Name: 소뇌 과립 신경 세포 배양에서 Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide 이중 염색을 이용한 신경 생존력의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 배우세요 소뇌 과립 신경 세포 배양에서 Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide 이중 염색을 이용한 신경 생존력 평가 방법입니다. 이 기술은 신경과학 및 신경약리학 연구에서 신경세포와 신경교세포를 구분하여 정확한 세포 생존율을 측정합니다.

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이 연구는 절강 성 자연 과학 재단 (LY15H310007), 절강 성 비영리 기술 응용 연구 프로젝트 (2016C37110), 중국 국립 자연 과학 재단 (U1503223, 81673407), 닝보 국제 과학 기술 협력 프로젝트 (2014D10019), 닝보시 생명 과학 및 건강 혁신 팀 (2015C110026), 과학 기술 광동성 국제 협력 프로젝트 (2013B051000038), 심천 기본 연구 프로그램 (JCYJ20160331141459373), 광동 홍 (GHP / 012 / 16GD), 홍콩 연구 기금위원회 (15101014), 홍콩 폴리 테크닉 대학 (G-YBGQ), 닝보 대학의 KC 웡 마그나 기금 등이있다.

모든 절차는 실험실 동물의 관리와 사용을위한 국립 보건원 (NIH) 안내서 (NIH Publications No. 80-23, 1996 년 개정)를 따르고 Ningbo University의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) SYXK-2008-0110). 1. 솔루션 및 문화 미디어의 준비 참고 : 시약 및 스톡은 무균 조건에서 준비해야합니다. 구멍 크기가 0.22 μm 인 필터를 사용하여 필터링하여 소독하십시오. <ol><li> 이중 증류수 (ddH 2 O) 10 ML에 PLL 5 MG를 추가하여 Poly-L-Lysine (PLL) 스톡 솔루션을 준비하십시오. 필터링을 통해 소독하십시오. 분주하고 -20 ° C에서 PLL 스톡 솔루션을 몇 달 동안 저장하십시오. </li><li> Krebs 완충액에 NaCl 7.25g, KCl 0.4g, NaH2PO4 0.14g, D- 글루코스 2.6g 및 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 5.94g을 100mL의 ddH2 &lt;/ sub&gt; O. 필터링을 통해 소독하십시오. 한 달 동안 4 ℃에서 Krebs 완충액을 보관하십시오. </li><li> Mg2SO4 3.82 g을 ddH 2 O 100 mL에 넣고 3.82 % Mg 2 SO 4 용액을 조제한다. 여과하여 소독한다. 몇 개월 동안 4 ℃에서 Mg 2 SO 4 용액을 보관하십시오. </li><li> CaCl 2 1.2 g을 ddH 2 O 100 mL에 넣고 1.2 % CaCl 2 용액을 조제한다. 여과하여 소독한다. 몇 개월 동안 4 ℃에서 CaCl 2 용액을 보관하십시오. </li><li> 100mL의 ddH 2 O에 KCl 15g을 가하여 2M KCl 용액을 조제한다. 여과하여 소독한다. 몇 달 동안 4 ℃에서 KCl 용액을 보관하십시오. </li><li> D - 글루코스 1.8g을 ddH 2 O 100mL에 넣고 D- 글루코스 스톡 용액을 준비한다. 여과하여 소독한다. D- 글루코오스 용액을 나누어서 4 ℃에서 1 개월 동안 보관하십시오. </li><li> Cytosine β-D-Arabinofuranoside (Ara-C) 스톡 솔톨 준비이온은 0.24 g의 Ara-C를 10 mL의 ddH 2 O에 첨가하여 제거한다. 여과하여 소독한다. 몇 분 동안 4 ℃에서 분주하고 Ara-C 보관 용액을 보관하십시오. </li><li> FBS (Fetal Bovine Serum) 25 mL, 100x 글루타민 2.5 mL, 2M KCl 용액 2.78 mL, 기본 중 독수리 (BME)의 100x 항생제 2.5 mL를 사용하여 250 mL의 배지 (25-30 새끼) . 