td></td></tr><tr><td>셔터 - ZM 코팅 (UV 호환)</td><td>Uniblitz</td><td>L23-ZM2</td><td></td></tr><tr><td>셔터 컨트롤러</td><td>Uniblitz</td><td>VMM-D1</td><td></td></tr><tr><td>전류 증폭기</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR570</td><td></td></tr><tr><td>6713 보드</td><td>National Instruments</td><td>777741-01</td><td></td></tr><tr><td>2110 브레이크 아웃 박스</td><td>National Instruments</td><td>777643-01</td><td></td></tr><tr><td>PCI-MIO-16E-4</td><td>National Instruments</td><td>777383-01</td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090</td><td>내쇼날인스트루먼트</td><td>777270-01</td><td></td></tr><tr><td>케이블</td><td>, 내쇼날인스트루먼트</td><td>184749-01</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCS SP2</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

광유전학적으로 표적화된 전뇌 회로의 레이저 스캐닝 광자극

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

감각 전뇌는 복잡하게 연결된 세포 유형으로 구성되어 있으며, 그 기능적 특성은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 이러한 전뇌 회로의 상호 작용을 이해하는 것은 최근 신경 세포의 활동의 광 매개 조절을 위한 광유전학적 방법의 개발에 의해 도움을 받았습니다. 여기에서는 바이러스 매개 형질주입을 통해 광유전학적으로 발현된 채널로돕신의 레이저 스캐닝 광자극을 사용하여 체외에서 전뇌 회로의 기능적 조직을 검사하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 접근법은 또한 형질전환 마우스에서 cre-lox 재조합의 유용성을 활용하여 특정 신경 세포 유형에서 발현을 표적으로 합니다. transfection 후, 뉴런은 섬유를 발현하는 channelrhodopsin의 레이저 스캐닝 광자극에 대한 유발 반응을 측정하기 위해 전체 세포 패치 클램프를 사용하여 슬라이스 제제에 생리학적으로 기록됩니다. 이 접근 방식을 사용하면 기능적 지형 및 시냅스 특성을 평가할 수 있습니다. 형태학적 상관관계는 살아있는 절편 또는 고정 후 조직의 컨포칼 현미경을 사용하여 섬유를 발현하는 채널로돕신의 신경해부학적 발현을 이미징하여 얻을 수 있습니다. 이러한 방법은 보다 전통적인 접근 방식을 확장하는 전뇌 회로의 기능적 조사를 가능하게 합니다.

