Name: 토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: 배우세요 CRISPR 벡터를 단일 클로닝 반응으로 효율적으로 구축하고 토마토 털이 뿌리에서 녹아웃 돌연변이체를 생성하는 방법을. 이 기술은 식물 기능 유전체학 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 연구는 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 IOS-1025642 (GBM)에 의해 지원되었다. 우리는 ARqua1 균주를 제공하는 마리아 해리슨 감사합니다.

1. 가이드 RNA 설계 및 벡터 건설 <ol><li> 관심있는 유전자에 대한 표적 서열을 확인합니다. 이 단계 (13, 14)에 적합한 온라인 CRISPR 대상-찾는 다양한 프로그램이 있습니다. 참고 : 여기에 우리는 GN 20 GG 대상 모티브를 사용하지만, 다른 디자인을 사용하는 응용 프로그램이나 벡터 시스템에 따라 적합 할 수있다. </li><li> 디자인 60 메르 gRNA 올리고는 DNA 조립에 필요한 5 측면 대상 주제 &#39;및 3&#39;20 NT 시퀀스의 GN (19) 부분을 포함한다. 마지막 60 메르 주제는 다음과 같습니다 5&#39;-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 &#39;. 참고 : 표준, 탈염 프라이머가 잘 작동합니다. </li><li> 조립을위한 네 개의 DNA를 (그림 1)을 준비합니다. DNA 서열에 대한 추가 파일을 참조하십시오. <ol><li> 2 시간 동안 37 ℃에서 1X 버퍼 (4)의 제한 효소와 I SPE Cas9 10 플라스미드 p201N 5 μg의 1 - 다이제스트. 는 다이제스트 열은-정화제조업체의 지침에 ccording. ~ 10 mM 트리스 - 염산 15 μl를에 재현 탁하고, UV 분광 광도법에 의해 정량화. </li><li> 제 2 시간 동안 25 ℃에서 1X 버퍼 3.1 제한 효소 I SWA와 다이제스트 수행한다. 완전한 분해를 확인하기 위해 0.8 % 아가 로스 겔상에서 ng를 200-100를 확인한다. 참고 : 제대로 소화 플라스미드 14,313 BP에 하나의 밴드를해야합니다. 참고 : 효소와 탈 인산화의 열 불 활성화가 필요하지 않습니다. 분해 된 플라스미드를 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> PCR은 프라이머 SWA I_MtU6F / MtU6R 각각 ScaffoldF / SPE I_ScaffoldR를 사용하여는 pUC gRNA 셔틀 (10) 플라스미드에서 Medicago의 truncatula (마) U6 프로모터 및 발판 DNA를 증폭. 상기 증폭 된 PCR 조건을 가진 고성능 폴리머 사용하여 3 분 동안 95 ° C 단계; 31주기 (20 초 98 ° C, 15 초 동안 60 ° C, 30 초 72 ° C); 5 분 동안 72 ° C. <ol><li> PCR 홍보의 ~ 3 μL 씩 시각화1 % 아가 로스 겔상에서 oducts의 증폭을 확인한다. MtU6 앰플 리콘은 377 BP하고 비계 앰플 리콘은 106 bp의입니다. , 제조업체의 지시에 따라 PCR 나머지 제품을 칼럼 - 정제 -20 ℃에서 UV 분광 광도법에 의해 정량화하고 저장. </li></ol></li><li> 실험실 수준의 물에 100 μM에 gRNA 올리고의 전체 튜브를 재현 탁. 1X 버퍼 2.1 500 ㎕를 100 μM 올리고 1 μl를 추가합니다. 잘 섞다. 여러 올리고 풀링 경우, 1 배 버퍼 2.1 튜브에 각각 100 μM 올리고 1 μl를 추가합니다. 희석 올리고는 -20 ° C에서 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 가열 된 리드를 사용하여, 50 ° C에서 유지하도록 열 순환기 프로그램. 의 부피로 선형화 된 벡터 묽은 gRNA 올리고 (들) 및 물 MtU6 프로모터 지지체의 12 NG (0.2 pmol의), 1 μL (0.2 pmol의)의 50 NG (0.2 pmol의)의 100 NG (0.011 pmol의)을 겸용 5 μL. 2 배 높은 충실도 DNA 어셈블리 마스터 믹스 5 μl를 추가 잘 혼합 스핀 다운. 에서 60 분 동안 반응을 품어50 ° C 열 순환기. 그런 다음 얼음에 반응을 놓습니다. 주의 : 반응 볼륨이 낮은 DNA 수율을 수용하기 위해 증가 될 수있다. </li><li> 관할 E.으로 반응 2 μl를 변환 50 mg을 L -1 카나마이신 (칸 50)로 보충 LB에 표준 기술과 플레이트를 이용하여 대장균 세포. 