250 mL로 부피를 조절하고 여과하여 멸균한다. </li><li> 2.5x 100x 글루타민 용액, 2.78ml 2M KCl 용액 및 2.5x 100x 항생제를 사용하여 25K 배지를 BME에 준비한다. 250 mL로 부피를 조절하고 여과하여 멸균한다. </li><li> BME에서 2.5x 100x 글루타민과 2.5x 100x 항생제를 사용하여 5K 배지를 준비한다. 250 mL로 부피를 조절하고 여과하여 멸균한다. 참고 : 배양 배지, 25K 배지 및 5K 배지는 새로 준비해야합니다 </li><li> 1 mL의 아세톤에 5 mg의 FDA를 첨가하여 FDA 저장 용액을 준비한다. 장기 보관을 위해서는 4 ℃에서 FDA 보관 용액을 보관하십시오. &lt;/ li&gt; <li> 1 mL의 ddH 2 O에 1 mg의 PI를 첨가하여 PI 저장 용액을 준비하십시오. 몇 달 동안 4 ℃에서 PI 저장 용액을 보관하십시오. </li><li> Hoechst 33342 5 mg을 ddH 2 O 1 mL에 넣고 Hoechst 원액을 준비하십시오. 몇 달 동안 4 ℃에서 Hoechst 원액을 보관하십시오. </li></ol> 2. 해 해제의 준비 참고 : 해부하기 전에 1 일하십시오. <ol><li> 해파드 용액을 150 ML의 ddH 2 O에 Krebs 버퍼 15 ML, 3.82 % Mg 2 SO 4 솔루션 1.2 ML 및 소 혈청 알부민 (BSA) 0.45 g을 추가하여 준비합니다. NaOH를 사용하여 7.4로 산도를 조정합니다. </li><li> 다음과 같이 5 x 50 mL 튜브에 라벨을 붙이십시오 : 1, 2, 3, 4 및 5. </li><li> 필터가있는 50 mL 주사기에 절개 용액 40 mL를 넣으십시오. 튜브 1에 해부 용액 30 mL를 여과하고 조직을 처리하는 데 사용되는 몇 가지 35 mm 세포 배양 접시에 각각 2 mL 씩 넣습니다. </li><li> ~까지ube 2, 해부 용액 50 mL에 12.5 mg의 트립신을 넣는다. 볼 텍싱으로 완전히 혼합하십시오. 필터링을 통해 소독하십시오. </li><li> 3 관에 해부액 15 mL에 1.2 mg의 DNAse I, 7.8 mg의 대두 트립신 저해제, 150 mL의 3.82 % Mg 2 SO 4 용액을 넣는다. 볼 텍싱으로 완전히 혼합하십시오. 필터링을 통해 소독하십시오. </li><li> 튜브 4에 튜브 3의 용액 5 mL를 넣는다. 해파 용액 10.5 mL를 넣는다. 필터링을 통해 소독하십시오. </li><li> 튜브 5에 해부 용액 12.5 mL에 3.82 % Mg 2 SO 4 용액 100 μL와 1.2 % CaCl 2 용액 15 μL를 넣는다. 볼 텍싱으로 완전히 혼합하십시오. 필터링을 통해 소독하십시오. </li><li> 사용 전에 모든 튜브를 4 ° C에 보관하십시오. </li></ol> 3. 세포 배양 판 코팅 참고 : 해부하기 전에 1 일하십시오. <ol><li> 100 mL의 ddH 2 O (최종 농도 : 5 μg / mL)에 PLL 원액 1 mL를 넣는다. 플라스틱 코팅poly-L-lysine 용액 5 μg / mL를 첨가하여 6- 웰 또는 12 웰 세포 배양 플레이트 (6 웰 세포 배양 플레이트의 웰 당 2 mL 또는 12 웰 세포 배양 플레이트의 웰당 1 mL)를 첨가 하였다. </li><li> 실온에서 1 일 동안 (또는 37 ° C에서 2 시간 동안) 배양하십시오. 해부하기 전에 1-2 시간, 피펫을 사용하여 솔루션을 제거합니다. ddH 2 O로 한 번 씻고 세포 배양 후드에서 말립니다. </li></ol> 4. 8 일 된 Sprague-Dawley Rats에 대한 조직 처리. <ol><li> 얼음에 100mm 접시를 놓으십시오. 한 켤레의 소독 가위를 사용하여 쥐 새끼를 접시에 처치하십시오. </li><li> 구멍이있는 매그넘에 가위를 삽입하고 귀에서 눈으로 두개골의 양면을 자릅니다. 