Balb/C 마우스의 V1(제1 시각 영역)에 pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP를 주입한 후, 마우스의 V1과 V2(제2 시각 영역) 사이의 투사 경로에 대해 레이저 스캐닝 광자극을 수행하였습니다.그림 3). 이 바이러스 벡터의 CaMKIIa 프로모터는 흥분성 글루타메이트성 뉴런에서 channelrhodopsin-EYFP가 특이적으로 발현되도록 유도합니다.1,15생리학적 기록을 위한 절편 준비 후, channelrhodopsin-EYFP 섬유의 발현을 즉 접합된 EYFP의 에피형광이 V1에서 V2로 이동하는 것이 관찰되었다(그림 3A). 또한, 외측슬상핵(LGN) 내의 피질시상 섬유 또한 관찰되었다 (그림 3A). V2 뉴런의 전체 세포 패치 클램프 기록 결과, V2 하층에서 채널로돕신-EYFP(channelrhodopsin-EYFP)를 발현하는 섬유를 레이저 스캔 광자극했을 때 EPSC가 유발되는 것이 확인되었습니다(그림 3B).
또 다른 예로, 이 프로토콜을 사용하여 일차 체성감각 피질(S1) 6층에서 복측후핵(VP)으로 이어지는 피질시상 투사 경로의 레이저 스캐닝 광자극을 수행하였습니다. 여기서는 Cre-Lox 접근법을 사용하여 관심 대상인 6층 뉴런과 피질시상 투사 경로에 채널로돕신 발현을 특이적으로 타겟팅하였습니다. 구체적으로, B6.Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd 마우스(그림 1 및 4)의 S1에 pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA를 주입하였습니다. 이 형질전환 마우스 계통은 6층 피질시상 뉴런에서 특이적으로 Cre-recombinase를 발현하며21, 따라서 'floxed' AAV 구조체에 의해 형질전환된 후 해당 뉴런에서만 ChR-YFP가 발현됩니다. 슬라이스를 준비한 후, 6층 뉴런과 4층 및 VP로 투사되는 섬유에서 channelrhodopsin-EYFP 섬유가 관찰되었습니다(그림 4A 및 4B). whole-cell patch clamp를 이용한 VPm 뉴런의 생리학적 기록 결과, 기록 중인 뉴런 근처에서 레이저 스캐닝 광자극을 통해 EPSC를 유도할 수 있음을 확인하였습니다(그림 4C 및 4D).
표지된 섬유의 형태는 생리학적 기록 후에 더 용이하게 평가되었습니다. 여기서는 6층 피질시상 뉴런에 channelrhodopsin-EYFP가 발현된 절편 표본을 다시 절단(50 μm)하였습니다(그림 5). 이를 통해 6층에서 4층으로 가로지르는 표지된 섬유의 미세한 패턴이 드러났으며, 이들은 4층에서 종결되어 광범위하게 수지상 분지를 형성하였습니다(그림 5A). 또한, 피질시상 섬유가 백질로 진입하여 시상 방향으로 가로지르는 것이 관찰되었습니다(그림 5A 및 5B).
<img alt="마우스 모델에서 표적 ChR-YFP 발현을 위한 Cre-loxP 이용 유전자 편집 도식." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 1"> 
그림 1. Cre-Lox 접근법을 통한 채널로돕신의 표적 발현 모식도. 관심 있는 신경세포군에서 Cre-recombinase를 발현하는 형질전환 마우스에 YFP와 같은 형광 단백질이 융합된 채널로돕신을 인코딩하는 'floxed' 바이러스를 주입합니다. 형질전환 후, Cre-recombinase가 있는 신경세포에서만 채널로돕신-EYFP가 발현됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig1highres.jpg" target="_blank">여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기</a>.
<img alt="레이저 광학계, 다이크로익 미러, CCD 카메라 및 스캐닝 설정이 포함된 레이저 현미경 도식도." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig2.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 2"> 
