Name: 현미경 뼈 전이의 효율적이고 선택적 모델링을위한 내부 장골 동맥 주입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 학습하세요 내부 장골 동맥 주입법을 통해 유방암 세포와 뼈 미세환경의 상호작용을 연구하는 방법을. 이 기술은 조직 손상 없이 효율적으로 뼈 전이 모델을 수립하여 암 연구에 활용됩니다.

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장 연구실의 연구는 X. H.-F.의 지원을 받았습니다. Z.의 NCI CA151293, CA183878, 유방암 연구 재단, 미국 국방부 DAMD W81XWH-13-1-0195, CA149196-04, McNair Medical Institute 및 H.W.의 미국 국방부 DAMD W81XWH-13-1-0296.

모든 동물의 작업은 의학의 베일러 대학의 동물 관리 지침에 따라 이루어졌다. 1. 셀 준비 주의 : 다른 암 세포주는 IIA 주입은 연구 목적에 따라 사용할 수있다. 우리는 유방암 세포주를 사용한 MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 및 연구에서 전립선 암 세포주 C4-2. 우리는 일반적으로 우리의 연구를 위해 GFP- 및 반딧불이 루시퍼 라제 표지 암 세포를 모두 사용하여 GFP - 루시 페라 표지 MCF7 세포 라인에서 여기에 몇 가지 데이터가 표시됩니다. <ol><li> 5 % CO 2에서 37 ℃에서 10 % FBS 및 0.1 ㎎ / ㎖의 페니실린 - 스트렙토 마이신을 함유하는 DMEM에서 세포를 유지한다. </li><li> 0.25 % 트립신 / EDTA 용액으로 90 % 합류 - IIA 주입하기 전에 80에서 세포를 Trypsinize. 셀 카운팅 10 ml의 PBS에서 셀을 두 번 세포를 씻어 다시 중단 차가운 PBS를 사용합니다. 5 분 동안 800 XG에서 PBS, 원심 분리기 세포를 제거합니다. </li><li> 세포를 다시 일시 중지빙냉 PBS에서 5 × 106 세포 / ml의 농도. </li><li> 100 μL의 GFP- 한 마우스의 IIA 주입을위한 반딧불이 루시퍼 라제 표지 암 세포를 사용합니다. 주 :. 따라서, 각각의 동물에 의해 수신 된 셀의 수는 5 × 5이 숫자는 세포주의 공격성에 기초하여 변경 될 필요가있다. </li><li> 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다. 주 : 진동은 사출 할 준비가 될 때까지 몇 분마다 세포 응집을 방지하기 위해 필요할 수있다. (예 : MDA-MB-231와 같은) 일부 세포주 (예를 들어, 45 μm의 세포 여과기를 통과하는) 더 엄격한 절차는 응집을 방지하기 위해 필요할 수있다. 혈관의 막힘은 조직 괴사가 발생할 수 있습니다, 따라서 실험을 교란하시기 바랍니다. </li></ol> 2. 동물 준비 <ol><li> 동물의 통증 관리를 위해, 아니 이하 24 이상의 시간 수술 전에 쥐에 건강 보조 식품 5 ㎎ / ㎏ / 일 카프로 펜 (또는 다른 진통제)을 얻었다. 관리수술 전에 0.1 ㎎ / ㎖ 프레 놀핀 피하에 60 분의 용량. 참고 : 옵션 절차는 별도의 에스트라 디올을 제공하기 위해 동물의 뒷면에 에스트라 디올 팔레트를 이식하는 것입니다. 