한 쌍의 포셉을 사용하여 두개골을 들어 올리십시오. 전체 뇌가 두개골에 있는지 확인하십시오. 소뇌를 분리하고 포셉 한 켤레를 사용하여 위에서 언급 한 35mm 요리에 넣어. </li><li> 해부 현미경으로 작업하십시오. 두 쌍의 포셉으로 수막과 혈관을 제거하십시오.. </li><li> 칼로 티슈를 자른다. 튜브를 튜브에 넣으십시오. RT와 1,500 x g에서 5 분간 원심 분리하십시오. </li><li> 뜨는을 대기음. 펠렛을 저장하십시오. </li><li> 튜브 2의 용액을 펠렛에 넣는다. 부드럽게 흔들어서 Resuspend. </li><li> 튜브를 37 ° C의 수 욕조에 15 분간 놓습니다. 부드럽게 3 분마다 흔들어. </li><li> 튜브 4의 용액을이 용액에 첨가한다. 흔들어서 실온에서 5 분간 원심 분리하고 1,500 x g. </li><li> 뜨는을 대기음. 펠렛을 저장하십시오. </li><li> 튜브 3에 솔루션을 추가하여 펠렛을 resuspend. </li><li> 두 개의 15 mL 튜브를 준비하십시오. 각 튜브에 세포의 절반을 배치하십시오. 셀을 균질화하기 위해 목화 플러그 파스퇴르 피펫을 사용하여 60-70x 위아래로 피펫. </li><li> 튜브 15에 3 mL의 용액을 각 15 mL 튜브에 첨가한다. RT에서 10 분간 앉아서 면봉으로 된 파스퇴르 (Pasteur) 피펫으로 조심스럽게 상등액을 제거하십시오. 상등액을 새로운 15 mL 튜브에 넣고 RT와 1,500 x g에서 5 분간 원심 분리합니다. </li><li> 에이상층 액을 증발시킨다. 펠렛을 저장하십시오. </li><li> 펠렛에 배양 배지를 넣어 약 1.5 x 106 세포 / mL (10 마리의 새끼를 약 100 mL)의 세포 밀도를 얻습니다. </li><li> 세포를 문화 플레이트에 넣고 37 ° C 및 5 % CO 2 인큐베이터에서 배양하십시오. </li></ol> 5. 배양 중 Ara-C와 D-glucose의 첨가 <ol><li> 24 시간 후, 신경 세포의 성장을 억제하기 위해 Ara-C 저장 용액 (12- 웰 세포 배양 플레이트 또는 10- 웰 세포 배양 플레이트에 대해 20 μL / 웰, 최종 농도 : 1 mM)을 첨가한다. </li><li> 7 일에, 최종 농도가 1 MM되도록 12 잘 세포 배양 플레이트 또는 6 잘 세포 배양 플레이트에 대한 우물 당 100 μL에 대한 우물 당 50 μL D- 포도당 스톡 솔루션을 추가합니다. </li></ol> 6. CGN 배양에서의 FDA-PI 이중 염색 및 FDA-PI-Hoechst 삼중 염색 <ol><li> 20 μL의 FDA 저장 용액을 첨가하여 FDA-PI 작업 용액 준비최종 농도 : 10 μg / mL)와 10 mL의 PBS에 50 μL의 PI 스톡 용액 (최종 농도 : 50 μg / mL)을 넣었다. 볼 텍싱 (vortexing)하여 섞어 얼음 위에 놓습니다. <ol><li> FDA-PI-Hoechst 작업 용액의 경우 FDA 저장 용액 (최종 농도 : 10 μg / mL) 20 μL, PI 저장 용액 (최종 농도 : 50 μg / mL) 50 μL, Hoechst 원액 10 μL (최종 농도 : 5 μg / ML) 10 ML PBS에. 볼 텍싱 (vortexing)하여 섞어 얼음 위에 놓습니다. 참고 : 사용 직전에 FDA-PI 작업 솔루션 및 FDA-PI-Hoechst 작업 솔루션을 새로 준비하십시오. </li></ol></li><li> 인큐베이터에서 세포 배양 플레이트를 꺼냅니다. 얼음에 올려 놓으십시오. </li><li> 배양기를 대기음으로 감기는 PBS로 교체하십시오. 참고 : 솔루션 변경은 천천히 그리고 조심스럽게 이루어져야합니다. 피펫 팁으로 세포를 만지지 마십시오. </li><li> 차가운 PBS를 대기음으로 옮겨 차가운 FDA-PI 또는 FDA-PI-Hoechst 작업 용액으로 교체하십시오 (500 μL / 우리12 웰 세포 배양 플레이트 또는 6 웰 세포 배양 플레이트에 대해 1㎖ / 웰). 