그림 2. 광자극 설정의 모식도. (A) 레이저 스캐닝 광자극 설정 도식도. 레이저 빔은 개방형 빔 시스템을 통해 셔터와 중성 밀도(N.D.) 필터로 순차적으로 안내됩니다. 커버슬립은 빔의 일부를 레이저 출력 측정을 위해 증폭기에 연결된 포토다이오드로 반사합니다. 미러 갈바노미터는 스캔 렌즈를 통해 레이저 빔의 위치를 잡는 데 사용되며, 이 렌즈는 현미경 상단의 사이드 포트를 통해 빔을 안내합니다. 그 후 빔은 다이크로익 미러를 사용하여 대물렌즈를 통해 슬라이스 표본으로 아래로 반사됩니다. 자세한 내용은 Lam 및 Sherman23 그리고 Shepherd29를 참조하십시오. (B) 그림 3에 표시된 대표 실험의 광자극 그리드 패턴 예시. 16 x 16 자극 그리드가 슬라이스 표본의 현미경 사진 위에 겹쳐져 있습니다. 빨간색 별은 whole-cell patch clamp를 사용하여 기록된 뉴런의 위치를 나타냅니다. 레이저 빔의 위치는 미러 갈바노미터의 컴퓨터 제어 위치 지정을 통해 자극 그리드의 256개 위치 각각으로 안내됩니다. 처음 5개 자극 부위의 레이저 위치가 그림에 묘사되어 있습니다. 각 부위의 광자극에 대한 기록 뉴런의 반응은 그림 3에 묘사되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig2highres.jpg" target="_blank">확대 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a>.
<img alt="신경 영상 맵 도식; LGN, V1, V2 시각 피질 분석; 신경 연결 연구." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig3.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 3"> 
그림 3. 마우스의 일차 시각 피질(V1)에서 이차 시각 피질(V2)로 이어지는 피질-피질 투사를 이용한 레이저 스캐닝 광자극. (A) V1에서 V2로, 그리고 외측슬상핵(LGN) 내에 존재하는 channelrhodopsin-EYFP 섬유를 보여주는 슬라이스 표본의 형광 이미지. 흥분성 글루타메이트성 뉴런에서의 channelrhodopsin-EYFP 특이적 발현은 CaMKIIa 프로모터를 포함하는 바이러스 구조체에 의해 유도된다. (B) 레이저 스캐닝 광자극 후 V2 뉴런에서 유도된 흥분성 postsynaptic 전류(EPSC). 빨간색 별은 기록 부위를 나타냄. 스케일 바: (A) 500 µm, (B) 200 pA, 100 msec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig3highres.jpg" target="_blank">여기를 클릭하여 확대 이미지 보기</a>.
<img alt="VP 영역 분석을 포함한 피질 층 다이어그램; 미세전기 활동 맵핑; 전기생리학 데이터" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig4.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 4"> 
그림 4. 마우스의 일차 체성감각 피질(S1)에서 복측후핵(VP)으로 이어지는 피질-시상 투사 경로의 레이저 스캐닝 광자극. (A) S1 내의 channelrhodopsin-EYFP 섬유를 보여주는 슬라이스 표본의 형광 이미지. (B) VP 내 표지된 섬유의 형광 이미지. (C) 레이저 스캐닝 광자극 후 VP 뉴런에서 유도된 흥분성 포스트시냅스 전류(EPSCs). (D) 평균 EPSCs 그래프. 빨간색 별표는 기록 부위를 나타냄. (C)의 상자 표시된 트레이스는 (D)의 상자 표시된 값에 해당함. 스케일 바: (A) 250 µm, (B) 250 µm, (C) 100 pA, 100 msec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig4highres.jpg" target="_blank">여기 버튼을 클릭하여 확대된 이미지 보기</a>.
<img alt="녹색 마커로 표지된 신경 세포 구조를 보여주는 형광 현미경 이미지; 비교 도식." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig5.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 5"> 
그림 5. 마우스의 일차 체성감각 피질(S1) 내 channelrhodopsin-EYFP를 발현하는 6층 신경 세포의 이미징. (A-B) 6층의 표지된 신경 세포와 4층 및 백질로 투사되는 섬유. 스케일 바: (A) 250 µm, (B) 250 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig5highres.jpg" target="_blank">여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기</a>.

