소뇌 과립 신경 세포 배양에서 Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide 이중 염색을 이용한 신경 생존력의 평가

이 절차의 전반적인 목표는 소뇌 과립 뉴런 배양에서 세포 생존율을 정확하게 측정하는 것입니다. 이 방법은 신경 과학 및 신경 약리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 MISTA 세포 배양에서 뉴런과 원치 않는 신경교세포를 구별할 수 있다는 것입니다.

절차를 시연하는 사람은 Lin Jiajia, Wang Jialing, Xu Dilin, 그리고 제 연구실의 학부생 3명입니다. 생후 8일 된 새끼 쥐의 머리를 먼저 구멍에 가위를 꽂고 귀에서 눈까지 두개골의 양쪽을 잘라 해부를 시작합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 두개골을 들어 올립니다.

집게를 사용하여 소뇌를 분리하고 박리 용액이 들어 있는 35mm 접시에 넣습니다. 플레이트를 해부 현미경의 스테이지로 옮기고 두 쌍의 집게를 사용하여 수막과 혈관을 제거합니다. 칼날을 사용하여 조직을 자른 다음 조직을 30ml의 해부 용액이 들어 있는 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

1, 500 x g의 실온에서 5분 동안 원심분리기. 원심 분리 후 상등액을 흡인하고 펠릿을 저장하십시오. 다음으로, 펠릿에 트립신 용액을 넣고 부드럽게 흔들어 재현탁합니다.

그런 다음 튜브를 섭씨 37도의 수조에 15분 동안 넣습니다. 15분 후, DNase One, 대두 트립신 억제제, 황산마그네슘 용액을 넣고 흔듭니다. 그런 다음 1, 500 x g의 실온에서 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 흡인시킨 후, 희석이 적은 DNase One, 대두 트립신 억제제 및 황산마그네슘 용액에 펠릿을 재현탁합니다. 다음으로 15mm 튜브 2개를 준비합니다. 세포의 절반을 각 튜브에 넣고 솜 마개 파스퇴르 피펫을 사용하여 위아래로 60-70회 피펫팅하여 세포를 균질화합니다.

균질화 후 각 15ml 튜브에 3ml의 황산마그네슘과 염화칼슘 용액을 추가합니다. 튜브를 실온에서 10분 동안 그대로 둡니다. 시간이 경과하면 면봉이 꽂힌 파스퇴르 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 새 15mm 튜브로 옮깁니다.

실온에서 5분 동안 원심분리기를 실시하고 1, 500 x g. 펠릿에 배양 배지를 첨가하여 약 1.5 x 10의 세포 밀도로 희석하여 밀리리터당 6번째 세포로 만듭니다. 세포를 6웰 플레이트에 피펫으로 넣고 섭씨 37도와 5% 이산화탄소의 인큐베이터에서 배양합니다.

24시간 후, 플레이트를 인큐베이터로 되돌리기 전에 AraC 원액을 최종 농도인 1밀리몰까지 첨가하여 신경교세포의 성장을 억제합니다. 그런 다음 7일째에 D-포도당 원액에 50마이크로리터를 첨가하여 최종 농도 1밀리몰까지 만듭니다. 플루오레세인 디아세테이트를 최종 농도 10마이크로그램/밀리리터로 혼합하고 프로피듐 요오드화물을 밀리리터당 50마이크로그램 및 10밀리리터의 PBS로 혼합하여 염색을 시작합니다.

FDA/PI 용액을 볼텍싱하여 혼합하고 얼음 위에 놓습니다. 배양 플레이트를 얼음 위에 놓습니다. 피펫 팁으로 세포를 건드리지 않고 배양 배지를 조심스럽게 흡인한 다음 차가운 PBS를 천천히 첨가합니다.

PBS를 흡입한 다음 차가운 FDA/PI 또는 FDA/PI Hoechst 작업 솔루션을 추가합니다. 접시를 얼음 위에 5분 동안 올려 놓습니다. 다음으로, FDA/PI 또는 FDA/PI/Hoechst 작업 용액을 흡인한 후 각 웰에 콜드 PBS를 추가합니다.

형광 현미경이 올바르게 설정되었는지 확인하십시오. 100 - 300밀리초의 노출 시간과 2.8배의 아날로그 게인을 사용하여 각각 520, 620 및 460나노미터에서 FDA, PI 및 Hoechst의 형광 방출을 감지합니다. 형광 이미지를 수집한 후 위상차 모드를 사용하여 일반 조명 아래에서 이미지를 촬영합니다.

FDA/PI 이중 염색의 경우, 그래픽 편집 소프트웨어에서 FDA 양성 층을 PI 양극 층 위로 드래그하여 세포 이미지를 오버레이합니다. 레이어 패널의 불투명도 필드에 50%를 입력하여 FDA 포지티브 레이어의 불투명도를 조정합니다. Layer 메뉴를 열고 Merge Visible 버튼을 클릭하여 두 레이어를 병합합니다.

Image, Adjustments, Brightness/Contrast 아래의 Contrast 필드에 50을 입력하여 오버레이 이미지의 대비를 설정합니다. 오버레이 이미지에 FDA 및 PI 이중 양성 세포가 없는지 확인합니다. FDA/PI/Hoechst 삼중 염색의 경우, FDA 포지티브 레이어를 PI 포지티브 레이어에서 다시 드래그하여 FDA 포지티브 레이어의 불투명도를 조정하고 이전과 같이 이미지를 병합하여 세포 이미지를 오버레이합니다.

그런 다음 병합된 레이어에서 Hoechst 포지티브 레이어를 드래그합니다. 레이어 패널의 불투명도 필드에 50%를 입력하여 Hoechst 포지티브 레이어의 불투명도를 조정하고 레이어 메뉴를 열고 Merge Visible 버튼을 클릭하여 두 레이어를 병합합니다. 형광 모드에서 촬영한 이미지와 위상차 모드에서 촬영한 이미지를 비교하여 크고 불규칙한 신경교세포와 소뇌 과립 뉴런을 시각적으로 구별합니다.

다음 이미지는 작은 뉴런과 크고 불규칙한 신경교세포가 모두 CGN 배양에 존재함을 보여줍니다. 이 이미지는 in vitro 8일째에 CGN 배양물의 GAP-43 아미노 염색을 보여줍니다. 파란색 화살표는 뉴런을 나타냅니다.

여기에서는 신경교세포의 GFAP 아미노 염색을 보여줍니다. 흰색 화살표는 신경교세포를 나타냅니다. 이 위상차 이미지는 세포의 형태를 보여줍니다.

신경교세포와 뉴런을 구별할 수 있는 FDA/PI hook staining은 CGN 배양에서 뉴런 생존율을 정확하게 평가하는 데 유리합니다. 이것은 정상 성장 배지에서 성장한 삼중 염색 세포의 병합 이미지입니다. 화살표는 전형적인 신경교세포를 보여줍니다.

여기서, 유사한 배양액이 낮은 칼륨을 함유한 배지로 처리되었으며, 화살표는 다시 전형적인 신경교세포를 나타냅니다. 또한 빨간색 프로피듐 요오드화물 염색의 출현에 주목하십시오. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다.

1차 피질 배양 및 1차 해마 배양과 같은 다른 혼합 세포 배양에도 유사한 전략을 적용하여 신경 세포의 생존력을 정확하게 분석할 수 있습니다.