얼음 위에서 5 분간 방치한다. </li><li> FDA - PI 또는 FDA - PI - Hoechst 작업 솔루션을 대기음과 차가운 PBS (12 잘 세포 배양 플레이트 또는 잘 쥐 세포 배양 플레이트 50 μL / 잘 100 μL /)를 추가합니다. 참고 : 이미지를 촬영할 때 셀을 건조시키지 마십시오. </li><li> 형광 현미경을 사용하여 이미지를 촬영하십시오. 통과 대역이 450 - 490 nm 인 여기 필터를 사용하십시오. FDA, PI 및 Hoechst의 형광 방출을 각각 520, 620 및 460 nm에서 감지합니다. 동일한 조건에서 형광 현미경의 위상차 모드를 사용하여 정상 광선 아래에서 이미지를 찍습니다. 참고 : FDA-PI 또는 FDA-PI-Hoechst 염색 후 15 분 이내에 이미지를 촬영하십시오. 노출 시간은 100-300ms이고 아날로그 게인은 2.8x입니다. </li></ol> 7. 신경 생존력의 평가 <ol><li> FDA-PI 이중 염색의 경우, 여과 후 검출 된 세포의 이미지를 오버레이그래픽 편집기 소프트웨어에서 PI 양성 층에있는 FDA- 양성 층을 드래그하여 다른 형광 필터로. <ol><li> &quot;레이어&quot;패널의 &quot;불투명도&quot;필드에 &quot;50 %&quot;를 입력하여 FDA 양성 레이어의 불투명도를 조정합니다. &quot;Layer&quot;메뉴에서 &quot;Merge Visible&quot;버튼을 클릭하여 두 레이어를 병합합니다. &quot;이미지&quot;아래의 &quot;대비&quot;필드에 &quot;50&quot;을 입력하여 오버레이 이미지의 대비를 설정하십시오 | &quot;조정&quot;| &quot;밝기 / 대비&quot; 오버레이 이미지에 FDA 및 PI 이중 긍정 셀이 없는지 확인하십시오. </li></ol></li><li> FDA-PI-Hoechst 3 중 염색의 경우 그래픽 편집기 소프트웨어에서 PI 양성 층의 FDA 양성 층을 끌어 다른 형광 필터를 필터링 한 후 검출 된 세포의 이미지를 오버레이합니다. &quot;레이어 &amp; # 0&quot;레이어의 &quot;불투명도&quot;필드에 &quot;50 %&quot;를 입력하여 FDA- 포지티브 레이어의 불투명도를 조정합니다.34; 패널. <ol><li> &quot;Layer&quot;메뉴에서 &quot;Merge Visible&quot;버튼을 클릭하여 두 레이어를 병합합니다. 병합 된 레이어에서 Hoechst 양성 레이어를 드래그합니다. &quot;레이어&quot;패널의 &quot;불투명도&quot;필드에 &quot;50 %&quot;를 입력하여 Hoechst- 포지티브 레이어의 불투명도를 조정합니다. &quot;Layer&quot;메뉴에서 &quot;Merge Visible&quot;버튼을 클릭하여 두 레이어를 병합합니다. </li></ol></li><li> 형광 모드에서 촬영 한 이미지와 위상차 모드에서 촬영 한 이미지를 비교하여 대형의 불규칙한 glial 세포를 CGN과 구별합니다. CGN보다 3 배 큰 직경을 가진 세포는 glial 세포로 간주되므로 제외해야합니다. </li><li> 이미지 처리 프로그램 ( 예 : ImageJ)에서 세포 카운터 플러그인을 사용하여 실행 가능한 뉴런과 죽은 뉴런의 수를 각각 계산합니다. <ol><li> FDA-PI 이중 염색의 경우, 작은 FDA 양성 세포를 수동으로 표시한다.생존 가능한 뉴런. PI 양성 세포를 죽은 뉴런으로 수동으로 표시하십시오. FDA-PI-Hoechst triple staining의 경우, 작은 FDA- 및 Hoechst- 이중 양성 세포를 생존 가능한 뉴런으로 수동으로 표시하십시오. 수동으로 PI- 및 Hoechst- 이중 양성 세포를 죽은 뉴런으로 표시하십시오. </li></ol></li><li> 다음 방정식을 사용하여 연결 세포 생존율을 계산하십시오 : 연결 생존율 % = [생존 가능한 뉴런의 수 / (죽은 뉴런의 수 + 생존 가능한 뉴런의 수)] × 100 %. 각 우물에 대해 5 개의 무작위 필드를 선택하고 뉴런 생존율을 평균합니다. </li></ol>