우리는 시험관 내에서 신경 세포 집단을 광자극하기 위해 광유전학적 접근 방식을 사용하여 전뇌 회로의 기능적 지형 및 시냅스 특성을 특성화하는 방법을 설명합니다.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

본 절차의 전반적인 목적은 현대적인 광유전학 기술을 적용하여 인비트로(in vitro) 슬라이스 표본 내의 표적 신경 경로를 광자극하는 것입니다. 이는 먼저 관심 있는 신경 세포주에 channel rhodopsin을 발현시킴으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 연구 대상이 되는 관련 뇌 구조의 급성 슬라이스 표본을 제작하는 것입니다.다음 단계는 채널 로돕신(channel rhodopsin)을 발현하는 섬유의 광자극에 반응하여 슬라이스 표본 내 뉴런의 반응을 기록하는 것입니다. 마지막 단계는 채널 옵신(channel opsin)을 발현하는 뉴런과 섬유의 분포를 이미지화하는 것입니다. 궁극적으로, 이 접근 방식은 광유전학적으로 표적화된 신경 구성 요소에 대한 레이저 스캐닝 광자극을 사용하여 신경 회로의 기능적 지형도와 시냅스 특성을 평가할 수 있게 합니다.기존의 전기 자극 방식과 비교하여 이 기술이 갖는 주요 장점은 특정 신경세포 유형을 선택적으로 표적화하여 자극할 수 있으며, 이들의 장거리 투사 경로를 in vitro에서 관찰할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 복잡한 신경망의 기능적 조직과 같은 시스템 신경과학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 형질전환 효율을 높이기 위해 mL당 4 µg의 poly가 포함된 바이러스 용액을 주입할 주사기와 바늘을 준비하십시오.그 후 시린지 펌프를 사용하여 용액 200 nanoliters를 압력 주입합니다. 2~3주가 지나면 채널 로드 Dossin 슬라이스에서 적절한 발현이 나타날 것입니다. 조편 준비는 가능한 한 신속하게 수행해야 합니다. 주입된 뇌를 적출한 후, 깨끗한 면도날을 사용하여 원하는 방향으로 뇌 블록을 만듭니다. 다음으로, 뇌의 블록 처리된 표면을 순간접착제를 사용하여 커팅 스테이지에 고정합니다.그 후 스테이지를 냉동고로 냉각된 진동 절단 챔버로 옮기고, 얼음처럼 차가운 A CSF를 절단 챔버에 붓습니다. 바이브톰(vibrotome)을 사용하여 뇌 절편을 4~500 µm 두께의 절편으로 자릅니다. 뇌 절편을 산소가 공급되는 유지 챔버로 옮기고, 실험을 진행하기 전 최소 1시간 동안 30 °C에서 배양합니다.실험을 시작할 준비가 되면, 뇌 절편을 전기생리학적 기록 장치의 스테이지로 옮깁니다. 표준 전세포 패치 클램프(whole cell patch clamp) 기술을 사용하여 뉴런을 기록합니다. 피펫에 양압을 가하면서 기록용 피펫을 뉴런 근처에 짧게 위치시킵니다.세포와 접촉시킨 후, 압력을 해제하고 흡입을 가하여 기가실(giga seal)을 형성합니다. 그다음 짧게 흡입을 가해 세포막을 파괴하여 whole cell 구성으로 만든 후, 전압 클램프 또는 전류 클램프 모드에서 기록을 수행합니다. 레이저 스캐너는 tidal wave 또는 EFAs 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 작동시키십시오.레이저 출력을 제어하기 위해 사용 전 소프트웨어를 포토다이오드에 맞게 보정해야 합니다. 레이저 경로에 가변 중성 밀도 휠을 배치합니다. 휠을 회전시켜 후초점면(back focal plane)에서 측정함으로써 레이저 출력을 조절합니다.출력은 일반적으로 25에서 D milliwatts 사이로 설정합니다. 셔터의 펄스 파라미터는 소프트웨어 내에서 자극의 길이와 타이밍을 제어합니다. 자극할 영역의 이미지는 비디오 캡처 기능을 통해 생성할 수 있습니다.다음으로, 80 micron 간격의 16 by 16 그리드와 같이 자극 그리드를 설정합니다. 그런 다음 획득한 이미지 위에 그리드를 겹치고 XY 좌표와 오프셋 정도를 조정하여 자극을 시작하기 위한 방향을 최적화합니다. 맵 기능을 활성화합니다.데이터는 보존되어 tidal wave의 오프라인 분석 프로그램을 통해 분석하거나, EFAs 소프트웨어의 맵 분석 프로그램을 사용하여 분석할 수 있습니다. 슬라이스에서 생리학적 기록을 완료한 후, YFP 태그가 부착된 채널 옵신의 발현 패턴을 기록할 수 있습니다. 먼저, 4°C에서 0.01 M PBS 내 4% PFA로 슬라이스를 하룻밤 동안 고정하십시오.다음 날, 슬라이스를 30% sucrose 4% PFA 용액으로 옮겨 하룻밤 동안 동결 보호 처리합니다. 그다음 날, 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 슬라이스를 50 micron 두께로 절편합니다. 절편을 PBS로 헹군 후, 공초점 현미경으로 이미징하기 위해 항퇴색제(anti fade medium)와 함께 마운팅합니다.백색광으로 관심 영역을 찾은 후, 514 nanometer 흥분 파장과 527 nanometer 방출 파장을 사용하십시오. 흥분성 글루타메이트 작동성 뉴런에서 channel rod Dobson의 발현을 유도하는 YFPA 바이러스 구조체 EYFP를 시각화하기 위해, 이를 BSY 마우스의 일차 시각 피질에 주입하였습니다.바이러스 발현은 일차 및 이차 시각 피질 사이의 경로와 LGN의 피질-시상 섬유에서 발견되었습니다. 별표로 표시된 이차 시각 피질 뉴런의 전체 세포 패치 클램프 기록 결과 e PSC가 나타났습니다. 채널 로돕신의 레이저 스캐닝 광자극 이후, V2 하층에서 채널 로돕신을 발현하는 섬유와 일차 체성감각 피질 6층에서 유래한 피질-시상 투사 경로가 확인되었습니다. 복측 후핵은 CRE LAX 접근법을 사용하여 6층 피질-시상 뉴런 및 그 투사 경로에 채널 로돕신을 발현시켜 연구하였습니다. 예상대로 CRE 형질전환 마우스에 flp-AAV 구조체를 도입하여 형질전환시킨 결과, 표적이 된 6층 뉴런과 4층까지 뻗어 있는 섬유에서 채널 로돕신 발현이 나타났습니다.Channelrhodopsin-2 EYFP 발현은 VP로 투사되는 섬유에서도 확인되었으며, VP 뉴런의 생리학적 기록이 수행되었습니다. whole-cell patch clamp를 이용한 분석 결과, 별표로 표시된 기록 뉴런 인근에서 광자극을 주었을 때 ePSC가 유도될 수 있음이 밝혀졌습니다. 오프라인 분석은 VP에서 광자극에 대한 평균 반응 진폭을 보여줍니다. Channelrhodopsin-2 EYFP를 발현하는 6층 피질-시상 뉴런의 50 µm 두께 절편을 분석한 결과, 6층에서 4층으로 가로지르는 라벨링된 섬유의 미세한 패턴이 나타났으며, 이들은 4층에서 종단되어 광범위하게 분지되었습니다.또한, 피질시상 섬유가 백질로 진입하여 시상 방향으로 가로지르는 것이 관찰되었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 인비트로(in vitro) 절편 표본에서 표적 신경 경로를 광자극하기 위해 현대적인 광유전학 기술을 적용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 본 절차와 관련된 보정 단계를 수행할 때 레이저 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.보호 안경을 착용하십시오.

