레이저에 의한 맥락막 신생 혈관에 대한 마우스 모델

여기에서는 신생혈관 연령 관련 황반변성(AMD)의 혈관 특징을 재현하는 실험 모델인 마우스 레이저 유도 맥락막 신생혈관화(CNV) 프로토콜을 제시합니다. 일단 마스터하면 다양한 실험 측정을 테스트하기 위한 모델 시스템으로 CNV를 안정적이고 효과적으로 유도할 수 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 신생혈관 연령 관련 황반변성 또는 MD의 특징을 연구하기 쉬운 동물 모델에서 재현하는 것입니다. 이 방법은 유전적 변형 또는 약물 치료가 질병에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 또는 다양한 이미징 양식에서 질병이 어떻게 나타날 수 있는지 등을 포함하여 신생혈관 A MD 연구의 다양한 측면을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 일단 숙달되면 재현이 쉬워 실험을 빠르고 효율적으로 수행할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 성공하기 위한 훌륭한 손재주와 조정력이 부족하기 때문에 어려움을 겪을 것이며, 둘 다 연습을 통해 향상됩니다. 레이저 스테이션 위치, 쉽게 접근할 수 있는 레이저 및 슬릿 램프를 준비하려면 레이저를 켜고 미리 결정된 매개변수로 설정하십시오. 여기서는 75마이크로미터, 스폿 크기, 100밀리와트 전력 및 100밀리초 지속 시간 설정이 사용됩니다.

다음으로 마취제, 동물 보온 조직, 물티슈 및 안약을 레이저 작업자가 쉽게 접근할 수 있는 위치에 놓습니다. 첫 번째 마우스를 마취한 후 약 3-5분 동안 애니멀 워머에 놓습니다. 완전한 마취를 보장하기 위해 발가락 꼬집기를 수행합니다.

그런 다음 롤링 티슈 와이프를 사용하여 액체 롤오프의 비강 흡인을 방지합니다. 테트라카인 염산염 30마이크로리터를 각 눈에 떨어뜨립니다. 솔루션이 적용될 때까지 2분 정도 기다립니다.

다음으로, 동공을 확장하기 위해 각 눈에 국소 트로픽 에이드 한 방울을 바릅니다. 그리고 솔루션이 적용될 때까지 2분 정도 기다립니다. 이제 마우스를 마우스 스테이지에 빠르게 놓은 다음 스테이지를 슬릿 램프의 턱 부분에 놓습니다.

슬릿 램프를 켜고 가장 낮은 조명 밝기로 조정하십시오. 마우스의 동공 확장을 평가합니다. 동공이 2.5mm에서 3mm의 팽창을 달성하지 못한 경우.

마우스를 동물 보온기로 되돌리거나 동공 확장 후 열대 보조제를 추가로 투여합니다. 슬릿 빔에 수평으로 수직으로 놓이도록 플랫폼에서 마우스의 방향을 지정합니다. 마우스를 약 170도 각도가 되지 않도록 약간 돌립니다.

머리가 레이저 작업자에 더 가깝게 위치하도록 하여 마우스를 슬릿 램프에 최대한 가깝게 배치하면서 플랫폼 안정성을 유지하고 작업자가 미세한 모터 조작을 수행할 수 있는 충분한 공간을 남겨둡니다. 마우스가 올바른 위치에 놓이면 인공 눈물 용액 한 방울을 25mm x 25mm 유리 커버 슬립에 바릅니다. 또한 이 용액을 쥐의 표적이 없는 눈에 한 방울 떨어뜨려 탈수를 예방합니다.

엄지와 검지 사이로 커버 슬립의 한쪽 모서리를 잡고 나머지 세 손가락으로 마우스를 감싸 동물과 작업자의 손을 모두 지지하고 안정시킵니다. 그런 다음 덮개를 조심스럽게 누릅니다. 쥐의 눈에 끼워 각막을 평평하게 만듭니다.

빔의 산란 또는 반사를 방지하기 위해 레이저 빔 경로에 수직으로 커버 슬립을 배치합니다. 슬릿 램프를 통해 보면서 망막이 보일 때까지 자유로운 손을 사용하여 초점을 조정합니다. 망막은 연한 노란색에서 빨간색으로 나타나야 하며, 뚜렷한 빨간색 혈관이 있는 경우 시신경이 관찰될 때까지 마우스의 머리나 덮개를 천천히 조심스럽게 움직입니다.

시신경은 노란색이며 여러 혈관이 방사됩니다. 그런 다음 레이저 포커싱 빔을 켜고 움직여 안저의 망막 색소, 상피 또는 RPE에 초점을 맞춥니다. 초점 빔이 타원형이거나 초점이 맞지 않는 것처럼 보이면 슬릿 램프를 조정합니다.amp 초점 또는 커버 슬립.

포커싱 빔이 적절하게 조정되면 발 방아쇠를 사용하여 레이저 투여를 시작합니다. 레이저 투여 직후 기포가 형성되어야 하며, 경계가 흐릿한 병변 또는 출혈성 병변이 있는 눈은 분석에서 제외해야 합니다. 기포 형성과 집중된 레이저 연소를 나타내는 선명하게 정의된 원형 영역을 관찰하십시오.

기포를 생성하지 않는 병변은 CNV를 적절하게 유도하지 않을 수 있습니다. 원하는 모든 맥락막 신생혈관 형성 또는 CNV 위치에 추가 병변을 생성합니다. 레이저를 사용하지 않을 때는 레이저를 대기 모드로 전환하고 각 레이저 투여의 위치와 결과를 실험실 노트에 기록합니다.

새 커버 슬립을 사용하여 마우스의 두 번째 눈에 레이저 투여를 반복하고 반대쪽 손을 사용하여 마우스를 안정화합니다. 모든 투여를 완료 한 후 레이저와 슬릿 램프를 끄고 커버 슬립을 버리고 마우스를 동물에 올려 놓습니다. 거시적으로 더 따뜻합니다.

각막 표면이나 백내장 부상이 있는지 눈을 검사하십시오. 복구 후 마우스를 케이지로 되돌립니다. 여기에서 면역형광 염색 후 편평한 장착 맥락막의 분석을 통해 정량화된 CNV.

Fit c 덱스트란 라벨링은 동물 희생 직전에 관류를 통해 수행되었습니다. 그 다음에는 Image J.Here에서 내피 세포 마커를 사용한 사후 면역 염색에서 임계값을 통한 면적 정량화가 수행되었습니다. GS IB four에서 ISO 셀렉팅을 수행한 후 컨포칼 현미경을 통한 이미징을 수행했습니다.

FOSS에서 CNV 병변의 3D 재구성 및 측면 보기가 생성되었습니다. 광간섭 단층촬영 영상은 또한 생체 내에서 CNV 병변을 시각화하는 데 사용되었습니다. 여기서, 망막의 단면 이미지는 노란색 원으로 표시된 CNV 병변과 함께 표시됩니다.

병변의 en FOSS 이미지도 노란색 원으로 표시됩니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 10분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 동물이 제대로 마취되었는지 확인하고 동물이 지지되고 안정될 수 있도록 손의 위치를 잡는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 초점을 전달하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. CNV를 유도하기 위해 레이저를 연소하며, 이는 이후 다양한 방법으로 연구될 수 있습니다.