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이 프로토콜은 앞에서 설명한 절차 6 , 7 에서 수정되었습니다. 연구원은 체외에서 일차 뉴런 을 배양 할 때 조건을 개선하여 비 신경 세포 성장을 줄이기 위해 시간을 보냈습니다. 그러나, 개선 된 배양 조건으로도, 일부의 신경아 교세포가 남아있다. 또한, 그들은 신경 세포의 성장과 성숙을 도와주기 때문에 비 연결 세포가 기본 신경 세포 배양에 필요합니다. 이 연구에서, Ara-C는 glial 세포의 성장을 최소화하는 데 사용되었지만, CGN 배양에서 여전히 glial 세포의 존재가 약 1 ~ 5 %는 있음에도 불구하고. 이 문제는 다른 그룹의 연구에서도 나타난다 10 . CGN 문화에서 glial 세포의 크기와 모양은 크게 뉴런과 다릅니다. CGN의 직경은 약 10 μm이며, 성숙한 CGN은 뉴런을 연결하는 풍부한 과정을 가지고 있습니다. 하우ve...

3- (4,5- 디메틸 -2- 티아 졸릴) -2,5- 디 페닐 -2-H- 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 분석과 같은 비색 세포 독성 분석은 일반적으로 시험 관내에서 세포 생존력을 측정하는 데 사용됩니다. 쥐의 일차 배양 된 소뇌 과립 뉴런 (CGNs)은 1- 메틸 -4- 페닐 피리 디늄 이온, 과산화수소 및 글루 탐 산염 1,2를 비롯한 다양한 신경 독소에 민감합니다. 따라서 CGN 배양 물은 신경 과학 분야 의 시험 관내 모델로 사용될 수 있습니다. CGN 배양 물은 CGN 배양에서 총 세포의 약 1 %를 차지할 수있는 뉴런 및 신경교 세포를 포함하는 다양한 세포를 함유 할 수있다. 그러나 신경 교세포는 뉴런에 비해 신경 독소에 다르게 반응하여 비색 분석 3 에 의해 측정 된 신경 세포 생존력에 편향을 일으 킵니다. 살아있는 세포에서 Fluorescein diacetate (FDA)는 에스 테라 제에 의해 플루 오레 신으로 전환 될 수 있습니다.Propidium Iodide (PI)는 죽은 세포를 통과 한 후 DNA와 상호 작용할 수 있으며 배양 물 내에서 세포 사멸을 나타내는 데 사용될 수 있습니다. 따라서 FDA-PI 이중 염색은 생존 가능한 세포와 ​​죽은 세포를 동시에 평가할 수있어 비색법을 결합하여 세포 생존력을보다 정확하게 측정 할 수 있음을 시사합니다. 또한 핵에 파란색 형광 염료 인 Hoechst를 추가하여 세포 생존력의 정확성을 더욱 향상시킬 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 FDA-PI 이중 염색법과 FDA-PI-Hoechst triple 염색법을 설명하며, 일차 배양 CGN에서의 신경 생존력을 정확하게 분석하는데 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 크기와 모양으로 CGN과 glial 세포를 시각화하고 구별하는 것을 이용합니다. 염색 후, 생존 가능한 뉴런과 죽은 뉴런의 수는 형광 현미경으로 촬영 한 대표 이미지로부터 계산됩니다. 대형 glial 세포는 전형적인 CGNs의 비교에 의해 제외됩니다형광등 모드에서 위상차 모드로 촬영 한 것입니다. 유사한 전략은 일차 피질 문화와 해마 문화와 같은 뉴런과 glial 세포를 포함하는 혼합 세포 배양에서의 연결 생존 능력을 측정하기 위해 수행 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>폴리-L-라이신(PLL)</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>사이토신 &베타;-D-아라비노푸라노사이드</td><td>Sigma</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td>고품질 FBS는 배양에 필수적입니다</td></tr>. <tr><td>100x 글루타민</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>100x 항생제:</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle (BME)</td><td>Gibco</td><td>21010046</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein diacetate (FDA)</td><td>Sigma</td><td>F7378</td><td></td></tr>, <tr><td>Propidium Iodide (PI)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr>, <tr><td>Hoechst 33342</td>, <td>Yesen</td><td>40731ES10</td><td></td></tr>, <tr><td>rabbit Anti-GAP43 항체</td><td>Abcam</td><td>ab75810</td><td></td></tr><tr><td>마우스 Anti-GFAP 항체</td><td>Cellsignaling</td><td>3670</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A602440</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4665</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipette</td><td>Volac</td><td>Z310727</td><td>전에 팁 라운드를 태울 수 있습니다. </td></tr><tr><td>12웰 세포 배양 플레이트</td> 사용 <td>TPP</td><td>Z707783</td><td></td></tr><tr><td>6웰 세포 배양 플레이트</td><td>TPP</td><td>Z707759</td><td>고품질 세포 배양 플레이트는 배양에 필수적입니다</td></tr><tr><td>필터</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Pipet 5 mL</td><td>Excell Bio</td><td>CS017-0003</td><td></td></tr><tr><td>Pipet 10 mL</td><td>Excell Bio</td><td>CS017-0004</td><td></td></tr><tr><td>Dissect 현미경</td><td>Shanghai Caikang</td><td>XTL2400</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>311</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>TI-S</td><td></td></tr><tr><td>형광 필터 및 방출 큐브</td><td>Nikon</td><td>B-2A, G-2A, UV-2A</td><td></td></tr><tr><td>사진 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements</td><td></td></tr><tr><td>그래픽 편집기 소프트웨어</td><td>Adobe</td><td>Photoshop CS</td><td></td></tr><tr><td>이미지 처리 소프트웨어</td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr></tbody></table>