laser-scanning-photostimulation-optogenetically-targeted-forebrain

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

본 논문은 제한된 억제 뉴런의 인구에 GFP를 표현 형질 전환 생쥐에서 전체 셀 녹음과 photostimulation를 검색 레이저를 결합 방법을 소개합니다. 이 기술은 특정 억제 대뇌 피질의 뉴런의 지역 신경 회로의 광범위한 매핑 및 정량 분석​​ 할 수 있습니다.

레이저 스캐닝 Photostimulation에 의해 억제 Neuronal 회로를 매핑

optogenetics의 개발은 이제 정확하게 유전자 정의 뉴런과 회로를 자극 할 수있는 방법을 모두...

뇌 조직의 만성 Optogenetic의 자극을위한 광섬유 주입

유전학과 광학을 결합 신경 과학 도구의 최근 개발, 공간 및 시간 해상도의 전례없는 수준의 신경 회로의 활동을 제어 할 수 있습니다, "optogenetics"라고. 여기에서 우리는 전두엽 피질과 subicular 피라미드 뉴런의 유전 정의 된 부분 집합의 optogenetic 조작과 생체 녹화에 통합하기위한 프로토콜을 제공합니다.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

준 그대로의 모터 출력의 변화 (근육 수축) 모니터링하면서 여기에 우리가 motoneuronal 활동 optogenetic 조작에 대한 프로토콜을...

