현미경 뼈 전이의 효율적이고 선택적 모델링을위한 내부 장골 동맥 주입

이 원고는 실험적인 뼈 전이를 확립하기 위해 뼈를 포함한 뒷다리 조직에 암세포를 특이적으로 전달하는 기술인 장골 내 동맥(IIA) 주입의 자세한 절차를 제공합니다. 처음에는 유방 종양 모델로 확립되었지만, 이 프로토콜은 다른 암 유형으로도 쉽게 확장될 수 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 장골내 동맥 주사를 통해 암세포를 뼈를 포함한 뒷다리 조직에 직접 전달하여 실험적인 뼈 전이를 확립하는 것입니다. 따라서 이 방법은 유방암의 뼈 집락화에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 특히 이 과정의 초기 단계에서 유방암 세포가 뼈의 미세환경 세포와 어떻게 상호 작용하는지 알 수 있습니다. 우리는 오늘 장골 동맥 주사를 맞았습니다.

이 기술의 가장 큰 장점은 국소 조직 손상을 일으키지 않고 다양한 암 유형에 대한 실험적인 현미경 뼈 전이염 모델을 효율적이고 선택적으로 확립한다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 현미경에서 정확한 장골 동맥 주입 위치를 찾는 데 90% 이상의 주입 성공률을 달성하기 위해 연습이 필요할 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 5-6주 된 20g 마우스의 발가락 꼬집기로 적절한 진정 수준을 확인하는 것으로 시작합니다.

안연고를 바른 후 면도한 오른쪽 사타구니 부위를 70% 이소프로필 에탄올에 적신 면봉으로 여러 번 닦은 다음 베타딘 수술용 스크럽을 합니다. 다음으로, 멸균 드레이프로 모든 마우스를 덮습니다. 그런 다음 멸균 번호 10 탄소강 메스 날과 숫자 3 손잡이를 사용하여 오른쪽 복부의 네 번째와 다섯 번째 젖꼭지 사이를 1-1.2cm 간격으로 절개합니다.

그리고 표준 탁상용 해부 현미경으로 동물을 옮깁니다. 4X 대물렌즈에서 지방 조직과 복막 사이의 절개 부위에 뭉툭한 분리 겸자를 삽입하고 조직을 양쪽 바깥쪽으로 밀어 장골 혈관과 신경을 드러냅니다. 다음으로, 곧고 가는 집게를 사용하여 혈관과 혈관에 가장 가까운 신경 사이의 결합 조직을 뚫습니다.

그런 다음 각진 집게를 결합 조직을 통해 장골 혈관 아래로 밀어 넣고, 직선 집게를 혈관 반대쪽의 결합 조직에 삽입하여 각진 집게를 조직을 통해 안내합니다. 이 단계에서는 장골 테두리와 동맥을 분리하고 들어 올리는 것이 좋습니다. 종양 세포는 동맥에만 주입되지만 두 혈관을 함께 분리하는 데 시간과 노력을 절약할 수 있습니다.

각진 겸자가 제자리에 놓이면 장골 정맥과 동맥을 주변 조직과 더 분리하여 해부 중에 각진 겸자 위에 혈관을 유지합니다. 혈관이 깨끗해지면 직선 집게를 사용하여 4-0 실크 봉합사의 끝을 각진 집게에 전달하고 봉합사를 혈관 아래로 천천히 부드럽게 당깁니다. 그런 다음 장골 총정맥과 동맥 혈관을 모두 봉합사로 지탱해야 합니다.

혈관이 준비되면 종양 세포를 위아래로 여러 번 피펫팅하여 단일 세포 용액으로 다시 현탁시키고 덩어리를 분해합니다. 그런 다음 마우스 한 마리당 100마이크로리터의 세포를 31게이지 인슐린 주사기에 흡입합니다. 이제 봉합사를 가이드로 사용하여 각진 집게를 혈관 아래로 다시 밀어 넣고 집게를 열어 혈관이 끝에 부드럽게 놓이도록 합니다.

다른 손으로 바늘 끝이 비스듬한 쪽이 위로 향하게 하여 집게 끝 사이의 동맥 단면의 내강에 삽입합니다. 플런저를 천천히 눌러 세포를 주입합니다. 세포 현탁액은 혈관을 통해 혈액을 씻어냅니다.

모든 세포가 전달되면 출혈을 방지하기 위해 겸자에 올라간 혈관을 유지하면서 바늘을 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 봉합사를 당겨 빼냅니다. 마지막으로 재빨리 겸자를 제거하고 면봉으로 절개 부위를 5-10분 동안 눌러 출혈을 멈춥니다.

본 연구에서는 장골내 동맥 내 5배를 10배로 5회 주입한 후 GFP 루시페린 표지된 MCF-7 유방암세포를 후방안와주사에 의한 d-루시페린 투여 후 대표적인 전체 동물 생물발광 이미지를 보여줍니다. 주사 후 14일째에 장골내 동맥이 주입된 뒷뼈에서 강력한 생물 발광 신호가 얻어졌지만 반대쪽 대조 뼈에서는 얻지 못하여 주입된 세포의 특정 위치를 확인했습니다. 종양이 있는 뼈의 H&E 염색을 절단한 결과, 장골내 동맥 주사 후 14일 후에 뼈 조직에서 미세한 MCF-7 전이성 병변을 나타내는 큰 핵을 가진 조약돌 같은 조약돌 같은 세포 집단이 나타났습니다.

또한, 뼈 부분의 면역형광 염색은 MCF-7 세포가 조골세포 및 조골세포와 함께 혼합되어 있음을 보여주었습니다. 이 기술은 일단 숙달되면 10분에서 15분 안에 완료할 수 있습니다. 다음 절차에 따라 다른 방법을 사용하여 추가 질문에 대답할 수 있습니다.

예를 들어, RNA-Seq를 사용하여 전이 틈새의 미세환경 세포를 프로파일링하고 정상 세포와 비교할 수 있습니다. 이 기술은 유방암 연구자와 전립선암 연구자가 동물의 뼈 미세전이를 연구할 수 있는 한 가지 방법을 제공합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 장골내 동맥 주사로 유방암 뼈 전이 모델을 확립하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

케타민과 자일라진을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 적절한 예방 조치를 취하십시오.