현미경 뼈 전이의 효율적이고 선택적 모델링을위한 내부 장골 동맥 주입
2016년 9월 26일
이 원고는 실험적인 뼈 전이를 확립하기 위해 뼈를 포함한 뒷다리 조직에 암세포를 특이적으로 전달하는 기술인 장골 내 동맥(IIA) 주입의 자세한 절차를 제공합니다. 처음에는 유방 종양 모델로 확립되었지만, 이 프로토콜은 다른 암 유형으로도 쉽게 확장될 수 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 장골내 동맥 주사를 통해 암세포를 뼈를 포함한 뒷다리 조직에 직접 전달하여 실험적인 뼈 전이를 확립하는 것입니다. 따라서 이 방법은 유방암의 뼈 집락화에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 특히 이 과정의 초기 단계에서 유방암 세포가 뼈의 미세환경 세포와 어떻게 상호 작용하는지 알 수 있습니다. 우리는 오늘 장골 동맥 주사를 맞았습니다.
이 기술의 가장 큰 장점은 국소 조직 손상을 일으키지 않고 다양한 암 유형에 대한 실험적인 현미경 뼈 전이염 모델을 효율적이고 선택적으로 확립한다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 현미경에서 정확한 장골 동맥 주입 위치를 찾는 데 90% 이상의 주입 성공률을 달성하기 위해 연습이 필요할 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 5-6주 된 20g 마우스의 발가락 꼬집기로 적절한 진정 수준을 확인하는 것으로 시작합니다.
안연고를 바른 후 면도한 오른쪽 사타구니 부위를 70% 이소프로필 에탄올에 적신 면봉으로 여러 번 닦은 다음 베타딘 수술용 스크럽을 합니다. 다음으로, 멸균 드레이프로 모든 마우스를 덮습니다. 그런 다음 멸균 번호 10 탄소강 메스 날과 숫자 3 손잡이를 사용하여 오른쪽 복부의 네 번째와 다섯 번째 젖꼭지 사이를 1-1.2cm 간격으로 절개합니다.
그리고 표준 탁상용 해부 현미경으로 동물을 옮깁니다. 4X 대물렌즈에서 지방 조직과 복막 사이의 절개 부위에 뭉툭한 분리 겸자를 삽입하고 조직을 양쪽 바깥쪽으로 밀어 장골 혈관과 신경을 드러냅니다. 다음으로, 곧고 가는 집게를 사용하여 혈관과 혈관에 가장 가까운 신경 사이의 결합 조직을 뚫습니다.
그런 다음 각진 집게를 결합 조직을 통해 장골 혈관 아래로 밀어 넣고, 직선 집게를 혈관 반대쪽의 결합 조직에 삽입하여 각진 집게를 조직을 통해 안내합니다. 이 단계에서는 장골 테두리와 동맥을 분리하고 들어 올리는 것이 좋습니다. 종양 세포는 동맥에만 주입되지만 두 혈관을 함께 분리하는 데 시간과 노력을 절약할 수 있습니다.
각진 겸자가 제자리에 놓이면 장골 정맥과 동맥을 주변 조직과 더 분리하여 해부 중에 각진 겸자 위에 혈관을 유지합니다. 혈관이 깨끗해지면 직선 집게를 사용하여 4-0 실크 봉합사의 끝을 각진 집게에 전달하고 봉합사를 혈관 아래로 천천히 부드럽게 당깁니다. 그런 다음 장골 총정맥과 동맥 혈관을 모두 봉합사로 지탱해야 합니다.
혈관이 준비되면 종양 세포를 위아래로 여러 번 피펫팅하여 단일 세포 용액으로 다시 현탁시키고 덩어리를 분해합니다. 그런 다음 마우스 한 마리당 100마이크로리터의 세포를 31게이지 인슐린 주사기에 흡입합니다. 이제 봉합사를 가이드로 사용하여 각진 집게를 혈관 아래로 다시 밀어 넣고 집게를 열어 혈관이 끝에 부드럽게 놓이도록 합니다.
다른 손으로 바늘 끝이 비스듬한 쪽이 위로 향하게 하여 집게 끝 사이의 동맥 단면의 내강에 삽입합니다. 플런저를 천천히 눌러 세포를 주입합니다. 세포 현탁액은 혈관을 통해 혈액을 씻어냅니다.
모든 세포가 전달되면 출혈을 방지하기 위해 겸자에 올라간 혈관을 유지하면서 바늘을 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 봉합사를 당겨 빼냅니다. 마지막으로 재빨리 겸자를 제거하고 면봉으로 절개 부위를 5-10분 동안 눌러 출혈을 멈춥니다.