이는 ER + 암 세포 성장 촉진 (예 : MCF-7 세포) (9)을 가속한다. </li><li> 복강 내 주사하여 - (100 ㎎ / ㎏ 80)과 자일 라진 (10 -12.5 ㎎ / ㎖) 케타민 6 주 이전 마우스 (약 20g) - 4를 마취. </li><li> 발가락 핀치에 의해 20g 마우스와 호흡 속도 50 % 감소의 관찰의 진정 작용의 적절한 수준을 확인하고 점막 핑크 (예를 들어, 마우스 귀 피부 및 발 피부). 수술 중에 이러한 생체 신호 매 15 분 모니터링 유지합니다. 참고 : 동물의 어떤 움직임은 동물이 수술 충분히 마취와 준비가되어 있음을 나타냅니다. </li><li> 건조 함을 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. </li><li> , 하복부에 특히 오른쪽 사타구니 영역을 마우스를 면도 곳 수술과 주사는 것발생한다. 참고 : 무 흉선 누드 마우스를 사용하는 경우이 필요하지 않습니다. </li><li> 그 뒷면에 마우스를 올려 그들의 자연적인 위치에 다리를 확산하고 테이프로 이동 해부 판지에 발가락 스틱. </li><li> 70 % 이소 프로필 에탄올을 적신 멸균 면봉와 오른쪽 사타구니 부위를 닦아, betadine 수술 스크럽 여러 번 하였다. </li></ol> 3. 일반 장골 정맥과 동맥의 위치 및 분리 <ol><li> 긴 4 번째와 3 번 핸들에서 개최 살균, # 10 탄소 강철 메스 블레이드를 사용하여 오른쪽 아래 복부에 5 일 젖꼭지 사이에 1.2 cm - 1.0의 피부 절개를합니다. 그 후 절개 부위를 제외하고는 동물의 시체를 충당하기 위해 무균 수술 드레이프를 사용합니다. </li><li> 표준 벤치 탑 해부 현미경으로 동물을 이동합니다. 주입을위한 4 배의 배율을 사용합니다. </li><li> 해부 현미경의 4 배 배율에서 지방 조직과 peritoneu 사이에 무딘 분리 집게를 삽입m, 그리고 장골 혈관과 신경 (그림 1 참조) 노출 양쪽에서 바깥쪽으로 조직을 밀어 넣습니다. 참고 : 중간 선에서 대동맥 및 동맥 가지의 아래 부분 사이의 동맥이 총장 골 동맥이라고합니다. 주입이 일어나는 곳이다. </li><li> 가까운 선박, 선박과 신경 사이 (막 등) 결합 조직을 돌파 똑바로 잘 포셉 한 쌍을 사용합니다. </li><li> 왼쪽에 직선 미세 집게를 전환합니다. 오른손을 사용하여 각도 미세 집게 한 쌍을 잡아. 결합 조직이 파괴되어 동일한 위치로 오른쪽 집게를 삽입합니다. 그리고 용기 아래 통해 오른손 집게 스틱. </li><li> 동시에 통과하는 오른손 집게를 안내하기 위해 용기의 왼쪽에있는 결합 조직에 왼손 집게를 삽입한다. </li><li> 오른손 집게 용기 아래 얻으면, 주변 TI로부터 용기를 분리하려고조금 더 ssue 한 다음 오른쪽 집게의 상단에 보관하십시오. </li><li> 오른쪽 집게에 4-0 실크 봉합사의 끝을 제공하기 위해 왼쪽 집게를 사용하고 용기 아래를 부드럽게 천천히 봉합사를 잡아 당깁니다. 참고 : 이제 모두 일반적인 정맥 및 동맥 혈관을 봉합에 의해 해제된다 (그림 2 참조). </li></ol> 4. 사출 및 후 분사 케어 <ol><li> 31 G 인슐린 주사기에 주입을위한 세포를 준비합니다. 주입 당 PBS에 세포 현탁액 100 ㎕를 사용합니다. 아래로 주입 된 세포를 막고 혈액 흐름을 차단하지 않도록 세포를 분리하고 응집을 방지하기 수회 피펫하고 확인. </li><li> 왼쪽 손에 각진 집게로, 집게에 부드럽게 개최 혈관을 갖는 봉합사의 안내에 따라 선박 아래에있는 집게를 넣어, 다음 집게의 두 팔을 엽니 다. 