토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

이 클로닝 및 형질전환 절차의 전반적인 목표는 기능적 유전체 연구에 사용할 수 있는 CRISPR 벡터와 녹아웃 돌연변이 토마토 뿌리를 효율적으로 생성하는 것입니다. 이 방법은 다양한 뿌리 공정에서 활용 가능한 다수의 녹아웃 돌연변이체를 생성할 수 있기 때문에 식물 유전체학 분야에서 유용한 도구가 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 클로닝 절차를 단 한 단계로 완료할 수 있어, 단 몇 주 만에 실험 재료를 확보할 수 있다는 점입니다.

먼저, DNA 어셈블리에 필요한 5' 및 3' 말단의 20개 뉴클레오티드 서열이 양옆에 배치된 타겟 모티프의 GN19 부분을 포함하도록 가이드 RNA 또는 gRNA 올리고뉴클레오타이드를 설계합니다. 1~5 $\mu\text{g}$의 P201N caznine 플라스미드를 제한 효소 Spe1으로 37 ${}^\circ\text{C}$에서 2시간 동안 처리합니다. 제조사의 지침에 따라 컬럼 정제한 후, 15 $\mu\text{L}$의 10 $\text{mM}$ Tris-HCl에 다시 현탁합니다.

UV 분광광도법으로 DNA 양을 정량합니다. 제한 효소 Swa1을 사용하여 25°C에서 2시간 동안 2차 절단을 수행합니다. 0.8% 아가로스 겔에서 100~200 ng을 확인하여 완전히 절단되었는지 확인합니다.

정확하게 절단된 플라스미드는 14,313 base pair 위치에서 단일 밴드를 나타냅니다. medicago truncatula를 PCR 증폭하려면 puck gRNA 셔틀 플라스미드에서 6개의 프로모터와 스캐폴드 DNA를 사용하십시오. high fidelity polymerase를 사용하여 Swa1 및 Mtu6F, MTU6R 프라이머와 scaffold F, Spe1 scaffold R을 사용하십시오.

증폭 여부를 확인하기 위해 1% 아가로스 겔에서 3 µL의 PCR 생성물 분주액을 시각화합니다. MTU6 앰플리콘은 377 bp이며, 스캐폴드 앰플리콘은 106 bp입니다. 나머지 PCR 생성물은 제조사의 지침에 따라 컬럼 정제합니다.

이전과 동일하게 UV 분광광도법으로 정량하고 -20 °C에서 보관합니다. 다음으로, gRNA 올리고뉴클레오타이드 튜브 전체를 실험실 등급의 물을 사용하여 100 µM 농도로 재현탁합니다. 올리고뉴클레오타이드 1 µL를 1xNEB buffer 2.1 500 µL에 넣고 잘 섞어줍니다.

가열 뚜껑이 있는 서멀 사이클러를 50 °C로 유지하도록 설정합니다. 선형화된 벡터 100 ng, MtU6 프로모터 50 ng, Scaffold 12 ng, 그리고 물에 희석한 gRNA 올리고 1 µL를 혼합하여 최종 부피를 5 µL로 맞춥니다. 여기에 2X high fidelity DNA Assembly Mastermix 5 µL를 추가합니다.

잘 섞은 후 원심분리하여 가라앉힙니다. 50 °C의 서모사이클러(thermocycler)에서 60분 동안 반응을 배양합니다. 50 °C에서 1시간 동안 배양한 후, 반응물을 얼음 위에 두고 표준 기술을 사용하여 2 µL를 취해 컴피턴트 E.Coli 세포를 형질전환시킵니다.

50 mg/mL Kanamycin이 첨가된 LB Agar에 형질전환물을 도말하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양한다. StUb3p 218R 및 1Sce1R 프라이머를 이용한 PCR로 콜로니를 스크리닝한다. 남은 DNA 조립 반응액의 일부를 증류수로 1:5 비율로 희석하고, 1 µL를 콜로니 스크리닝의 양성 대조군으로 사용한다.

또한 삽입물 없음 대조군으로 1 ng의 원형 P201N casnine 플라스미드를 포함시키십시오. 프로토콜의 서면 부분에 포함된 파라미터를 사용하여 PCR 증폭을 수행한 후, 1% 아가로스 겔에서 PCR 산물을 시각화하십시오. 올바르게 삽입된 경우 725 bp 밴드가 나타나며, 삽입물이 없는 벡터는 310 bp 밴드가 나타납니다.

양성 콜로니를 LB Can50 액체 배지에서 37°C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 제조사의 지침에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드를 정제합니다. StuB3P218R 프라이머로 정제된 플라스미드의 Sanger sequencing을 수행한 후, 크로마토그램을 MtU6 프로모터, Target 및 scaffold 서열과 정렬하여 클로닝 과정에서 오류가 도입되지 않았는지 확인합니다.

1 µg의 플라스미드를 EcoR5 및 Sti1으로 제한효소 처리하여 진단 소화를 수행합니다. 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동하여 시각화했을 때, 해당 밴딩 패턴이 나타나야 합니다. 마지막으로, 플라스미드 준비물을 1 µL 취해 50 µL의 전기천공 가능 세포(electrocompetent cells)에 첨가하고 1 mm 큐벳에서 전기천공을 실시하여 플라스미드를 Agrobacterium rhizogenes 균주 ARqua1에 형질전환합니다.

SOC 배지 약 500 µL를 첨가하고 28 °C에서 2시간 동안 흔들어 섞습니다. 그 후 LB Can50 플레이트에 도말하고 28 °C에서 2일 동안 배양합니다. 이 과정의 시작 단계로, 토마토 종자를 20 % 가정용 표백제에 넣고 지속적으로 혼합하며 15분 동안 멸균합니다.