하룻밤 37 ℃에서 도금 세포를 성장. -20 ° C에서 남아있는 DNA 어셈블리 반응을 저장합니다. </li><li> 프라이머의 StUbi3P218R 및 ISceIR를 사용하여 PCR에 의한 식민지 화면. 물 (1)과 나머지 DNA 조립체 반응의 분취 액을 희석 : 5이다. 노 삽입 제어와 같은 Cas9 플라스미드 : 긍정적 인 식민지의 화면 제어 및 원형 p201N 1 NG로 1 μl를 사용합니다. <ol><li> PCR은 조건을 증폭; 3 분 95 ° C; 31주기 (30 초 95 ° C, 30 초 동안 58 ° C, 30 초 72 ° C); 5 분 동안 72 ° C에서. 1 % 아가 로즈 겔상에서 PCR 생성물을 가시화. 정확한 삽입이 725 BP와 벡터 기지에서 밴드가 있는지 확인(예를 들어, 포경 벡터) 심 삽입은 310 bp의 밴드를해야합니다. </li></ol></li><li> 37 ° C에서 50 액체 배양 밤새 LB 칸에 긍정적 인 식민지를 성장하고 제조업체의 지침에 따라 플라스미드를 정제. 생거 순서는 StUbi3P218R 프라이머로 플라스미드 및 오류가 복제 동안 소개되지 않았다 보장하기 위해 MtU6 프로모터, 대상 및 발판 시퀀스에 크로마토 그램을 맞 춥니 다. </li><li> 진단은 에코 RV 및 촌 I.와 플라스미드 ~ 1 μg의 소화에 의해 소화 수행 0.8 % 아가 로스 젤에 시각화합니다. (BP)에 조각은 다음과 같습니다 : 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. </li><li> 여러 gRNAs와 벡터를 구성하는 DNA 어셈블리를 사용합니다. <ol><li> 두 gRNA 카세트를 갖는 벡터를 구성하기 위해 PCR은 각각 각각의 1 NG의 프라이머 UNS1_MtU6F / SPE I_ScaffoldR와 프라이머 SWA I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR 및 제 gRNA 위치와 제 1 위치 gRNA 증폭1.8 - 플라스미드 단계 1.1으로 구성. 단계 1.3.3에서 PCR 조건을 사용합니다. 증폭을 확인하기 위해, 1 % 아가 로즈 겔상에서 PCR 제품 ~ 3 μL 씩 시각화. 증폭는 ~ 500 BP 있습니다. </li><li> 합하여 200 μL 튜브 않은 정제 PCR 제품의 대략 동일한 양을 혼합 (일반적으로 3 - 각 4 μL). 어셈블리를 들어, PCR 제품 조합 1 μL, SWA I의 50 NG를 추가하고 SPE 나는 p201N을 선형화 : Cas9, 실험실 수준의 물을 2.5 μL와 배 높은 충실도 DNA 어셈블리 마스터 믹스의 2.5 μL에. 15 분 동안 50 ° C 열 순환기 인큐베이션. 주 : DNA 조립 매뉴얼 2 15 분 배양 권장합니다 - 3 조각. </li><li> 관할 E.으로 2 μL 1 - 변환 LB 칸 (50)에 대장균 세포와 판. 하룻밤 37 ° C에서 도금 세포를 성장. -20 ° C에서 나머지 반응을 저장합니다. </li><li> 단계 1.6과 동일한 조건으로 프라이머 StUbi3P218R 및 ISceIR와 PCR에 의한 식민지 화면. 올바른 Clones는 1200 bp의 증폭 물을 것입니다. LB 칸에 긍정적 인 식민지를 50 액체 배양 하룻밤 성장 및 플라스미드를 정제. </li><li> 프라이머의 StUbi3P218R와 생거 시퀀스 플라스미드 (제 1 위치 gRNA을 포함) 및 p201R은 (두 번째 위치 gRNA을 포함). MtU6 프로모터, 대상 및 발판 시퀀스에 크로마토 그램을 맞 춥니 다. 진단은 에코 RV 다이제스트와의 Sty 나는 (BP)에 다음과 같은 단편 발생합니다 : 4192은, 2476은, 1743은, 1544은, 1381는, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174 굵게 조각 두 번째 gRNA이 포함되어 있습니다. </li></ol></li><li> 아그로 박테 리움이 변형 ARqua1 15 rhizogenes에 모든 품질 관리의 기대를 충족 한 후, 플라스미드를 변환. 설정으로 1mm 큐벳에 electrocompetent 세포와 electroporate 50 μL에 플라스미드 준비 1 μl를 추가 : 2.4 kV의 25 μF, 200 Ω을. SOC의 ~ 500 μL의 세포를 복구하고 2 시간 동안 28 ° C에서 흔들. LB 칸 50 g에 플레이트2 일 동안 28 ° C에서 행. 1.3.3와 동일한 프라이머 및 PCR 조건을 사용하여 콜로니 화면을 수행한다. 긍정적 인 클론에서 글리세롤 주식을합니다. </li></ol> 2. 털이 루트 변환 <ol><li> 일정하게 혼합하여, 15 분 동안 20 %의 가정용 표백제 토마토 종자를 소독. 