참고 : 집게의 두 팔 사이의 간격이 난 것입니다njection 사이트입니다. </li><li> 주입을위한 준비, 위쪽으로 바늘의 경사와 함께 오른쪽에 100 ㎕의 세포 현탁액로 31 G 바늘을 잡으십시오. </li><li> 동맥 루멘에 바늘을 삽입 (피가 바늘 끝을 입력합니다). 그런 다음 세포를 주입하는 천천히 세포 현탁액을 누릅니다. 세포 현탁액을 용기 내의 적혈구를 밀어 것이다. 혈관을 파괴하거나 세포 현탁액을 누설하지 않도록하십시오. </li><li> 주입이 완료되면, 조심스럽게 바늘을 철수하고 출혈을 멈추게하기 위해 왼쪽 집게에 선박을 들고 유지. 그런 다음 봉합을 당깁니다. </li><li> 왼쪽 집게을 당깁니다, 신속하게 출혈을 멈추게하기 위해 동맥 절개 영역을 누릅니다 면봉을 사용합니다. 참고 : 일반적으로 5-10 분 연속 압력이 출혈을 멈추게하기에 충분하다. </li><li> 중지 출혈하면 수술 영역의 피부 가장자리를 폐쇄 피부 접착제를 사용한다. 귀 태그를 확인하고 주입 된 세포의 분포를 조사하는 신호 생물 발광을 확인합니다. &lt;BR /&gt; 참고 : 성공적인 주입은 3 그림과 유사한 이미지가 발생합니다. <ol><li> 75 밀리그램 / 인트라 궤도 동을 통해 kg 마우스 농도로 PBS에서 / ㎖ 루시페린 100 ㎕를 15 mg을 주입하여 생물 발광 신호를 확인합니다. <ol><li> 내부 안와 주입 들어, 마우스 눈의 양쪽에 손가락을 넣어 안구 약간 눈 프레임으로부터 튀어 안구 코 사이 28 G 인슐린 주사기 바늘을 넣고 천천히 루시페린를 주입 주사기를 추진하기 위해 압력을 . 참고 : 올바른 위치에서, 바늘 (2)의 깊이에 도달 할 수 있어야합니다 - 경조직 (뼈)을 치기 전에 3mm를. </li><li> 10 생체 내 동물 전체 이미징 이미징 시스템에 마우스 플레이스 - 5 분 내에 60 초 (도 3 참조). 주 : 선택 사양 인 절차를 추가 에스트라 디올을 제공하기 위해 동물의 뒷면에 에스트라 디올 펠릿을 이식하는 것입니다. 이는 ER + 암 세포의 성장 (예를 들어, MCF-7 가속화셀) 15. </li></ol></li></ol></li><li> 이 깨어 때까지 따뜻한 가열 패드에 마우스를 둡니다. 포스트 수술 기간 동안 열개과 고통의 흔적을, 출혈을 모니터링 붓기. 고통의 흔적까지 통증 관리를 위해 주어진 진통 범위 (carprofin 건강 보조 식품 제안)와 케이지에 다시 마우스를 넣습니다. 수술 후 칠일 동안 동물에 세심한 관심과주의를 기울이십시오. </li></ol> 5. 모니터링 전이성 성장 <ol><li> 조직 형태 측정 : <ol><li> 뼈 조직을 베어링 수확 종양 후, 24 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드의 뼈를 고정 pH를 3 7.0 14 % EDTA 용액을 석회 - 오일을, 그리고 이전에 포함 (14)을 설명 파라핀 그들을 대상으로 할 수 없다. </li><li> 제 파라핀 포함 골이 3 μm의 두께 조직 및 이전 (14) 설명에 따라 헤 마톡 실린 / 에오신 염색의 표준 조직 학적 방법을 수행합니다. </li></ol></li><li> Immunohistochemis시험: <ol><li> 주제 파라핀 포함 된 종양 베어링 뼈 이전 14 설명 된 바와 같이 다양한 용도로 염색 면역 조직 화학 염색하는 슬라이드. 요약하면, 각각 항 Osterix 항체 및 항 알칼리 포스 파타 아제 (ALP) 항체에 의해 방지 GFP 항체, 및 발현 사이 골 형성 세포 (사전 조골 세포와 조골 세포)에 의해 MCF7 암 세포 발현 사이. </li></ol></li></ol>

