대동맥 석회화와 염증의 혈관 평활근 세포 및 이미지의 석회화

본 절차의 전반적인 목표는 대동맥 혈관 석회화를 ex vivo에서 시각화하고, 배양된 일차 마우스 대동맥 평활근 세포를 사용하여 in vivo 혈관 석회화를 모델링하는 것입니다. 이 방법은 혈관 석회화의 분자적 기전을 연구하기 위한 in vitro 모델을 제공하고, in vivo에서 혈관 석회화 및 대식세포 염증을 평가할 수 있게 함으로써 혈관 질환 생물학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 질병의 초기 단계에서도 죽상경화성 병변 내의 칼슘 침착물과 대식세포 활성의 공동 국소화를 민감하게 정량화할 수 있다는 점입니다.

Caitlin과 저 외에 저희 실험실의 테크니션인 Robert Tainsh가 이 절차를 함께 시연하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 알코올 솜으로 꼬리를 소독하고 꼬리 정맥의 측면 위치를 찾습니다. 다음으로, 30-gauge 바늘을 저항 없이 꼬리 내부로 삽입하면서 주사기에 약간의 전방 압력을 가합니다.

그 다음, 100 µL의 calcium NIR 및/또는 100 µL의 cathepsin NIR을 일정한 속도로 주입합니다. 5초 후에 바늘을 제거하고, 주입 3~24시간 후에 대동맥을 채취합니다. 해부 현미경 하에서 복막을 제거하여 복부 장기를 노출시킵니다.

그 다음, 대동맥을 절단하지 않도록 주의하며 위장관 기관을 제거합니다. 이후 전횡격막에 외측 절개를 가하고 복부를 가로질러 절개를 계속합니다. 해부 가위를 사용하여 갈비뼈의 측면을 자르고 흉골 상부에 부착된 연조직을 제거함으로써 흉곽을 분리합니다.

그 다음 흉곽을 제거하여 폐를 노출시킵니다. 주의 깊게 폐를 제거합니다. 이어서 대동맥이 손상되지 않도록 주의하며 기관과 식도를 제거합니다.

이어서 장골 분지점부터 대동맥궁까지 대동맥 주변의 연조직을 제거합니다. 대동맥 주변 지방을 제거할 때 주의하십시오. 그 후, 흉부 대동맥과 대동맥궁의 주요 분지 주변에 남아 있는 지방과 연조직을 제거합니다.

다음으로 흉선을 제거합니다. 이제 근위 대동맥에서 심장을 조심스럽게 분리하여 흉강에서 제거합니다. 그 후 장골 분지점에서 원위 대동맥을 절단합니다.

인슐린 주사바늘을 사용하여 대동맥궁부터 대동맥으로 생리식염수를 주입해 남아 있는 혈구 세포를 씻어냅니다. 대동맥궁 혈관과 함께 대동맥을 분리하여 신체에서 완전히 제거합니다. 영상 촬영 전까지 대동맥을 얼음 위에 놓인 생리식염수 용액에 보관합니다.

이 단계에서는 해부가 완료될 때까지 대동맥을 차가운 HBSS에 넣어 둡니다. 멸균된 조직 배양 후드 내에서, 대동맥을 35 X 10 millimeter 조직 배양 접시에 담긴 대동맥 소화 용액으로 옮깁니다. 그런 다음 37 degree Celsius에서 30분 동안 부드럽게 간헐적으로 흔들어주며 배양합니다.

소화 과정 후, 대동맥은 늘어나거나 해진 것처럼 보여야 합니다. 해부 현미경 하에서 내막층은 손상되지 않도록 유지하면서 대동맥의 외막층을 제거하십시오. 이를 위해 대동맥 한쪽 끝의 외층을 벗겨낸 다음, 양말을 벗기듯 아래의 내막층으로부터 제거하십시오.

