반자동 경도 Microcomputed Tomography 기반 정량적 구조 분석 누드 쥐 척추 골절 골다공증 관련 모델의

본 수술 모델 및 이미지 분석 방법의 전반적인 목표는 전임상 골다공증 관련 척추 압박 골절 모델에서 처치법의 영향을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 골다공증 관련 척추 압박 골절에 효과적인 치료법은 무엇인지, 그리고 그러한 치료가 골 재생에 어떻게 도움을 줄 수 있는지와 같은 글리아 재생 의학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점는 누드 랫(nude rats)을 사용하므로 면역 거부 반응에 대한 우려 없이 새로운 치료법을 체내(in vivo)에서 테스트할 수 있다는 점입니다.

또한, 여기서 제시하는 골 재생 방법은 반자동화되어 있어 이전에 발표된 방법보다 더 정확하며 사용자 의존성이 낮습니다. 이 절차는 저희 연구실의 연구원인 Wafa Tawackoli 박사가 시연하겠습니다. 먼저 100% oxygen 내 5% isoflurane을 사용하여 골다공증 쥐에게 마취를 유도한 다음, 유지를 위해 2~3% isoflurane의 노즈콘으로 옮깁니다.

전기 면도기를 사용하여 복부 부위를 면도합니다. 0.5% chlorhexidine gluconate가 포함된 요오드계 소독제로 닦아낸 후 70% ethanol로 소독합니다. 마취 중 안구 건조를 방지하기 위해 눈에 동물용 안연고를 도포합니다.

적절한 마취 수준이 유지되고 있는지 확인하기 위해 발가락 꼬집기 자극을 줍니다. 반응이 없으면 절차를 시작하십시오. 마취된 쥐를 37 °C로 설정된 가열 패드 위에 배측 와위로 놓고, 자기 고정 견인 시스템을 사용하여 사지를 펴줍니다.

수술 절차를 시작하기 전, 쥐의 피하에 carprofen을 주사합니다. 검상돌기 1cm 아래에서 시작하여 정중선을 따라 피부를 5~8cm 절개한 후, 수술용 가위를 사용하여 linea alba를 통해 건막을 절개하여 복강에 접근합니다. 리트랙터를 사용하여 복강을 노출시킵니다.

쥐의 장을 오른쪽으로 밀어 복부 대동맥과 왼쪽 신장을 노출시킵니다. 탈수를 방지하기 위해 멸균된 젖은 거즈로 내부 장기를 감쌉니다. 대동맥을 노출시키기 위해 필요한 경우 추가 리트랙터를 사용하십시오.

요추를 촉진한 다음 노출시킵니다. 전기소작기를 사용하여 요추 4번에서 5번 척추체의 전면을 노출시키고 주변 결합 조직 및 근육으로부터 분리합니다. 면봉을 사용하여 4번 요추에서 혈액과 잔류 조직을 제거합니다.

다음으로 멸균된 2 cm 직경의 드릴 비트를 사용하여 노출된 척추체 전면 중앙에 5 mm 깊이의 골 결손 부위를 뚫습니다. 복측 피질과 그 아래의 해면골만 뚫을 수 있도록 최소한의 압력을 가합니다. 배측 피질까지 뚫지 않도록 주의하십시오.

그런 다음 동일한 방식으로 L5 척추뼈를 천공하여 쥐 한 마리당 두 개의 결손 부위를 만듭니다. 천공이 완료되면 장을 복강으로 다시 넣고 견인기를 제거합니다. 다음으로 vicryl 합성 흡수성 외과용 봉합사를 사용하여 근막을 연속 봉합법으로 봉합합니다.

4-0 단사 나일론 비흡수성 봉합사를 사용하여 단순 단속 봉합법으로 피부를 봉합합니다. 그런 다음 피부 봉합사 위와 사이에 국소 피부 접착제 100 µL를 도포하여 피부가 완전히 폐쇄되었는지 확인합니다. 저체온증과 탈수를 방지하기 위해 37 °C의 젖산 링거액을, 수술 후 통증 완화를 위해 부프레노르핀을 쥐에게 주입한 후, 가열 패드 위에서 동물이 마취로부터 회복되도록 합니다.

수술 다음 날, 이전과 동일하게 isoflurane으로 마취를 유도합니다. in vivo micro-CT 스캐너를 사용하여 쥐를 스캔합니다. 스캔 및 마취 회복 후, 쥐를 홈 케이지로 돌려보냅니다.

분석을 위해 척추뼈 데이터를 분리하려면 micro-CT 평가 프로그램을 클릭하고 메뉴에서 샘플을 선택하십시오. 그런 다음 마우스를 사용하여 슬라이스 상의 개별 척추뼈의 윤곽을 그리십시오. Z바를 사용하여 다음 슬라이스로 이동하고 동일한 방식으로 개별 척추뼈의 윤곽을 그리십시오.

파일, save GOBJ를 클릭하여 몇 개의 슬라이스마다 윤곽이 그려진 척추뼈를 별도의 파일로 저장하십시오. 그 다음 기준 척추뼈를 설정한 후, 이를 micro-CT 환경으로 가져오십시오. micro-CT 평가 프로그램, 파일, load GOBJ를 클릭하고 이전에 생성한 GOBJ를 선택하여 기준 척추뼈에 정의된 VOI를 등록된 대상 척추뼈에 적용하십시오.

마지막으로 micro-CT 평가 프로그램을 사용하여 평가를 위해 VOI를 전송합니다. 이 정면 3D 이미지는 결손 생성 하루 후의 대표적인 척추 결손 이미지를 보여줍니다. 공극 내의 골 형성은 빨간색으로 표시되어 있습니다.

이것은 동일 부위의 시상면 2D 이미지이며, 마지막으로 축상면 2D 이미지입니다. 여기서 보는 바와 같이 골 형성은 시간이 경과함에 따라 일어나며, 종단적 영상 촬영을 통해 검출됩니다. 골 부피 밀도와 겉보기 밀도를 계산하였으며, 다중 비교를 위한 Bonferroni 교정을 적용한 반복 측정 이원 분산 분석(repeated measures two-way ANOVA)을 사용하여 비교 분석하였습니다.

여기서 볼 수 있듯이, 척추 결손 생성 2주 후부터 골 부피 밀도와 겉보기 밀도가 유의하게 증가합니다. 이 절차 이후에는 어떤 세포가 존재하는지, 결손 부위에서 어떤 단백질이 발현되는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 조직학 및 면역조직화학 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 누드 랫(nude rats)에서 다중 척추 결손을 생성하는 방법과 이러한 결손 부위에서 시간에 따른 골 재생을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.