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만 장골 동맥 암세포 주입 대상이지만, 우리는 주변 조직 모두에서 장골 동맥과 정맥을 분리하는 것을 권장하고 번들로 이들을 함께 리프트. 정맥 및 동맥 광범위하게 서로 접촉하기 때문이고, 정맥 혈관 벽이 얇고 파괴하기 쉽다. 암 세포에서만 동맥에 주입되지만 따라서 성공적인 주사의 경우, 시간과 함께 두 개의 용기를 유지하는 노력을 절약. 도 2에 도시 된 바와 같이 4-0 실크 봉합사는이 과정을 돕기 위해 사용된다. 봉합사는 중지 출혈이 발생해야 도움이 될 수있다. IIA 주입 대부분 단계 해부 현미경 하에서 수행 될 필요가있다. 마우스 선박의 절차 도전 만드는 부드럽고 작은 수 있습니다. 경험 100 % - 그러나, 충분한 연습 후 성공률 90에 도달 할 수있다. 이 기술로, 연구자가 될 수있는전통적으로 &quot;비 전이성&quot;생각을 포함하여 자신이 좋아하는 암 세포 모델의 뼈 식민지 ...

전이는 고형 종양에 의한 사망의 90 %를 차지한다. 뼈는 다양한 종류의 암, 특히 유방암과 전립선 암의 전이에 의해 영향을 가장 많이 기관이다. 병원에서 진단하면, 뼈 전이는 일반적으로 이미 자주 신경 학적 증상을 동반 뼈에 골 용해성 또는 골아 중 하나를 변경, 첨단 단계를 입력했습니다. 이전의 연구는 주로 그러나 우리는 현재 골 용해성 프로세스의 개시 전에 뼈의 미세 전이의 이해를 제한, 명백한 골 용해성 골 전이 1-3에 집중했다. 이는 적절한 실험 모델 및 방법 부족 적어도 부분적이다. 유방암 유전자 변형 마우스 모델들은 폐 전이 있지만, 훨씬 덜 효율적 뼈 4. 마찬가지로, 동소 이식 된 종양은 거의 어떤 뼈 열대 4T1 유방 carcinom으로, 자발적인 뼈 전이를 개발하지서브 클론 및 MSP는 예외 5-7로 PyMT 형질 전환 마우스 모델을 과발현. 인트라 경골 뼈 드릴 8-10에 암세포를 제공 할뿐만 아니라 지방 조직의 손상과 염증을 초래한다. 현재 유방암 세포주 내 심장 주입 뼈 정착 11-13 조사 주요 접근하고있다. 암세포 좌심실에 도입 된 후에 그러나 제한된 비율은 최종적 어려운 정량 방식으로 미세 전이를 추적 할 수있게 뼈 골수에 도달한다. 본 연구에서 우리는 선택적하여 지방 조직에 손상을주지 않고 뼈 골수 암 세포 농축, 뒷다리 조직에 암세포를 제공하도록하는 기술, 즉, 인트라 - 장골 동맥 (IIA) 주입 (14)을 설치한다. 때문에 뼈 특이성이 방법은 결국은 An 정착하기 전에 무통 암세포에 충분한 시간을 허용imals 다른 중요한 장기에 차 종양이나 전이에 굴복. 이러한 생물 발광 이미징, 면역 형광 염색 및 골 조직 형태와 같은 다른 기술의 다양한 결합하면 IIA 주입 특히 다중 셀에 하나의 암 세포의 진행을 추적하기 위해, 뼈 전이에 관한 연구 목적의 넓은 범위에 대한 잠재적으로 유용한 미세 전이. 특히, IIA 분사 암 세포 및 골 미세 셀 주변의 여러 유형의 상호 작용을 시각적으로 우리 수 있는지 보여 주었다.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep Amphatericin B</td><td>Lonza Biowhittaker</td><td>17-745E</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza Biowhittaker</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA 솔루션</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>45 &뮤; M 세포 여과기</td><td>VWR 국제 연구소</td><td>195-2545</td><td></td></tr><tr><td>MediGel CPF with carprofen&nbsp;</td>BCM<td></td><td>의 수의학 치료에서 통제된 품목</td><td>통증 관리를 위한</td></tr><tr><td>부프레노르핀&nbsp;</td><td>통증 관리를 위해</td>BCM<td></td><td>의 수의학 치료에서 통제 항목</td></tr><tr><td>Estradiol 펠릿</td><td>미국</td><td>SE-121</td><td></td></tr><tr><td>케타민 및 자일라진</td>의 혁신적인 연구 <td>BCM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수의사 연고</td>에서 통제 항목 <td>BCM에서 수의학 관리에서 통제 항목 눈</td><td>건조를 피하십시오</td>면도기 Oster 78005-050 용 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 털이 많은 생쥐</td></tr><tr><td>이소 프로필 에탄올</td><td>ACROS</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>베타 딘 외과 수술 스크럽</td> BCM <td></td><td></td># 10 메스 블레이드<td>의 수의학 치료에서 통제 항목</td></tr> <tr><td></td><td>Ted Pella, Inc</td><td>549-3CS-10</td><td>다중</td></tr><tr><td>번호 3 핸들</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>541-31</td><td>오토 클레이브 필요</td></tr><tr><td>멸균 수술 드레이프</td><td>Sai 주입 기술</td><td>PSS-SD1</td><td></td></tr><tr><td>스트레이트 펜치&nbsp;</td><td>Roboz 수술 기구</td><td>RS-5132</td><td>오토클레이브 필요</td></tr><tr><td>스트레이트 파인</td><td>파인 파이치 파인 사이언스 도구</td><td>11253-20</td><td>오토클레이브 필요</td></tr><tr><td>모서리 파인 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11253-25</td><td>오토클레이브 필요</td></tr><tr><td>4-0 Vicryl 실크 봉합</td>사 <td>Johnson & Johnson Health Care</td><td>J214H</td><td></td></tr><tr><td>31 G 인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>328418</td><td>다중</td></tr><tr><td>Q-팁 면봉(멸균)</td><td>VWR International Laboratory</td><td>89031-272</td><td></td></tr><tr><td>피부 접착제</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>31477</td><td>수술 부위 피부 폐쇄</td></tr><tr><td>귀 태그 어플리케이터</td><td>Fine Science Tools</td><td>24220-00</td><td></td></tr><tr><td>귀 태그</td><td>Fine Science Tools</td><td>24220-50</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK</td><td>빛을 피하고 얼음에 올려 놓으십시오</td></tr><tr><td>28 G 인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>329410</td><td>안와 내 주입용</td></tr><tr><td>Paraformadehyde</td><td>Alfa Aesar</td><td>30525-89-4</td><td>조직 고정용</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>OmniPur</td><td>4050</td><td>뼈 조직 석회화</td></tr><tr><td>용Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Leica</td><td>Leica S6E stereo</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina II 이미징 시스템</td><td>Advanced Molecular Vision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP antibodies (JL-8)</td><td>Clontech</td><td>632381</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ALP 항체</td><td>Abcam</td><td>ab108337</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Osterix 항체</td><td>Abcam</td><td>ab22552</td><td></td></tr></tbody></table>