층류 후드에서, 표백제를 제거하고 무균 실험실 등급 물에 세 번 세척 하였다. </li><li> ½ MS 미디어 (2.22 g의 L -1 MS 염 + 갬 보그 비타민, 10g의 L -1 자당 3 g L -1 젤란 검, 산도 5.8)를 포함하는 GA-7 상자 판 (30) 씨. 어둠 속에서 2 ~위한 일을 발아 후 빛에 GA-7 상자를 이동합니다. 빛 ~ 4 일 이상 모종을 재배한다. </li><li> 변환 전날, 연속 아웃 A. 고체 LB 칸 (50)에 문화를 rhizogenes 하룻밤 28 ° C에서 성장한다. </li><li> 변환 일이 층류 후드에서 멸균 재료를 조립 : 12 ml의 배양 관, 50 ㎖ 원뿔형 튜브, ½ MS 액체 (더 젤란 g 없다음), 200 μM의 시린, 여과지, 배양 접시, 집게와 메스, 피펫과 피펫 팁. ½ MS의 50ml로 시린의 25 μl를 추가하고 각 문화 튜브에 ~ 6 ml에 붓는다. </li><li> A.을 긁어 구부러진 200 μl의 팁을 사용하여 ½ MS 액의 6 용액에 접시와에 resuspend에서 rhizogenes 세포. 와류 튜브 완전 세포를 재현 탁한다. 각 벡터로 세포를 재현 탁 후에, 600 nm의 고정 된 파장에서 셀 1 (M1)의 광학 밀도 (OD)를 측정한다. OD가 0.2과 0.4 사이에 있는지 확인; 희석 또는 필요에 따라 더 많은 세포를 추가합니다. 각 구조에 대해 반복합니다. </li><li> 살균 필터 종이와 페트리 접시에 ½ MS 액체 ~ 2 ML을 추가합니다. 가습 필터 종이에 묘목과 장소에서 소비세 자엽. 일단 모든 자엽이 수집 한 두 컷 끝 떡잎 조각의 결과로, 자엽의 오프 말단 ~ 1cm를 잘라. A.에 외식 추가 rhizogenes 솔루션은 혼합하고, 20 분 동안 품어가끔 반전에. 참고 : 구조 당 약 12 외식가 일상적으로 사용되며, 많은 80 외식이 A의 6 ㎖에 접종되고 있지만 rhizogenes 솔루션입니다. </li><li> A. 동안 rhizogenes의 배양은 배양 접시에 종이 필터를 추가, 하나의 당 구조가 변형. 또한 건조 층류 후드, ½ MS 고체 배지, 아니 항생제를 설정합니다. </li><li> A.에서 자엽 특종 건조 여과지에 멸균 집게와 장소 rhizogenes 솔루션을 제공합니다. 다음 변환을 진행하면서 건조하지 않는 조직을 보장하기 위해 페트리 뚜껑 커버. 여과지 및 전송, 배축면이 위로에 오 자엽은 MS의 미디어를 ½합니다. 외과 용 테이프로 감싸 판을 실온에서 2 일 동안 어둠 속에서 공동 - 배양. </li><li> 최대 공 배양, 전사 자엽, 배축 측 후, MS 매체 (300 mg을 L -1 ticarcillin / 클라 불란 산 팀 300 보충 1/2 잔유의 성장을 방지 할연간 A. rhizogenes) 및 공장 선택에 대한 칸 50 () 및 수술 테이프로 포장. 16 시간 광주와 실온에서 형광등 불빛 아래에서 문화를 유지한다. </li><li> 길이가 2 주 뿌리 적어도 2cm 멸균 집게와 메스를 사용하여 자엽에서 절제와 MS 칸 50 팀 (300) 미디어를 1/2 전송 - ~ 1.5 후. 하나의 판에 10 ~ 15 뿌리를 전송합니다. 마커와 뿌리 끝의 위치를​​ 표시 외과 테이프로 포장, 문화 방에서 유지한다. </li><li> 일주 후, 형질 전환 뿌리는 선택적 미디어에 성장 볼 수 있습니다. 바람직한 DNA 추출 방법을 이용하여 DNA 추출을 위해 변환 된 뿌리의 표본 수확. 참고 : 자엽과 플레이트가 2 유지 될 수 - 뿌리가 얽힌 엉망으로 성장 지적과 분리하기 어려운 후 3 주간 수확. 비 수확 루트 조직 무한히 유지할 수있다. 분석의 다양한 단리 된 DNA 시료에서 수행 될 수있다들 DNA 돌연변이의 빈도와 유형을 확인합니다. 몇 이러한 분석 결과는 아래에 설명되어 있습니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

DNA 어셈블리는 겹치는 DNA 서열을 재결합하는 데 사용되기 때문에 이 클로닝 방법은 모든 CRISPR 벡터 구조에 적용할 수 있습니다. 대부분의 CRISPR 클로닝 방식은 gRNA의 유전자 합성, 유형 IIS 제한 효소17,18 또는 중첩 확장 PCR19를 사용합니다. 이러한 각 기술에는 고유한 장점과 단점이 있지만 일반적으로 여러 가지 실습 복제 단계가 필요합니다. 여기에 제시된 클로닝 방법의 주요 장점은 전체 프로세스가 단일 1시간 반응으로 발생하고 gRNA 올리고를 풀링하여 클로닝 절차를 더욱 간소화할 수 있다는 것입니다. 또한, DNA 조립 메커니즘은 제한 효소와 독립적이므로 이 방법은 거의 모든 DNA 서열과 호환됩니다. 편리하게도 불변 DNA 성분(선형화된 벡터, MtU6 프로모터 및 스캐폴드)의 마스터 믹스를 만들어 나중에 조립할 수 있도록 -20°C에서 보관할 수 있습니다. 