소뇌 과립 신경 세포 배양에서 fluorescein diacetate-propidium iodide 이중 염색을 이용한 신경 생존력의 평가

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

일차 배양 된 소뇌 과립 뉴런 (CGNs)은 신경 과학 및 신경 약리학 연구 에서 시험 관내 모델로서 널리 사용되어왔다. 그러나, CGN 배양에서 신경 교세포와 뉴런의 공존은 신경 세포 생존 능력의 정확한 평가에서 편차를 유발할 수있다. Fluorescein diacetate (FDA) 및 Propidium Iodide (PI) 이중 염색법은 생존 및 사멸 세포를 동시에 평가함으로써 세포 생존력을 측정하는 데 사용되었습니다. 우리는 비색 분석법의 민감도를 향상시키고 CGNs의 신경 생존 능력을 평가하기 위해 FDA-PI 이중 염색법을 사용했습니다. 또한 정확도를 높이기 위해 청색 형광 DNA 얼룩 ( 예 : Hoechst)을 추가했습니다. 이 프로토콜은 CGN 문화에서 이러한 방법을 사용하여 연결 가능성의 평가의 정확성을 향상시키는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 형광 현미경을 사용하여 glial 세포의 수를 제외 할 수 있습니다. 비슷한 전략을 적용하여 원치 않는 gli를 구별 할 수 있습니다.대뇌 피질의 배양 및 해마 배양과 같은 다양한 혼합 세포 배양에서 뉴런의 알 세포.

GAP43 (적색)과 GFAP (녹색)의 이중 immunostaining는 각각 신경 세포와 glial 세포의 모양을 분석하는 데 사용되었다 2 , 5 . 두 뉴런과 glial 세포는 CGN 문화에 존재합니다. GFAP 양성 glial 세포는 이미지의 화살표로 표시된대로 크고 불규칙한 모양입니다 ( 그림 1 ). 세포 활력에 대한 전통적인 분석은 신경 생존력을 측정하는 데 사용되는 경우 신경 세포와 신경 세포를 구별 할 수 없습니다. 따라서, 신경 세포와 구강 세포를 구별 할 수있는 FDA-PI 및 FDA-PI-Hoechst 염색은 CGN 배양에서의 신경 생존 능력의 정확한 평가에 유리하다. 낮은 칼륨 도전은 CGN 문화에서의...

이 프로토콜은 신경 과학 및 신경 약리학 연구 에서 체외 모델로 사용되는 배양 소뇌 과립 뉴런 (neuronal culture)의 Fluorescein diacetate (FDA) 및 Propidium Iodide (PI) 이중 염색을 사용하여 신경 생존력을 정확하게 측정하는 방법을 설명합니다.

소뇌 과립 신경 세포 배양에서 Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide 이중 염색을 이용한 신경 생존력의 평가