현미경 뼈 전이의 효율적이고 선택적 모델링을위한 내부 장골 동맥 주입

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

장골내동맥(IIA) 주사는 동물에서 다양한 암세포의 전이성 병변을 도입하는 효율적인 방법입니다. 널리 사용되는 심장 내 및 경골 내 주사와 비교하여 IIA 주사는 몇 가지 장점을 제공합니다. 첫째, 많은 양의 암세포를 특이적으로 뒷다리 뼈에 전달할 수 있으므로 시공간적으로 동기화된 초기 단계 집락화 이벤트를 제공하고 파종된 종양 세포의 강력한 정량화와 신속한 검출을 가능하게 합니다. 둘째, 국소 조직을 손상시키지 않고 암세포를 순환계에 주입하여 뼈 집락 형성 과정을 혼란스럽게 하는 염증 및 상처 치유 과정을 방지합니다. 셋째, IIA 주사는 비뼈 기관에서 전이성 성장을 거의 일으키지 않기 때문에 동물이 다른 중요한 전이에 굴복하는 것을 방지하고 나태한 뼈 병변을 지속적으로 모니터링할 수 있습니다. 이러한 장점은 과거에는 대체로 파악하기 어려웠던 단일 암세포에서 다세포 미세전이로의 진행을 검사하는 데 특히 유용합니다. 생물학적 이미징 및 뼈 조직학의 최첨단 접근 방식과 결합하면 IIA 주입은 뼈 전이와 관련된 다양한 연구 목적에 적용될 수 있습니다.