GN20GG gRNA 표적 ...

CRISPR와 표적 DNA의 변형을 생성 할 수있는 능력은 / Cas9는 기능 유전체학 연구에 큰 잠재력을 가지고있다. CRISPR / Cas9 시스템의 두 가지 구성 요소가 있습니다; 황색 포도상 구균 화농 및 대상 DNA 사이트 (들) 1 Cas9을 지시 약 100 NT 가이드 RNA (gRNA) 분자에서 파생 된 Cas9 클레아. 표적 인식은 상기 제에 의해 부여된다 ~ 타겟팅 벡터 2,3- 높은 처리량 제조 허용 gRNA의 20 NT. 설계 할 수 있습니다 대부분의 생물은 이미 CRISPR / Cas9 기술 4,5로왔다. 식물 예는 CaMV 35S 프로모터와 같은 구성 성 프로모터에서, 일반적 Cas9 클레아 (6)의 발현을 유도하기 위해 사용된다. gRNAs는 gRNA의 제 1베이스를 제한하는 RNA 중합 효소 III U6 또는 U3 프로모터를 사용하여 표현에 중 하나 G, 효율적인 전사 U3에 대한 U6, 또는 A,합니다. 그러나 RNA 중합 효소 II의 댄스 파티이러한 제한의 무료 oters는 또한 7, 8을 사용하고있다. 다른 gRNAs 다른 효율성과 DNA 돌연변이를 유도하고, 그래서 먼저 전체 공장의 변환에 투자 또는 광범위한 표현형 화면을 설정하기 전에 CRISPR 경로를 확인하는 것이 중요 할 수 있습니다. CRISPR 과도 발현이 곤란 돌연변이와 같은 방식으로 비실용적 표현형 어 세이의 검출을 안정 설비 (6)에 비해 일반적으로 DNA 개질 저주파 결과, 예를 들면 agroinfiltration을 사용하여, 식물 구성한다. 소위 모상근 안정적인 식물 개월 반대로 독립 안정적으로 형질 전환 물질 다수, 주 내에서 발생 될 수 있기 때문에 편리 대체 시스템이다. CRISPR 벡터는 털이 뿌리 9,10에서 DNA 돌연변이를 유도에 매우 효과적이다. DNA 조립 방법은 효율적 overl 함유 DNA 단편을 결찰apping 11을 종료합니다. 일부 DNA 조립 방법의 주요 장점은 조립 된 제품에 ssDNA를 (즉, 올리고)를 통합 할 수있는 능력이다. gRNAs 만 ~ 20 NT 긴 새로운 타겟 합성 올리고 만들어 질 수 있기 때문에, 이러한 DNA 조립 방법 CRISPR 복제에 적합하다. 여기에 설명 된 프로토콜이 성공적으로 대두 10, 포플라 (12)에 사용 된 현재 토마토 CRISPR 벡터의 P201 시리즈에 기초한다. 제시 복제 절차는 현재의 클로닝 방법 (10)에 비해 몇 가지 장점을 제공한다. 즉, 완전히 기능 벡터는 하루에 단일 클로닝 반응에서 생성 될 수있다. 벡터 건설은 더 손에 시간과 재료 비용을 절감, 병렬로 여러 CRISPR 벡터를 생성하기 위해 풀링 할 수 있습니다. 또한 표적 유전자 결실 유전자 물질을 제조하기위한 효율적인 방법으로 토마토 모상근의 생성을위한 프로토콜을 제시한다. 털이 뿌리는 유효한하는 데 사용됩니다CRISPR 벡터를 먹고 이후의 실험 자료를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>NEBuilder&reg; (하이파이 DNA 어셈블리 믹스)</td><td>New England Biolabs</td><td>E5520</td><td></td></tr><tr><td>p201N:Cas9</td><td>Addgene</td><td>59175</td><td>p201H:Cas9 플라스미드(59176)는 보고된 중첩 및 효소와도 호환됩니다.</td></tr><tr><td>pUC gRNA 셔틀</td><td>Addgene</td><td>47024</td><td></td></tr><tr><td>SwaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0604S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>Zymo clean and concentrator-5 column purification</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>NEB Buffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>NEB CutSmart (버퍼 4)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>NEB 버퍼 3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep)</td><td>Epoch Life