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

본 절차의 전반적인 목표는 소뇌 과립 뉴런 배양에서 세포 생존율을 정확하게 측정하는 것입니다. 이 방법은 신경과학 및 신경약리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 MISTA 세포 배양에서 원치 않는 글리아 세포와 뉴런을 구별할 수 있다는 점입니다.시연은 저희 연구실의 학부생인 Lin Jiajia, Wang Jialing, Xu Dilin 세 명이 진행하겠습니다. 우선 가위로 대후두공(foramen magnum)을 통해 삽입하여 귀에서 눈 방향으로 두개골의 양측을 절개함으로써 8일 된 쥐 새끼의 머리 해부를 시작합니다. 그 다음, 포셉을 사용하여 두개골을 들어 올립니다.포셉을 사용하여 소뇌를 분리하고, 해부 용액이 담긴 35mm 디쉬에 넣습니다. 플레이트를 해부 현미경의 스테이지로 옮기고, 두 쌍의 포셉을 사용하여 뇌막과 혈관을 제거합니다. 블레이드로 조직을 잘게 자른 다음, 30 mL의 해부 용액이 들어 있는 원심 분리 튜브로 조직을 옮깁니다.실온에서 1, 500 x g로 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 흡입하여 제거하고 펠렛을 회수합니다. 다음으로, 펠렛에 Trypsin 용액을 첨가하고 가볍게 흔들어 재현탁합니다.그런 다음 튜브를 37 °C 항온수조에 15분 동안 둡니다. 15분 후, DNase One, 대두 트립신 억제제(soybean Trypsin inhibitor) 및 황산마그네슘 용액을 첨가하고 흔들어 섞어줍니다. 이후 상온에서 1,500 x g로 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 흡입하여 제거한 후, 펠릿을 더 진한 농도의 DNase One, 대두 트립신 억제제(soybean Trypsin inhibitor) 및 황산 마그네슘 용액으로 재현탁합니다. 다음으로, 15mL 튜브 두 개를 준비합니다. 각 튜브에 세포를 절반씩 나누어 넣고, 솜으로 막은 파스퇴르 피펫을 사용하여 60~70회 정도 피펫팅하여 세포를 균질화합니다.균질화 후, 각 15-milliliter 튜브에 3 milliliters의 황산 마그네슘 및 염화 칼슘 용액을 추가합니다. 튜브를 실온에서 10분 동안 그대로 둡니다. 시간이 경과하면, 솜 마개를 꽂은 파스퇴르 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하여 새로운 15-milliliter 튜브로 옮깁니다.실온에서 1,500 x g로 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿에 배양액을 추가하여 세포 밀도가 약 1.5 x 10⁶ cells/mL가 되도록 희석합니다. 세포를 6-웰 플레이트에 분주하고, 37 °C 및 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 배양합니다.24시간 후, 플레이트를 인큐베이터로 되돌리기 전에 glial cell의 성장을 억제하기 위해 AraC 스톡 용액을 최종 농도 1 mM이 되도록 첨가합니다. 그 다음, 7일째에 D-glucose 스톡 용액 50 µL를 최종 농도 1 mM이 되도록 첨가합니다. fluorescein diacetate를 최종 농도 10 µg/mL로, propidium iodide를 최종 농도 50 µg/mL로, 그리고 PBS 10 mL를 혼합하여 염색을 시작합니다.FDA/PI 용액을 볼텍싱하여 섞은 후 얼음에 둡니다. 배양 플레이트를 얼음에 올립니다. 피펫 팁이 세포에 닿지 않도록 주의하며 배양액을 흡입하여 제거한 다음, 차가운 PBS를 천천히 첨가합니다.PBS를 흡입하여 제거한 다음, 차가운 FDA/PI 또는 FDA/PI Hoechst 작동 용액을 첨가합니다. 플레이트를 얼음에 5분 동안 둡니다. 그 다음, FDA/PI 또는 FDA/PI/Hoechst 작동 용액을 흡입하여 제거하고, 각 웰에 차가운 PBS를 첨가합니다.형광 현미경이 올바르게 설정되었는지 확인하십시오. 노출 시간을 100에서 300 milliseconds 사이로 설정하고 아날로그 게인을 2.8 x로 하여 FDA, PI, Hoechst의 형광 방출을 각각 520, 620, 460 nanometers에서 검출하십시오. 형광 이미지를 수집한 후, 위상차 모드를 사용하여 일반광 하에서 이미지를 촬영하십시오.FDA/PI 이중 염색의 경우, 그래픽 편집 소프트웨어에서 FDA 양성 층을 PI 양성 층 위로 드래그하여 세포 이미지를 겹칩니다. 레이어 패널의 불투명도(Opacity) 필드에 50%를 입력하여 FDA 양성 층의 불투명도를 조절합니다. 레이어 메뉴를 열고 가시적 레이어 병합(Merge Visible) 버튼을 클릭하여 두 레이어를 병합합니다.Image, Adjustments, Brightness/Contrast 항목의 Contrast 필드에 50을 입력하여 오버레이 이미지의 대비를 설정합니다. 오버레이 이미지에 FDA와 PI가 모두 양성인 이중 양성 세포가 없는지 확인합니다. FDA/PI/Hoechst 삼중 염색의 경우, 다시 FDA 양성 레이어를 PI 양성 레이어 위로 드래그하여 세포 이미지를 오버레이하고, 이전과 동일하게 FDA 양성 레이어의 불투명도를 조절한 후 이미지를 병합합니다.그런 다음 Hoechst 양성 레이어를 병합 레이어로 드래그합니다. 레이어 패널의 불투명도 필드에 50%를 입력하여 Hoechst 양성 레이어의 불투명도를 조절하고, 레이어 메뉴를 열어 '가시 레이어 병합(Merge Visible)' 버튼을 클릭하여 두 레이어를 병합합니다. 형광 모드에서 촬영한 이미지와 위상차 모드에서 촬영한 이미지를 비교하여, 크고 불규칙한 모양의 글리아 세포와 소뇌 과립 뉴런을 시각적으로 구별합니다.다음 이미지들은 소뇌 과립세포(CGN) 배양물에 작은 뉴런과 크고 불규칙한 모양의 글리아 세포가 모두 존재함을 보여줍니다. 이 이미지는 배양 8일 차 CGN 배양물의 GAP-43 아미노 염색 결과입니다. 파란색 화살표는 뉴런을 나타냅니다.여기 glial cell의 GFAP 아미노 염색 결과가 제시되어 있습니다. 흰색 화살표는 glial cell을 나타냅니다. 이 위상차 이미지에서는 세포의 형태를 보여줍니다.글리아 세포(glial cells)와 뉴런을 구분할 수 있는 FDA/PI 후크 염색(hook staining)은 CGN 배양에서 뉴런의 생존율을 정확하게 평가하는 데 유용합니다. 이것은 일반 성장 배지에서 배양된 삼중 염색 세포의 병합 이미지입니다. 화살표는 전형적인 글리아 세포를 나타냅니다.여기서는 유사한 배양물에 저칼륨 배지를 처리하였으며, 화살표는 다시 한번 전형적인 글리아 세포를 가리킵니다. 또한, 적색 프로피듐 요오드 염색 양상에 유의하십시오. 숙달되면 이 기술은 적절히 수행했을 때 2시간 이내에 완료할 수 있습니다.유사한 전략을 일차 피질 배양 및 일차 해마 배양과 같은 다른 혼합 세포 배양에 적용하여 신경세포 생존력을 정확하게 분석할 수 있습니다.

assessment-neuronal-viability-using-fluorescein-diacetate-propidium

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 방법은 organotypic 소뇌 문화의 생성 및 다른 소뇌 세포 유형의 생존 능력에 특정 apoptotic 자극의 효과를 설명합니다.