그림 1은 해부학 적 위치와 총장 골 동맥 (적색)과 정맥 (파란색)의 관계를 보여줍니다. 그림 2는 해부 현미경 아래 장골 혈관과 신경의 상대적 위치를 보여줍니다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 혈관 신경 복막 벽 아래 오른쪽이고 피부 절개가 이루어지고, 복막 멀리 밀려 후에 밝혀 질 수있다. 일반 장골 정맥은 왼쪽에, 그리고 동맥에 비해 더 크고 더 어둡다. 동맥은 중간에, 핑크 보인다. 그것은 정맥보다 얇은하지만 두꺼운 근육 벽이있다. 정맥 및 동맥에 평행하고 서로 밀접하게 연결된다. 멀리 오른쪽에 흰색 천추 신경이다.도 2b는 3-에 의해 주위의 결합 조직, 근육과 신경 분리하고 들어 올려 엉덩 혈관을 보여줍니다0 실크 봉합사. 일...

이 원고는 실험적인 뼈 전이를 확립하기 위해 뼈를 포함한 뒷다리 조직에 암세포를 특이적으로 전달하는 기술인 장골 내 동맥(IIA) 주입의 자세한 절차를 제공합니다. 처음에는 유방 종양 모델로 확립되었지만, 이 프로토콜은 다른 암 유형으로도 쉽게 확장될 수 있습니다.