Sciences</td><td>1910-050/250</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV-HF&reg;</td><td>뉴잉글랜드 Biolabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>StyI-HF&reg;</td><td>New England Biolabs</td><td>R3500S</td><td></td></tr><tr><td>MS Salts + Gamborg Vitamins</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>M404</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel&trade; (Gellan 실리콘껌)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>GA-7 박스</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V8505</td><td></td></tr><tr><td>Micropore&trade; 수술 테이프</td><td>3M</td><td>1535-0</td><td></td></tr><tr><td>Timentin&reg; (티카르실린/클라불란산)</td><td>다양한</td><td>0029-6571-26</td><td></td></tr><tr><td>프라이머 5' &#8594; 3'SwaI_MtU6F</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MtU6R&nbsp; &nbsp;</td><td>AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>비계F&nbsp;</td><td>GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpeI_Scaffold R</td><td>GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StUbi3P218R&nbsp;</td><td>ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISceIR</td><td>GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG</td> 플라스미드 <td></td>UNS1_Scaffold R&nbsp<td>에 두 번째 결합 부위가 있으므로 Sanger 염기서열분석에 사용할 수 없습니다</td></tr><tr><td>.</td><td>GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UNS1_MtU6 F&nbsp; &nbsp;</td><td>CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p201R&nbsp;</td><td>CGCGCCGAATTCTAGTGATCG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>굵게 표시된 시퀀스는 선형화된 p201N:Cas9와 20-nt가 겹치는 것을 나타냅니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 crispr 벡터 건설 및 dna 수정의 특성

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

CRISPR(Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 기술을 가진 벡터에 의해 생성된 표적 DNA 돌연변이는 기능적 유전체학 연구에 유용한 것으로 입증되었습니다. 대부분의 클로닝 전략은 수행이 간단하지만 일반적으로 여러 단계를 사용하며 최종 구조를 생성하는 데 며칠이 걸릴 수 있습니다. 여기에 제시된 방법은 DNA 조립을 기반으로 하며 단일 클로닝 반응에서 완전한 기능을 갖춘 CRISPR 벡터를 생산할 수 있습니다. Vector construction도 풀링할 수 있어 프로세스의 효율성과 유용성을 더욱 높일 수 있습니다. 이 방법의 변형은 여러 유전자 표적을 가진 CRISPR 벡터를 만드는 데 사용됩니다. 그런 다음 CRISPR 벡터를 토마토 털 뿌리로 변형시켜 표적 DNA 변형을 통해 형질전환 물질을 생성합니다. 털뿌리는 기술적으로 생성이 간단하고 대규모 생산에 적합하기 때문에 벡터 기능을 테스트하는 데 유용한 시스템입니다. 여기에 제시된 방법은 다양한 CRISPR 벡터를 생성하는 데 사용할 수 있고 광범위한 식물 종에 사용할 수 있으므로 광범위하게 적용할 수 있습니다.