외막을 제거한 후, 남은 대동맥을 새로운 배양 접시에 세포 배양 배지와 함께 넣고 37 degree Celsius에서 2~4시간 동안 배양합니다. 그 다음, 대동맥을 1~2 mm 너비의 링 형태로 자릅니다. 이 링들을 대동맥 소화액이 담긴 새로운 조직 배양 접시로 옮기고, 37 degree Celsius에서 완만하게 간헐적으로 흔들어주며 120분 동안 배양합니다.

배양하는 동안, 피펫으로 용액을 여러 번 빨아올렸다가 내뱉어 세포를 재부유시킵니다. 그 후, 따뜻한 세포 배양 배지 5 mL를 소화 용액에 첨가하고 이를 15 mL 원심분리관으로 옮깁니다. 200 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 배지를 흡입하여 제거하고, 원하는 부피의 세포 배양 배지에 세포를 재부유시킵니다.

혈관 평활근 세포의 석회화를 유도하려면, 세포를 6-웰 배양 플레이트로 옮겨 부착되도록 합니다. 그다음, 석회화 배지를 다시 공급합니다. 세포를 37 °C에서 최소 7일 동안 배양합니다.

그 후, 세포 배양 플레이트에서 배지를 흡입하여 제거합니다. 이온수를 사용하여 세포를 한 번 세척합니다. 실온에서 10% formalin 1 mL에 20분 동안 담가 세포를 고정합니다.

그런 다음 포르말린을 제거하고 고정된 세포를 증류수로 5분 동안 세척합니다. 이어서 60~100W 전구 아래에서 5% 질산은 용액 1mL에 세포를 1~2시간 동안 배양합니다. 그 후, 질산은 용액을 흡입하여 제거하고 증류수로 5분 동안 세척합니다.

5분 후, 세포를 증류수에 희석한 5% sodium thiosulphate 용액 1 mL에 5분 동안 담가 반응하지 않은 은을 제거합니다. 그 후, 세포를 증류수로 5분 동안 헹굽니다. von Kossa로 염색된 세포는 이제 표준 도립 광학 현미경으로 이미징할 준비가 되었습니다.

이 그림에서는 야생형, MGP 녹아웃 마우스 및 LDLR 녹아웃 마우스의 미정맥을 통해 calcium NIR 및 Cathepsin NIR을 주입하였으며, 24시간 후에 대동맥을 채취하여 NIR 형광 이미징으로 평가하였습니다. 야생형 마우스에서는 대동맥 석회화나 대식세포의 존재가 거의 나타나지 않습니다. LDLR 녹아웃 마우스의 대동맥에서는 대식세포 축적과 동일한 위치에서 광범위한 석회화가 관찰됩니다.

이와 대조적으로, MGP 결핍 마우스는 대식세포 침윤이 없는 상태에서도 대동맥 석회화가 발생합니다. 본 실험에서는 MGP 결핍 마우스로부터 배양된 대동맥 VSMC를 분리한 후 GFP 또는 MGP를 발현하는 아데노바이러스를 감염시켰습니다. 야생형 마우스에서 분리한 대동맥 VSMC에는 대조군으로 scrambled siRNA 또는 MGP를 표적으로 하는 siRNA를 형질전환시켰습니다.

세포를 석회화 배지 A에서 7일 동안 배양한 후, von Kossa 염색으로 고정 및 염색하였습니다. 배경 제거 후 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 칼슘 염색 정도를 정량화하였습니다. 이러한 기술들이 발전함에 따라, 과학자들은 죽상경화증 및 혈관 석회화를 ex vivo로 이미징할 수 있게 되었습니다.

그리고 인비트로(in vitro)에서 혈관 석회화를 모델링하는 것입니다. 이는 혈관 질환에 대한 새로운 약물 치료의 효과를 테스트할 가능성을 열어줍니다. 이 영상을 시청하고 나면, 마우스의 대동맥에서 일차 대동맥 혈관 평활근 세포를 분리하는 방법, 근적외선 형광 이미징 프로브를 사용하여 죽상경화성 플라크를 시각화하는 방법, 그리고 인비트로(in vitro)에서 석회화된 혈관 평활근을 시각화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.