토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

이 클로닝 및 형질전환 절차의 전반적인 목표는 CRISPR 벡터를 효율적으로 생성하고 기능적 유전체 연구에 사용할 수 있는 돌연변이 토마토 뿌리를 제거하는 것입니다. 이 방법은 다양한 뿌리 과정에 사용할 수 있는 많은 수의 녹아웃 돌연변이를 생성할 수 있기 때문에 식물 유전체학 분야에서 유용한 도구입니다. 이 기술의 주요 장점은 클로닝 절차를 단일 단계로 수행할 수 있어 단 몇 주 만에 그룹 재료를 얻을 수 있다는 것입니다.

먼저, RNA 또는 gRNA 올리고를 DNA 조립에 필요한 5개의 프라임 및 3개의 프라임 20 뉴클레오티드 염기서열 옆에 있는 타겟 모티프의 GN19 부분을 포함하도록 설계합니다. 1-5 마이크로그램의 P201N 카즈닌 플라스미드를 제한 효소 Spe1과 함께 섭씨 37도에서 2시간 동안 소화합니다. 제조업체의 지침에 따라 컬럼을 정제한 후 10밀리몰 Trs HCL 15마이크로리터에 다시 현탁합니다.

UV 분광 광도법으로 DNA의 양을 정량화합니다. 제한 효소 Swa1을 섭씨 25도에서 2시간 동안 두 번째 분해합니다. 0점 8% 아가로스 젤의 100-200나노그램을 확인하여 완전한 분해를 확인합니다.

올바르게 소화된 플라스미드는 14, 313 염기쌍에서 단일 밴드를 갖습니다. PCR을 증폭하기 위해 puck gRNA 셔틀 플라스미드에서 6개의 promoter 및 scaffold DNA를 사용합니다. 고충실도 중합효소에서 프라이머 Swa1 및 Mtu6F 및 MTU6R과 Spe1 스캐폴드 R의 스캐폴드 F를 사용합니다.

증폭을 확인하기 위해 1% 아가로스 겔에서 3마이크로리터의 PCR 산물 분취량을 시각화합니다. MTU6 앰플리콘은 377개의 염기쌍이고 스캐폴드 앰플리콘은 106개의 염기쌍입니다. Column은 제조업체의 지침에 따라 나머지 PCR 산물을 정제합니다.

이전과 같이 UV 분광 광도법으로 정량화하고 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 다음으로, gRNA 올리고의 전체 튜브를 실험실 등급의 물에서 100마이크로몰로 다시 현탁시킵니다. 500마이크로리터의 1xNEB 버퍼 2점, 1점에 올리고 1마이크로리터를 넣고 잘 섞습니다.

가열된 뚜껑이 있는 열 순환기를 섭씨 50도에서 유지하도록 프로그래밍합니다. 100 나노그램의 선형화된 벡터, 50 나노그램의 MtU6 프로모터, 12 나노그램의 스캐폴드, 1마이크로리터의 물에 희석된 gRNA 올리고를 5마이크로리터의 최종 부피로 결합합니다. 5마이크로리터의 2X 고충실도 DNA Assembly Mastermix를 추가합니다.

잘 섞고 스핀다운하십시오. 섭씨 50도 열순환기에서 60분 동안 반응을 배양합니다. 섭씨 50도에서 한 시간 후 얼음 위에 반응을 놓고 2마이크로리터를 사용하여 표준 기술을 사용하여 유능한 대장균 세포를 변형시킵니다.

밀리리터 카나마이신당 50mg을 보충한 LB 한천의 변형을 플레이트하고 하룻밤 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. PCR을 사용하여 프라이머 StUb3p 218R 및 1Sce1R을 사용하여 집락을 스크리닝합니다. 나머지 DNA 어셈블리 반응의 alequat를 물 1에서 5로 희석하고 1 마이크로 리터를 콜로니 스크리닝에 대한 양성 대조군으로 사용합니다.

또한 1나노그램의 원형 P201N 카스닌 플라스미드를 무인서트 대조군으로 포함합니다. 프로토콜의 서면 부분에 포함된 파라미터를 사용하여 PCR 증폭 후 1% 아가로스 겔에서 PCR 산물을 시각화합니다. 올바른 삽입은 밴드가 있는 725 염기쌍을 가지며 삽입물이 없는 벡터는 310 염기쌍 밴드를 갖습니다.

섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 LB Can50 액체 배양액에서 포지티브 콜로니를 성장시킵니다. 다음 날, 제조업체의 지침에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드를 정제합니다. StuB3P218R 프라이머로 정제된 플라스미드를 Sanger 염기서열분석 후 크로마토그램을 MtU6 promoter, Target 및 scaffold 염기서열에 정렬하여 클로닝 중에 오류가 발생하지 않도록 합니다.

1마이크로그램의 플라스미드를 EcoR5 및 Sti1로 분해하여 진단 다이제스트를 수행합니다. zero point eight agarose gel에서 시각화하면 이 밴딩 패턴이 표시되어야 합니다. 마지막으로, 1마이크로리터의 플라스미드 분취제를 50마이크로리터의 전기적질성 세포에 첨가하고 1밀리미터 큐벳에 전기천공을 하여 플라스미드를 Agrobacterium rhizogenes 균주 ARqua1으로 변환합니다.

약 500마이크로리터의 SOC 미디어를 넣고 섭씨 28도에서 2시간 동안 흔듭니다. 그런 다음 LB Can50 플레이트에 플레이트하고 이틀 동안 섭씨 28도에서 자랍니다. 토마토 씨앗을 가정용 표백제 20%에 넣고 지속적으로 혼합하면서 15분 동안 살균하여 절차의 이 섹션을 시작합니다.