DNA 어셈블리 CRISPR 벡터 구조는 일반적으로 독립적 인 클론의 수백 수십를 생성합니다. PCR에 의한 식민지 심사 쉽게 올바른 클론을 식별하고와 문제 해결에 유용 삽입 (그림 2A)없이 플라스미드를 구별 할 수 있습니다. 일반적으로, 클론의 모든 인서트를 포함하고 사용자가 완전히 식민지 심사 단계를 건너 뛰도록 선택할 수 있습니다. 진단 다이제스트 (그림 2B)와 생거 시퀀싱은 품질 관리에 사용됩니다. 오류가 발생하는 않는 경우, 그들은 일반적으로, 중첩 DNA 영역에서 관찰되는, 즉, 5 &#39;를 MtU6 촉진제 단부의 gRNA 또는 3&#39;골격 시퀀스의 끝. 여러 gRNA 올리고 단일 반응에 풀링하는 경우 gRNAs은 생거 시퀀싱에 의해 결정된다. 개별 gRNAs의 혼입이 균일하게 분포되고 gRNAs 대부분 (도 2c는 단일 변환으로부터 분리 될...

DNA 조립체를 사용하여, 여러 CRISPR 벡터가 CRISPR 다수의 구성을 하나 복제 반응에 병렬로 구성 될 수있는 간단한 작업 벡터. 토마토 털이 뿌리는 CRISPR 경로를 확인하고 돌연변이 물질을 생성 할 수있는 훌륭한 모델 시스템입니다.

토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

이 클로닝 및 형질전환 절차의 전반적인 목표는 기능적 유전체 연구에 사용할 수 있는 CRISPR 벡터와 녹아웃 돌연변이 토마토 뿌리를 효율적으로 생성하는 것입니다. 이 방법은 다양한 뿌리 공정에서 활용 가능한 다수의 녹아웃 돌연변이체를 생성할 수 있기 때문에 식물 유전체학 분야에서 유용한 도구가 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 클로닝 절차를 단 한 단계로 완료할 수 있어, 단 몇 주 만에 실험 재료를 확보할 수 있다는 점입니다.먼저, DNA 어셈블리에 필요한 5' 및 3' 말단의 20개 뉴클레오티드 서열이 양옆에 배치된 타겟 모티프의 GN19 부분을 포함하도록 가이드 RNA 또는 gRNA 올리고뉴클레오타이드를 설계합니다. 1~5 $\mu\text{g}$의 P201N caznine 플라스미드를 제한 효소 Spe1으로 37 ${}^\circ\text{C}$에서 2시간 동안 처리합니다. 제조사의 지침에 따라 컬럼 정제한 후, 15 $\mu\text{L}$의 10 $\text{mM}$ Tris-HCl에 다시 현탁합니다.UV 분광광도법으로 DNA 양을 정량합니다. 제한 효소 Swa1을 사용하여 25°C에서 2시간 동안 2차 절단을 수행합니다. 0.8% 아가로스 겔에서 100~200 ng을 확인하여 완전히 절단되었는지 확인합니다.정확하게 절단된 플라스미드는 14,313 base pair 위치에서 단일 밴드를 나타냅니다. medicago truncatula를 PCR 증폭하려면 puck gRNA 셔틀 플라스미드에서 6개의 프로모터와 스캐폴드 DNA를 사용하십시오. high fidelity polymerase를 사용하여 Swa1 및 Mtu6F, MTU6R 프라이머와 scaffold F, Spe1 scaffold R을 사용하십시오.증폭 여부를 확인하기 위해 1% 아가로스 겔에서 3 µL의 PCR 생성물 분주액을 시각화합니다. MTU6 앰플리콘은 377 bp이며, 스캐폴드 앰플리콘은 106 bp입니다. 나머지 PCR 생성물은 제조사의 지침에 따라 컬럼 정제합니다.이전과 동일하게 UV 분광광도법으로 정량하고 -20 °C에서 보관합니다. 다음으로, gRNA 올리고뉴클레오타이드 튜브 전체를 실험실 등급의 물을 사용하여 100 µM 농도로 재현탁합니다. 올리고뉴클레오타이드 1 µL를 1xNEB buffer 2.1 500 µL에 넣고 잘 섞어줍니다.가열 뚜껑이 있는 서멀 사이클러를 50 °C로 유지하도록 설정합니다. 선형화된 벡터 100 ng, MtU6 프로모터 50 ng, Scaffold 12 ng, 그리고 물에 희석한 gRNA 올리고 1 µL를 혼합하여 최종 부피를 5 µL로 맞춥니다. 