본 연구에서는 장골내 동맥 내 5배를 10배로 5회 주입한 후 GFP 루시페린 표지된 MCF-7 유방암세포를 후방안와주사에 의한 d-루시페린 투여 후 대표적인 전체 동물 생물발광 이미지를 보여줍니다. 주사 후 14일째에 장골내 동맥이 주입된 뒷뼈에서 강력한 생물 발광 신호가 얻어졌지만 반대쪽 대조 뼈에서는 얻지 못하여 주입된 세포의 특정 위치를 확인했습니다. 종양이 있는 뼈의 H&E 염색을 절단한 결과, 장골내 동맥 주사 후 14일 후에 뼈 조직에서 미세한 MCF-7 전이성 병변을 나타내는 큰 핵을 가진 조약돌 같은 조약돌 같은 세포 집단이 나타났습니다.
또한, 뼈 부분의 면역형광 염색은 MCF-7 세포가 조골세포 및 조골세포와 함께 혼합되어 있음을 보여주었습니다. 이 기술은 일단 숙달되면 10분에서 15분 안에 완료할 수 있습니다. 다음 절차에 따라 다른 방법을 사용하여 추가 질문에 대답할 수 있습니다.
예를 들어, RNA-Seq를 사용하여 전이 틈새의 미세환경 세포를 프로파일링하고 정상 세포와 비교할 수 있습니다. 이 기술은 유방암 연구자와 전립선암 연구자가 동물의 뼈 미세전이를 연구할 수 있는 한 가지 방법을 제공합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 장골내 동맥 주사로 유방암 뼈 전이 모델을 확립하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
케타민과 자일라진을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 적절한 예방 조치를 취하십시오.
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개요
본 원고에서는 실험적 골전이를 유도하기 위해 암세포를 뼈를 포함한 후지 조직으로 전달하는 내장골동맥(intra-iliac artery, IIA) 주사 기법에 대해 상세히 설명합니다. 이 방법은 특히 유방암 세포와 골 미세환경 간의 상호작용을 연구하는 데 유용합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 종양학
- 실험 기법
배경
- 골전이는 암 환자에게서 흔히 나타나는 합병증입니다.
- 뼈 내 암세포 정착 기전을 이해하는 것은 치료법 개발에 있어 매우 중요합니다.
- 내장골동맥 주입법을 통해 암세포를 표적 전달할 수 있습니다.
- 이 기술은 다른 방법들에 비해 국소 조직 손상을 최소화합니다.
연구 목적
- 골전이 연구를 위한 모델을 구축하기 위함입니다.
- 유방암 세포와 골 미세환경 세포 간의 상호작용을 조사하기 위함입니다.
- 주입 기술의 정확성과 성공률을 향상시키기 위함입니다.
사용된 방법
- 암세포의 내장골동맥 주입.
- 5~6주령의 마우스 모델 사용.
- 발가락 꼬집기를 통한 진정 수준 모니터링.
- 높은 성공률을 달성하기 위한 주입 기술 연습.
주요 결과
- 이 기술을 통해 골전이 모델을 효율적으로 구축할 수 있습니다.
- 숙련도를 높이면 높은 성공률을 달성할 수 있습니다.
- 이 방법은 국소 조직 손상이 최소화됩니다.
- 유방암 세포의 초기 정착 단계에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.
결론
- 장골내동맥 주사는 암 연구에 있어 가치 있는 도구입니다.
- 이 방법은 유방암 외에도 다양한 암 유형에 맞게 조정하여 적용할 수 있습니다.
- 추가 연구를 통해 암과 뼈의 상호작용에 대한 이해를 높일 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
초기 단계 골전이의 신뢰할 수 있는 모델을 구축하는 것은 특히 미세전이 군집화를 표적으로 하는 치료적 개입을 평가하는 종양학 약물 발견 분야에서 여전히 중요한 과제로 남아 있습니다. 내장골동맥 주사 기법은 암세포가 뒷다리 뼈로 시공간적으로 동기화되어 퍼지게 함으로써, 전이된 종양 세포의 견고한 정량화를 지원하고 시술 중 조직 손상으로 인한 혼란스러운 염증 반응을 줄여줍니다. 이러한 접근 방식은 전신 장기 전이 없이 휴지기 골 병변을 지속적으로 모니터링할 수 있게 하여 전임상 연구의 예측 신뢰도를 높이며, 결과적으로 표적 검증 및 리드 화합물 발굴 노력을 위한 골전이 모델의 중개적 관련성을 향상시킵니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 조골세포 및 전조골세포와 같은 골 미세환경 구성 요소와 암세포 간의 초기 상호작용을 모델링함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 암세포를 뒷다리 뼈로 전달하는 선택적이고 효율적인 경로를 제공하여, 실험군 전반에 걸쳐 일관된 모델 생성을 용이하게 합니다.