세미 그대로의 레이저 조명과 신경 활동의 Optogenetic 섭동<em&gt; 초파리</em모션&gt; 유충

광유전학은 행동 신경과학 실험에 사용할 수 있는 강력한 도구가 되었습니다. 이 프로토콜은 레이저 시스템의 설계 및 설정에 대한 단계별 가이드를 제공하며, 대부분의 설치류 행동 테스트 패러다임과 호환되는 다중 및 동시 생체 내 광유전학적 자극을 수행하기 위한 전체 프로토콜을 제공합니다.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

이 프로토콜은 광유전학적 기능적 자기공명영상(ofMRI)을 성공적으로 수행하는 데 필요한 단계와 데이터 분석을 설명합니다. ofMRI는 고자기장 fMRI 판독과 광유전학적 자극을 결합한 새로운 기술로, 살아있는 뇌 전체에 걸쳐 기능적 신경 회로와 그 역학의 세포 유형별 매핑을 가능하게 합니다.

Optogenetic 기능 MRI

이 프로토콜은 생체 뇌 슬라이스에서 광유전학 자극을 사용하여 먼 뇌 영역에서 장거리 입력의 세포 유형 특정 기능적 연결을 식별하는 일련의 방법을 설명합니다.

마우스 뇌 슬라이스에 장거리 입력의 광유전학 자극을 위한 Vivo intracerebral 입체 전착성 주사

특정 신경 인구 또는 뇌 영역의 광유전학 적 조작으로, 행동은 자유롭게 움직이는 동물에 있는 높은 시간 및 공간 해상도로 수정될 수 있습니다. 만성 이식 된 광섬유와 함께 다른 광유전학 도구를 사용하여 다양한 신경 변조 및 행동 테스트를 수행 할 수 있습니다.

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

현재 시행 된 바와 같이, 인간이 아닌 영장류의 광유전학은 바이러스 벡터를 뇌에 주입해야합니다. 최적의 주입 방법은 신뢰할 수 있어야 하며 많은 응용 분야에서 사후 조직학에서 쉽고 명확하게 식별되는 임의의 깊이의 개별 부위를 표적으로 삼을 수 있어야 합니다. 이러한 특성을 갖는 주입 방법이 제시된다.

마취 및 깨어 있는 행동하는 비인간 영장류 뇌에서 광유전학을 위한 AAV 벡터 주사

여기에 설명 된 방법은 쥐의 행동 관련 회로에서 코카인으로 유도 된 가소성을 광학 유전 학적으로 역전시키는 데 사용되는 절차를 설명합니다. 시상 편도체 시냅스의 지속적인 저주파 광 자극은 장기 우울증 (LTD)을 유도합니다. 코카인 경험이 있는 쥐에서 생체내 광유전학적으로 유도된 LTD는 단서-동기 약물 탐색의 후속 감쇠를 초래하였다.

광유전학을 사용하여 신경 가소성을 역전시키고 쥐에서 코카인 추구를 억제

여기에서는 쥐와 생쥐의 고밀도 마이크로 전기 피질 검사(μEcoG) 기록을 위한 수술, 이식 및 기록 방법을 포함한 두 가지 프로토콜을 제시합니다. μECoG 기록은 쥐의 청각 피질에서 층류 다원(laminar polytrode) 기록 또는 쥐의 체성 감각 피질(somatosensory cortex)에서 신경 활동의 광유전학적 조작과 함께 수행됩니다.

설치류의 미세 전기 피질 조영술과 층류 폴리트로드 및 광유전학을 통합하여 피질 처리의 멀티스케일 조사

배우세요 광유전학적 레이저 스캐닝 광자극을 이용한 전뇌 회로의 기능적 토포그래피와 시냅스 특성 평가 방법입니다. Channelrhodopsin을 활용한 특정 신경세포 타겟팅과 장기 투사경로 분석이 가능합니다.

광유전학적으로 표적화된 전뇌 회로의 레이저 스캐닝 광자극

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