여기에 2X high fidelity DNA Assembly Mastermix 5 µL를 추가합니다.잘 섞은 후 원심분리하여 가라앉힙니다. 50 °C의 서모사이클러(thermocycler)에서 60분 동안 반응을 배양합니다. 50 °C에서 1시간 동안 배양한 후, 반응물을 얼음 위에 두고 표준 기술을 사용하여 2 µL를 취해 컴피턴트 E.Coli 세포를 형질전환시킵니다.50 mg/mL Kanamycin이 첨가된 LB Agar에 형질전환물을 도말하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양한다. StUb3p 218R 및 1Sce1R 프라이머를 이용한 PCR로 콜로니를 스크리닝한다. 남은 DNA 조립 반응액의 일부를 증류수로 1:5 비율로 희석하고, 1 µL를 콜로니 스크리닝의 양성 대조군으로 사용한다.또한 삽입물 없음 대조군으로 1 ng의 원형 P201N casnine 플라스미드를 포함시키십시오. 프로토콜의 서면 부분에 포함된 파라미터를 사용하여 PCR 증폭을 수행한 후, 1% 아가로스 겔에서 PCR 산물을 시각화하십시오. 올바르게 삽입된 경우 725 bp 밴드가 나타나며, 삽입물이 없는 벡터는 310 bp 밴드가 나타납니다.양성 콜로니를 LB Can50 액체 배지에서 37°C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 제조사의 지침에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드를 정제합니다. StuB3P218R 프라이머로 정제된 플라스미드의 Sanger sequencing을 수행한 후, 크로마토그램을 MtU6 프로모터, Target 및 scaffold 서열과 정렬하여 클로닝 과정에서 오류가 도입되지 않았는지 확인합니다.1 µg의 플라스미드를 EcoR5 및 Sti1으로 제한효소 처리하여 진단 소화를 수행합니다. 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동하여 시각화했을 때, 해당 밴딩 패턴이 나타나야 합니다. 마지막으로, 플라스미드 준비물을 1 µL 취해 50 µL의 전기천공 가능 세포(electrocompetent cells)에 첨가하고 1 mm 큐벳에서 전기천공을 실시하여 플라스미드를 Agrobacterium rhizogenes 균주 ARqua1에 형질전환합니다.SOC 배지 약 500 µL를 첨가하고 28 °C에서 2시간 동안 흔들어 섞습니다. 그 후 LB Can50 플레이트에 도말하고 28 °C에서 2일 동안 배양합니다. 이 과정의 시작 단계로, 토마토 종자를 20 % 가정용 표백제에 넣고 지속적으로 혼합하며 15분 동안 멸균합니다.그 다음 종자를 층류 후드로 옮깁니다. 표백제를 제거하고 멸균된 실험실 등급의 물로 3회 세척합니다. 1/2 MS 배지가 들어 있는 GA7 박스에 종자 30개를 도말합니다.암실에서 약 2일 동안 발아하도록 둡니다. 종자가 발아하면 GA7 상자를 빛이 있는 곳으로 옮깁니다. 형질전환 전날, Can50이 포함된 고체 LB 배지에 A.rhizogenes 배양액을 도말하고 28°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 형질전환 당일, 층류 정화 작업대(laminar flow hood)에서 0.5배 MS 배지 50 mL에 Acetosyringone 25 µL를 첨가하고, 각 배양 튜브에 6 mL씩 분주합니다.구부러진 200 µL 팁을 사용하여 플레이트에서 A.rhizogenes 세포를 긁어낸 후 6 mL의 1/2 MS 액체 배지에 다시 부유시킵니다. 튜브를 볼텍싱하여 세포를 완전히 재부유시킵니다. 각 벡터의 세포를 재부유시킨 후, 세포 1 mL를 취해 600 nm의 고정 파장에서 광학 밀도를 측정합니다.멸균 여과지가 깔린 페트리 접시에 1/2 MS 액체 배지 2 mL를 넣습니다. 