그런 다음 씨앗을 층류 후드로 옮깁니다. 표백제를 제거하고 멸균 실험실 등급의 물로 세 번 씻으십시오. MS 배지 1/2개가 들어 있는 GA7 상자에 30개의 시드를 플레이트화합니다.

어둠 속에서 약 이틀 동안 발아하도록 두십시오. 씨앗이 발아하면 GA7 상자를 빛으로 옮기십시오.변형 전날 Can50을 함유한 고체 LB에 A.rhizogenes 배양물을 줄무늬를 만들고 밤새 섭씨 28도에서 자랍니다. 변형 당일, 층류 후드에서 작업하여 50ml의 1/2 MS에 25마이크로리터의 아세토시링곤을 추가하고 각 배양 튜브에 6ml를 붓습니다.

구부러진 200마이크로리터 팁을 사용하여 플레이트에서 A.rhizogenes 세포를 긁어내고 6밀리리터의 MS 액체 1/2에 재현탁합니다. 세포를 완전히 재현 탁유시키기 위해 튜브를 소용돌이치십시오. 각 벡터에서 세포를 재현유탁한 후 1ml의 세포를 취하여 600나노미터의 고정 파장에서 광학 밀도를 측정합니다.

2mL의 1/2 MS 액체를 멸균 여과지가 있는 페트리 접시에 추가합니다. 묘목에서 자엽을 제거하고 축축한 여과지 위에 놓습니다. 모든 자엽이 수집되면 자엽에서 가장 말단 1cm를 잘라내어 끝이 두 개 잘린 자엽 조각을 만듭니다.

전 식물을 A.rhizogenes 용액에 추가하고 혼합합니다. 20분 동안 배양하고 가끔 뒤집어 배양합니다. A.rhizogenes 배양 중에 각 구성 변환에 대해 페트리 접시에 여과지 조각을 추가합니다.

또한 층류 후드에 항생제가 없는 MS 고체 매체 1/2을 건조시킵니다. 멸균 집게를 사용하여 A.rhizogenes 용액에서 자엽을 퍼내고 마른 여과지 위에 놓습니다. 다음 변형을 진행하는 동안 조직이 마르지 않도록 페트리 접시 뚜껑으로 덮습니다.

다음으로, 여과지의 자엽을 닦아내고 아축 면을 MS 매체의 절반까지 옮깁니다. 접시를 수술 용 테이프로 감싸고 실온에서 이틀 동안 어둠 속에서 공동 재배하십시오. 공동 배양 후, 자엽 abaxial side를 보충 된 1/2 MS 매체로 옮깁니다.

수술용 테이프로 감쌉니다. 실온의 형광등 아래에서 16시간의 사진 시간으로 배양을 유지합니다. 5-2주 후 멸균 겸자와 메스를 사용하여 자엽에서 최소 2cm 길이의 뿌리를 절제하고 Ticarcillon/Clavulanate Acid 및 Kanamycin 보충제 1/2 MS 배지로 옮깁니다.

10-15 개의 뿌리를 하나의 접시에 옮깁니다. 마커로 루트 팁의 위치를 표시합니다. 수술용 테이프로 감싸고 배양실에서 유지하십시오.

일주일 후, 변형 뿌리가 선택적 배지에서 자라는 것을 볼 수 있습니다. 선호하는 DNA 추출 방법을 사용하여 DNA 추출을 위해 형질전환된 뿌리의 하위 샘플을 수확합니다. 털이 많은 뿌리는 변형 후 11일 후에 자엽에서 나오는 것을 볼 수 있습니다.

뿌리는 Ticarcillon/Clavulanate Acid 및 Kanamycin이 약 1주일 동안 1/2 MS Media를 보충하여 선택합니다. 회색 막대는 도금 시 루트 팁의 위치를 나타냅니다. 이것은 4개의 서로 다른 털이 많은 뿌리 사건에서 2개의 다른 유전자 표적을 가진 DNA 돌연변이를 결정하기 위한 PCR 산물의 클로닝 및 염기서열분석의 예입니다.

회색 상자는 GN20 GG 타겟 염기서열을 나타내고 델타는 돌연변이의 유형을 나타냅니다. 표시된 돌연변이를 가진 클론의 수가 오른쪽에 표시되어 있습니다. 이것은 DNA 돌연변이를 결정하기 위한 폴리아크릴아미드 겔의 예입니다.

큰 결실과 이중이중 대역은 표적 염기서열에 DNA 돌연변이가 존재함을 나타냅니다. 12개의 독립적인 이벤트 중 6개는 델타 기호로 표시된 대로 돌연변이로 점수가 매겨졌습니다. WT는 와일드 형식 컨트롤을 나타내고 NT는 템플릿 없음 컨트롤을 나타냅니다.

일단 마스터링되면 수십에서 수백 개의 CRISPR 벡터를 일주일 만에 생산할 수 있으며 trendulate group material을 몇 주 만에 얻을 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 잔류 아그로박테리움의 성장을 제거하고 억제하는 것이 중요합니다. 아그로박테리움(Agrobacterium)의 과다 증식은 모든 뿌리 물질을 억제하고 죽입니다.

이 동영상을 시청한 후에는 DNA 어셈블리를 사용하여 CRISPR 벡터를 생성하는 방법과 털이 많은 뿌리 모델 시스템과 토마토를 사용하여 이러한 벡터를 테스트하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.