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 장골 동맥 주입을 통해 암세포를 뼈를 포함한 뒷다리 조직에 직접 전달함으로써 실험적 뼈 전이 모델을 구축하는 것입니다. 따라서 이 방법은 유방암의 뼈 정착, 특히 이 과정의 초기 단계에서 유방암 세포가 뼈 내 미세환경 세포와 어떻게 상호작용하는지에 대한 핵심적인 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 금일 장골 동맥 주입을 수행하였습니다.이 기술의 주요 장점은 국소 조직 손상을 일으키지 않고 다양한 암 유형에 대해 실험적 미세 골전이 모델을 효율적이고 선택적으로 구축할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자는 어려움을 겪을 수 있는데, 현미경 상에서 정확한 장골동맥 주사 위치를 찾는 것은 90% 이상의 주사 성공률을 달성하기까지 숙달 과정이 필요할 수 있기 때문입니다. 우선 5~6주령의 20 g 생쥐의 발가락을 꼬집어 적절한 진정 수준인지 확인하는 것으로 시작하십시오.안약을 도포한 후, 제모된 오른쪽 서혜부 부위를 순차적으로 멸균된 70% isopropyl ethanol에 적신 면봉으로 여러 번 닦아내고, 이어서 betadine 외과용 세정제로 닦아냅니다. 다음으로, 멸균 드레이프로 마우스 전체를 덮습니다. 그런 다음, 10번 탄소강 메스 날과 3번 핸들을 사용하여 오른쪽 하복부의 네 번째와 다섯 번째 젖꼭지 사이에 1~1.2 cm 길이로 피부를 절개합니다.동물을 표준 벤치탑 해부 현미경으로 옮깁니다. 4배율 대물렌즈 하에서, 지방 조직과 복막 사이의 절개 부위에 뭉툭한 분리 핀셋을 삽입하고, 조직을 양옆으로 밀어내어 장골 혈관과 신경이 드러나게 합니다. 다음으로, 곧은 미세 핀셋을 사용하여 혈관과 혈관에 가장 인접한 신경 사이의 결합 조직을 끊어냅니다.그 다음, 굴곡 핀셋을 결합 조직과 장골 혈관 아래로 밀어 넣는 동시에, 직선 핀셋을 혈관 반대편의 결합 조직에 삽입하여 굴곡 핀셋이 조직을 통과하도록 안내합니다. 이 단계에서는 장골 가장자리와 동맥을 하나의 묶음으로 분리하여 들어 올리는 것을 권장합니다. 종양 세포는 동맥에만 주입되지만, 두 혈관을 함께 분리하는 것이 시간과 노력을 절약할 수 있습니다.각진 핀셋을 배치한 후, 박리 과정 동안 혈관이 각진 핀셋 위에 놓인 상태를 유지하며 장골정맥과 장골동맥을 주변 조직으로부터 더 분리합니다. 혈관이 완전히 노출되면, 직선 핀셋을 사용하여 4-0 silk 봉합사의 끝을 각진 핀셋으로 전달하고 봉합사를 혈관 아래로 천천히 조심스럽게 당깁니다. 그러면 총장골정맥과 총장골동맥 혈관이 모두 봉합사에 의해 들어 올려져야 합니다.용기가 준비되면, 종양 세포를 여러 번 파이펫팅하여 단일 세포 용액으로 재현탁하고 뭉쳐 있는 세포 덩어리를 풀어줍니다. 그런 다음, 마우스 한 마리당 100 µL의 세포를 31 gauge 인슐린 주사기에 흡입합니다. 이제 봉합사를 가이드 삼아 각진 포셉을 혈관 아래로 다시 밀어 넣고, 포셉을 벌려 혈관이 팁 위에 살짝 얹어지도록 합니다.다른 쪽 손으로 바늘 팁의 사면이 위를 향하게 하여 포셉 팁 사이에 위치한 동맥 절편의 내강에 삽입합니다. 플런저를 천천히 눌러 세포를 주입합니다. 세포 현탁액이 혈관 내의 혈액을 밀어내며 씻어낼 것입니다.모든 세포 주입이 완료되면, 출혈을 방지하기 위해 핀셋으로 혈관을 들어 올린 상태에서 바늘을 조심스럽게 제거합니다. 그 다음, 봉합사를 끌어당겨 제거합니다. 마지막으로, 핀셋을 빠르게 제거하고 절개 부위를 면봉으로 5~10분 동안 눌러 지혈합니다.여기, 5×10⁵개의 GFP 루시페린 표지 MCF-7 유방암 세포를 장골동맥 내에 주입한 후, 후안정맥을 통해 d-루시페린을 투여하여 얻은 대표적인 전신 생물 발광 이미지가 제시되어 있습니다. 주입 14일 후, 장골동맥에 주입한 후지 뼈에서는 강한 생물 발광 신호가 나타난 반면, 반대측 대조군 뼈에서는 나타나지 않아 주입된 세포의 특이적 국소화를 확인하였습니다. 종양 형성 뼈의 H&E 염색 단면에서도 주입 14일 후 골 조직 내에 큰 핵을 가진 조밀한 자갈 모양의 세포 집단이 관찰되었으며, 이는 미세한 MCF-7 전이 병변임을 나타냅니다.또한, 골 조직 절편의 면역형광 염색 결과 MCF-7 세포가 조골세포 및 전조골세포와 함께 섞여 있는 것이 확인되었습니다. 이 기술을 숙달하면 10분에서 15분 내에 완료할 수 있습니다. 이러한 절차를 마친 후, 다른 방법을 사용하여 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.예를 들어, RNA-Seq을 사용하여 전이 틈새(metastasis niche) 내의 미세환경 세포들의 프로파일을 분석하고 이를 정상 세포와 비교할 수 있습니다. 이 기술은 유방암 및 전립선암 연구자들이 동물 모델에서 뼈 미세전이를 연구하는 한 가지 방법을 제공합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 내장골동맥 주입을 통해 유방암 뼈 전이 모델을 구축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.ketamine 및 xylazine을 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로 적절한 예방 조치를 취하시기 바랍니다.

intra-iliac-artery-injection-for-efficient-selective-modeling

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

뼈 전이의 pathogenesis에서 angiogenesis가 중요한 공정이므로 이미징 및 치료를위한 목표를 나타냅니다. 여기서는 특정 사이트 유방암 골 전이의 쥐 모델을 제시하고 비 invasively 이미지 angiogenesis에 전략을...

자기 공명 영상, 체적 계산의 Tomography 및 초음파를 이용한 유방암의 뼈 전이의 누드 쥐 모델에서 Angiogenesis의 멀티 모달 이미징

동물 모델은 자주 뼈에 암 전이를 공부하는 활용하고 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 뼈 전이 연구에 대한 종양 접종의 일반적인 두 가지 방법을 설명하고 간략하게이 모델을 모니터링하고 정량화하기 위해 이용 분석의 일부를 설명합니다.