- 전략적 가치: 생물발광 및 조직학적 분석을 통해 단일 세포에서 다세포 병변으로 이어지는 미세전이 진행 과정을 시각화함으로써, 골전이 경로의 기전적 리스크 제거(de-risking)를 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 생물발광 신호 강도 및 조직학적 병변 밀도와 같은 정량화 가능한 결과물을 생성하여, 전이 부담의 표준화된 평가를 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 국소 조직 손상 및 이와 관련된 상처 치유 교란 요인을 방지하여, 분석 재현성을 높이고 하위 분석의 변동성을 줄입니다.
- 전략적 가치: 표적 외 장기 전이를 최소화한 질환 관련 시스템을 구축함으로써, 스크리닝 캠페인에서 용량-반응 및 타이밍 연구를 위한 관찰 기간을 연장할 수 있습니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 주요 임상적 병목 구간인 골 조직 내 전이성 종양 세포에서 미세전이로의 진행 과정을 포착함으로써 질환 관련 시스템과 일치시킵니다.
- 운영적 가치: 종단적 이미징과 H&E 및 면역형광 염색과 같은 종점 분석을 지원하여, 발견 단계부터 전임상 검증까지의 연속성을 가능하게 합니다.
- 전략적 가치: 골 미세환경 내의 암-기질 공존 또는 틈새(niche) 형성을 방해하는 화합물에 대한 조기 효능 신호를 제공함으로써, 위험 조정된 진전 결정에 정보를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
장골내동맥 주입법은 표적 검증부터 리드 물질 발굴, 그리고 전임상 효능 평가에 이르는 발견 연속 과정에 부합하며, 특히 조기 전이 모델링이 기전 이해와 치료 가능 기간(therapeutic windows) 설정에 중요한 정보를 제공하는 골 표적 치료제 연구에 적합합니다.
- 발견 생물학: 종양 세포를 골격 부위에 제어 방식으로 전달함으로써 암 세포와 뼈 미세환경 간의 상호작용에 대한 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 고함량 스크리닝 플랫폼에 적합한 정량적 생물 발광 및 조직 병리학적 판독 결과가 포함된 분석 가능 생물학적 시스템을 제공합니다.
- 분석: 생물 발광의 광자속, 조직 절편의 병변 면적, 종양 및 기질 세포의 공동 국소화 지수를 포함한 측정 가능한 종속 변수를 생성합니다.
- 중개 연구: 임상적 뼈 전이에서 골용해성 또는 골형성성 진행에 앞서 나타나는 무혈관 미세전이 단계를 모델링하여 전임상 연속성을 연결합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 암 유형과 실험실에서 적용 가능한 표준화된 외과적 기술을 제시하여, 뼈 전이 모델 생성 시 프로젝트 간의 일관성을 증진합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 절차적 염증으로 인한 노이즈를 줄이고 표현형 변화를 약물 기전에 명확하게 귀속시킴으로써 타겟 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 정의된 해부학적 지표와 봉합사 유도 혈관 분리를 통해 표준화 및 재현성을 강화하여, 작업자 간의 변동성을 최소화합니다.
- 전략적 가치: 예상치 못한 뼈 친화성(bone tropism)으로 인한 후기 단계 실패를 줄여주는 조기 장기 특이적 전이 판독값을 제공함으로써 go/no-go 결정 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 동종 또는 이종 이식 모델의 치료군 간 전이 부담을 직접 비교할 수 있게 하여, 뼈 표적 후보 물질의 위험 조정 우선순위 설정을 용이하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 해부 현미경 하에서의 혈관 분리 및 봉합 결찰을 포함한 미세 수술 기법에 대한 숙련도가 필요합니다.
- 멸균 해부 현미경, 미세 핀셋, 인슐린 주사기 및 등장성 세포 현탁액 조제 장비의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 동물 복지와 모델 일관성을 보장하기 위해 마취 프로토콜(예: ketamine/xylazine) 및 수술 후 모니터링에 대한 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 적응 고려 사항으로는 암 세포주의 공격성과 마우스 계통의 가변성에 따른 주입 부피 및 세포 농도의 조정이 포함됩니다.
- 실질적인 제한 사항으로는 90% 이상의 주입 성공률을 달성하기 위한 학습 곡선과 서혜부 절개 시 복막 오염을 방지하기 위한 무균법의 필요성이 있습니다.