그 다음 종자를 층류 후드로 옮깁니다. 표백제를 제거하고 멸균된 실험실 등급의 물로 3회 세척합니다. 1/2 MS 배지가 들어 있는 GA7 박스에 종자 30개를 도말합니다.

암실에서 약 2일 동안 발아하도록 둡니다. 종자가 발아하면 GA7 상자를 빛이 있는 곳으로 옮깁니다. 형질전환 전날, Can50이 포함된 고체 LB 배지에 A.rhizogenes 배양액을 도말하고 28°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 형질전환 당일, 층류 정화 작업대(laminar flow hood)에서 0.5배 MS 배지 50 mL에 Acetosyringone 25 µL를 첨가하고, 각 배양 튜브에 6 mL씩 분주합니다.

구부러진 200 µL 팁을 사용하여 플레이트에서 A.rhizogenes 세포를 긁어낸 후 6 mL의 1/2 MS 액체 배지에 다시 부유시킵니다. 튜브를 볼텍싱하여 세포를 완전히 재부유시킵니다. 각 벡터의 세포를 재부유시킨 후, 세포 1 mL를 취해 600 nm의 고정 파장에서 광학 밀도를 측정합니다.

멸균 여과지가 깔린 페트리 접시에 1/2 MS 액체 배지 2 mL를 넣습니다. 유묘에서 떡잎을 절취하여 적셔진 여과지 위에 놓습니다. 모든 떡잎을 수집한 후, 떡잎의 가장 끝부분 1 cm를 잘라내어 양끝이 절단된 떡잎 조각을 만듭니다.

외식물체(ex plants)를 A.rhizogenes 용액에 넣고 혼합합니다. 가끔씩 뒤집어주며 20분 동안 배양합니다. A.rhizogenes 배양 중에, 각 컨스트럭트 형질전환용 페트리 접시에 거름종이 한 조각을 넣습니다.

또한, 항생제가 포함되지 않은 1/2 MS 고체 배지를 라미나 플로우 후드 내에 배치하여 건조시킵니다. 멸균 핀셋을 사용하여 A.rhizogenes 용액에서 자엽을 꺼내 건조된 여과지에 올립니다. 다음 형질전환 과정을 진행하는 동안 조직이 마르지 않도록 페트리 접시 뚜껑으로 덮어둡니다.

다음으로, 거름종이로 떡잎의 물기를 제거하고 배축면(abaxial side)이 위로 향하게 하여 1/2 MS 배지로 옮깁니다. 플레이트를 수술용 테이프로 감싸고 실온의 암소에서 2일 동안 공동 배양합니다. 공동 배양 후, 떡잎의 배축면이 위로 향하게 하여 첨가제가 포함된 1/2 MS 배지로 옮깁니다.

수술용 테이프로 감쌉니다. 실온의 형광등 아래에서 16시간의 광주기를 유지하며 배양합니다. 1.5~2주 후, 멸균 집게와 메스를 사용하여 자엽에서 최소 2cm 길이의 뿌리를 절제하고, Ticarcillon/Clavulanate Acid 및 Kanamycin이 첨가된 1/2 MS 배지로 옮깁니다.

10~15개의 뿌리를 하나의 플레이트로 옮깁니다. 마커를 사용하여 뿌리 끝의 위치를 표시합니다. 수술용 테이프로 감싼 후 배양실에서 유지합니다.

일주일 후, 선택 배지에서 형질전환된 뿌리가 성장하는 것을 확인할 수 있습니다. 선호하는 DNA 추출 방법을 사용하여 DNA 추출을 위한 형질전환 뿌리 일부를 수확합니다. 형질전환 11일 후에는 자엽에서 모상근이 나타나는 것을 볼 수 있습니다.

뿌리는 Ticarcillon/Clavulanate Acid 및 Kanamycin이 첨가된 1/2 MS 배지에서 약 1주일 동안 선별합니다. 회색 막대는 플레이팅 당시 뿌리 끝의 위치를 나타냅니다. 이는 4가지 서로 다른 hairy root 이벤트에서 두 가지 서로 다른 표적 유전자의 DNA 돌연변이를 확인하기 위해 PCR 산물을 클로닝하고 시퀀싱한 사례입니다.

회색 상자는 GN20 GG 표적 서열을 나타내며, delta는 돌연변이의 유형을 나타냅니다. 표시된 돌연변이를 가진 클론의 수는 오른쪽에 표시되어 있습니다. 이는 DNA 돌연변이를 결정하기 위한 폴리아크릴아마이드 겔의 예시입니다.

큰 결실과 헤테로듀플렉스 밴드는 표적 서열에 DNA 돌연변이가 존재함을 나타냅니다. 12회의 독립적인 이벤트 중 6회는 델타 기호로 표시된 바와 같이 돌연변이체로 판정되었습니다. WT는 야생형 대조군을, NT는 템플릿 미포함 대조군을 나타냅니다.

숙달되면 일주일 안에 수십에서 수백 개의 CRISPR 벡터를 제작할 수 있으며, 몇 주 안에 trendulate 그룹 재료를 얻을 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 남아 있는 모든 Agrobacterium을 제거하고 성장을 억제하는 것이 중요합니다. Agrobacterium이 과하게 성장하면 뿌리 조직의 성장을 방해하고 조직을 고사시킵니다.

이 영상을 시청한 후에는 DNA 어셈블리를 이용하여 CRISPR 벡터를 생성하는 방법과, hairy root 모델 시스템 및 토마토를 사용하여 해당 벡터를 테스트하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.