뼈 전이의 모델

출처: Lim, M., et al. 암세포의 내부 경동맥 주입에 의한 뇌 전이 모델링. J. Vis. Exp. (2022)이 영상에서는 마취된 쥐가 암세포를 총경동맥(CCA)에 주입하여 뇌로의 표적 전달을 촉진하는 수술을 받습니다. 이 시술에는 경동맥의 정확한 봉합 및 조작이 포함되어 주입된 세포를 내부 경동맥(ICA)으로 향하게 하여 시간이 지남에 따라 뇌의 종양 형성을 촉진합니다.

암세포의 내부 경동맥 주입을 통한 뇌종양 전이 모델링

자가 및 동종 골 이식의 주입은 주요 두개 안면 뼈 손실을 치료하는 방법을 받아 구성한다. 그러나 혈관 신생, 세포 분화 및 골 형성 간의 상호 작용에 그래프트 조성물의 효과는 불분명하다. 우리는 이식 근접에서 혈관 신생 골 형성의 상호 의존성을 규명하는 것을 목표로 멀티 모달 이미징 프로토콜을 제시한다.

컴퓨터 단층 촬영 및 골 형성 - 혈관 신생 커플 링의 광학 이미징 두개골 뼈자가 이식과 동종 이식 통합을 평가하기 위해

문맥 주사를 통해 유선종양 세포를 쥐 간으로 전달하는 수술이 개발되었습니다. 이 모델을 사용하면 간의 종양 세포 유출, 파종, 생존 및 전이성 성장을 포함하여 완전히 면역이 있는 숙주에서 간 전이의 후기 단계를 조사할 수 있습니다.

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

두개 내 뇌 전이 모델링은 정확하고 시기 좋은 방법으로 치료에 종양 크기와 반응을 모니터링할 수 없다는 것에 의해 복잡합니다. 제시된 방법론은 자기 공명 화상 진찰 분석과 두개 내 종양 주입을 결합할 때, 정확하고 일관된 주사, 향상된 동물 감시 및 정확한 종양 부피 측정을 육성합니다.

두개 내 주입 및 자기 공명 이미징을 통해 뇌 전이를 모델링

뼈 전이 모델은 균일하게 또는 100% 발생률로 전이가 발생하지 않습니다. 직접 골내 종양 세포 주사는 폐 색전술을 초래할 수 있습니다. 우리는 고형 종양 이식편을 뼈에 이식하여 원발성 뼈 종양 및 뼈 전이를 모델링하여 재현 가능한 생착 및 성장을 유도하는 기술을 제시합니다.

원발성 뼈 종양 및 뼈에 이식된 고형 종양을 통한 뼈 전이 모델링

우리는 내인성 HER2 증폭 염증성 유방암 세포주의 꼬리 정맥 주사를 통해 생성된 유방암 뇌 전이의 이종이식 마우스 모델을 설명합니다.

염증성 유방암 세포의 꼬리 정맥 주입을 통한 뇌 전이 모델링

여기서, 본 발명자들은 골전이 병변이 있는 마우스 모델을 생성하기 위해 인간 전립선암 세포의 심장내 주사를 위한 프로토콜을 제시한다.

인간 전립선암 세포의 심장내 주사를 통해 뼈 전이 이종이식 마우스 모델 생성

입체정위 두개내 주입 기법은 종양 세포를 마우스 피질에 정밀하고 국소적으로 이식할 수 있게 하여 뇌의 전이 정착 연구에 강력한 모델이 됩니다.

뇌 전이 모델링: 입체정위 피질 내 주사를 통한 전이 정식 집락화 및 조직학적 성장 패턴 분석

학습하세요 내부 장골 동맥 주입법을 통해 유방암 세포와 뼈 미세환경의 상호작용을 연구하는 방법을. 이 기술은 조직 손상 없이 효율적으로 뼈 전이 모델을 수립하여 암 연구에 활용됩니다.

현미경 뼈 전이의 효율적이고 선택적 모델링을위한 내부 장골 동맥 주입

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