유묘에서 떡잎을 절취하여 적셔진 여과지 위에 놓습니다. 모든 떡잎을 수집한 후, 떡잎의 가장 끝부분 1 cm를 잘라내어 양끝이 절단된 떡잎 조각을 만듭니다.외식물체(ex plants)를 A.rhizogenes 용액에 넣고 혼합합니다. 가끔씩 뒤집어주며 20분 동안 배양합니다. A.rhizogenes 배양 중에, 각 컨스트럭트 형질전환용 페트리 접시에 거름종이 한 조각을 넣습니다.또한, 항생제가 포함되지 않은 1/2 MS 고체 배지를 라미나 플로우 후드 내에 배치하여 건조시킵니다. 멸균 핀셋을 사용하여 A.rhizogenes 용액에서 자엽을 꺼내 건조된 여과지에 올립니다. 다음 형질전환 과정을 진행하는 동안 조직이 마르지 않도록 페트리 접시 뚜껑으로 덮어둡니다.다음으로, 거름종이로 떡잎의 물기를 제거하고 배축면(abaxial side)이 위로 향하게 하여 1/2 MS 배지로 옮깁니다. 플레이트를 수술용 테이프로 감싸고 실온의 암소에서 2일 동안 공동 배양합니다. 공동 배양 후, 떡잎의 배축면이 위로 향하게 하여 첨가제가 포함된 1/2 MS 배지로 옮깁니다.수술용 테이프로 감쌉니다. 실온의 형광등 아래에서 16시간의 광주기를 유지하며 배양합니다. 1.5~2주 후, 멸균 집게와 메스를 사용하여 자엽에서 최소 2cm 길이의 뿌리를 절제하고, Ticarcillon/Clavulanate Acid 및 Kanamycin이 첨가된 1/2 MS 배지로 옮깁니다.10~15개의 뿌리를 하나의 플레이트로 옮깁니다. 마커를 사용하여 뿌리 끝의 위치를 표시합니다. 수술용 테이프로 감싼 후 배양실에서 유지합니다.일주일 후, 선택 배지에서 형질전환된 뿌리가 성장하는 것을 확인할 수 있습니다. 선호하는 DNA 추출 방법을 사용하여 DNA 추출을 위한 형질전환 뿌리 일부를 수확합니다. 형질전환 11일 후에는 자엽에서 모상근이 나타나는 것을 볼 수 있습니다.뿌리는 Ticarcillon/Clavulanate Acid 및 Kanamycin이 첨가된 1/2 MS 배지에서 약 1주일 동안 선별합니다. 회색 막대는 플레이팅 당시 뿌리 끝의 위치를 나타냅니다. 이는 4가지 서로 다른 hairy root 이벤트에서 두 가지 서로 다른 표적 유전자의 DNA 돌연변이를 확인하기 위해 PCR 산물을 클로닝하고 시퀀싱한 사례입니다.회색 상자는 GN20 GG 표적 서열을 나타내며, delta는 돌연변이의 유형을 나타냅니다. 표시된 돌연변이를 가진 클론의 수는 오른쪽에 표시되어 있습니다. 이는 DNA 돌연변이를 결정하기 위한 폴리아크릴아마이드 겔의 예시입니다.큰 결실과 헤테로듀플렉스 밴드는 표적 서열에 DNA 돌연변이가 존재함을 나타냅니다. 12회의 독립적인 이벤트 중 6회는 델타 기호로 표시된 바와 같이 돌연변이체로 판정되었습니다. WT는 야생형 대조군을, NT는 템플릿 미포함 대조군을 나타냅니다.숙달되면 일주일 안에 수십에서 수백 개의 CRISPR 벡터를 제작할 수 있으며, 몇 주 안에 trendulate 그룹 재료를 얻을 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 남아 있는 모든 Agrobacterium을 제거하고 성장을 억제하는 것이 중요합니다. Agrobacterium이 과하게 성장하면 뿌리 조직의 성장을 방해하고 조직을 고사시킵니다.이 영상을 시청한 후에는 DNA 어셈블리를 이용하여 CRISPR 벡터를 생성하는 방법과, hairy root 모델 시스템 및 토마토를 사용하여 해당 벡터를 테스트하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

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토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

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