Organotypic 소뇌 문화 : Apoptotic 도전과 감지

중앙 신경 터미널에있는 보충 및 특정 시냅스 소포의 동원 (SV) 풀을 수치 라이브 형광 이미징 기술이 설명되어 있습니다. SV 재활용의 두 발만 내부 통제를 제공하는 동일한 신경 터미널에서 모니터링하고 있습니다.

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

이 비디오는 rhinal cortex-hippocampus organotypic slices에서 신경 세포 사멸을 평가하는 기술을 보여줍니다. 신경 세포 사멸은 생체 내 간질과 유사한 진화하는 간질 발작을 통해 발생하며, 프로피듐 요오드화물과 면역 형광을 사용하여 죽은 세포의 이중 염색을 통해 감지됩니다.

생체 외 간질 모델에서 세포 사멸을 평가하기 위한 신경 세포 사멸 분석

이 비디오는 마우스의 일차 소뇌 과립 뉴런에서 뉴런 손상 모델의 생성을 보여줍니다. 흥분성 신경전달물질 수용체 작용제인 NMDA와 공동 작용제인 글리신을 사용하여 신경 손상을 유도하는 데 필요한 단계를 설명합니다. NMDA와 글리신은 특정 신경 수용체에 결합하여 과도한 자극을 유발하고 세포 내 칼슘을 대량으로 유입시켜 신경 세포 손상과 사멸을 초래합니다.

Modeling Neuronal Injury in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons(마우스 1차 소뇌 과립 뉴런의 뉴런 손상 모델링)

이 비디오는 플루오레세인 디아세테이트(FDA)와 프로피듐 요오드화물(PI)을 사용한 이중 염색을 사용하여 소뇌 과립 뉴런과 신경교세포의 혼합 배양에서 뉴런을 식별하는 방법을 보여줍니다.

이중 염색을 통한 소뇌 뉴런 배양에서 신경 세포 생존력 평가

출처: Bénard, M., et al. 컨포칼 매크로를 사용한 출생 후 소뇌 과립 세포 이동의 생체 외 이미징. J. Vis. 특급 (2015년)이 비디오는 출생 후 쥐의 뇌에서 소뇌 절편에 있는 과립 세포의 생체 외 이동을 추적하는 컨포칼 매크로스코픽 방법을 보여줍니다.

공초점 광조법을 사용한 출생 후 소뇌 과립 세포 이동의 생체 외 이미징

출생 후 소뇌 발달 동안, 생식대에서 유래한 미성숙 과립 세포는 최종 목적지에 도달하고 신경 네트워크를 구축하기 위해 뚜렷한 이동 방식을 보입니다. 이 프로토콜은 소뇌 절편의 준비와 신경 세포 이동을 조절하는 요인을 조사하는 데 사용되는 공초점 거시적 접근 방식을 설명합니다.

공 초점 Macroscopy을 사용하여 출생 후의 소뇌 과립 세포 이동의 생체 이미징

Microglia는 다양한 비세포 자율 메커니즘에 의해 배양의 뉴런 및 기타 신경교세포에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에서는 1차 신경 세포 배양에서 미세아교세포를 선택적으로 고갈시키는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 신경염증이 특징적인 신경퇴행성 질환에 영향을 미치면서 미세아교세포-뉴런 상호작용의 역할을 규명할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

소뇌 과립 세포 배양에서 미세 아교 세포의 선택적 고갈 L - 류신 메틸 에스테르를 사용하여

이 프로토콜 분리 하 고 기본 마우스 뇌과 립 신경 (CGNs) 6-7 주 오래 된 강아지, 손실에 대 한 CGNs의 효율적인 변환 및 기능 연구의 이득에서에서 경작 하 고 NMDA 유발 신경 excitotoxicity, 모델링에 대 한 간단한 방법을 설명 합니다. 낮은 칼륨-유도 된 세포 죽음, DNA 손상 및 산화 스트레스 같은 문화 모델을 사용 하...

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

배우세요 소뇌 과립 신경 세포 배양에서 Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide 이중 염색을 이용한 신경 생존력 평가 방법입니다. 이 기술은 신경과학 및 신경약리학 연구에서 신경세포와 신경교세포를 구분하여 정확한 세포 생존율을 측정합니다.

소뇌 과립 신경 세포 배양에서 Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide 이중 염색을 이용한 신경 생존력의 평가

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