반자동 경도 Microcomputed Tomography 기반 정량적 구조 분석 누드 쥐 척추 골절 골다공증 관련 모델의
2017년 9월 28일
이 프로토콜의 목표 경도 평가 vivo에 는 반자동된 microcomputed 단층 기반 정량적 구조 분석을 사용 하 여 될 수 있는 누드 쥐 척추 압축 골다공증 관련 골절 모델을 생성 하는 것입니다.
이 수술 모델 및 이미지 분석 방법의 전반적인 목표는 전임상 골다공증 관련 척추 압박 골절 모델에 대한 치료의 영향을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 골다공증 관련 척추 압박 골절에 대한 효과적인 치료법은 무엇인지, 그러한 치료법이 뼈 재생에 어떻게 도움이 될 수 있는지와 같은 신경교 재생 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 누드 쥐를 포함하므로 면역 거부 반응에 대한 걱정 없이 생체 내에서 새로운 치료법을 테스트할 수 있다는 것입니다.
또한, 뼈 재생의 기초가 되는 이 방법은 여기에 제시된 이 방법은 반자동화되어 있으므로 이전에 발표된 것보다 더 정확하고 사용자 의존도가 적습니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 연구 과학자인 Wafa Tawackoli 박사가 맡을 것입니다. 먼저 100% 산소에 5%이소플루란을 사용하여 골다공증성 쥐에서 마취를 유도한 다음 유지 관리를 위해 2-3%의 이소플루란을 콧방울로 옮깁니다.
전기 면도기를 사용하여 복부 부위를 면도합니다. 0.5% 클로르헥시딘 글루코네이트에 요오드 기반 소독제로 면봉을 주입한 후 70% 에탄올을 주입합니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 수의사 연고를 눈에 사용하십시오.
적절한 마취 평면을 보장하기 위해 발가락 꼬집음 자극을 가합니다. 응답이 기록되지 않으면 절차를 시작합니다. 마취된 쥐를 섭씨 37도로 설정된 발열 패드에 등쪽 누운 상태로 놓고 자기 고정 장치 수축 시스템을 사용하여 팔다리를 스트레칭합니다.
수술 절차를 시작하기 전에 쥐에게 카프로펜을 피하 주사합니다. xiphoid 돌기에서 1cm 아래에서 시작하여 정중선을 통해 피부를 5-8cm 절개 한 후 수술 용 가위를 사용하여 linea alba를 통해 aponeurosis를 절개하여 복강에 접근합니다. 견인기를 사용하여 복강을 노출시킵니다.
장을 쥐의 오른쪽으로 편향시켜 복부 대동맥과 왼쪽 신장을 노출시킵니다. 탈수를 방지하려면 멸균된 거즈를 사용하여 내부 장기를 감쌉니다. 대동맥을 노출시키기 위해 필요에 따라 추가 견인기를 사용하십시오.
요추를 촉진한 다음 노출을 진행하십시오. 열소작술을 사용하여 요추체 L 4-5의 앞쪽을 노출시키고 주변의 결합 조직 및 근육으로부터 분리한다. 면봉을 사용하여 L 4개의 척추뼈에서 혈액과 잔류 조직을 제거합니다.
그런 다음 멸균 직경 2cm 드릴 비트를 사용하여 척추체의 노출된 전방 측면 중앙에 5mm 깊이의 뼈 결함을 뚫습니다. 복부 피질과 그 아래에 있는 섬유주뼈만 뚫기 위해 최소한의 압력을 가합니다. 등쪽 피질을 뚫지 마십시오.
그런 다음 같은 방식으로 L 5개의 척추뼈를 뚫어 쥐당 2개의 결함을 만듭니다. 드릴링이 완료되면 장을 복강으로 되돌리고 견인기를 제거합니다. 다음으로, 바이크릴 합성 흡수성 수술용 봉합사를 연속적인 패턴으로 사용하여 건막증을 봉합합니다.
4-0 모노필라멘트 나일론 비흡수성 봉합사를 사용하여 간단한 중단 패턴으로 피부를 닫습니다. 그런 다음 피부 봉합사 위와 사이에 100마이크로리터의 국소 피부 접착제를 바르면 피부가 완전히 봉합됩니다. 저체온증과 탈수를 방지하기 위해 섭씨 37도의 젖산 링거 용액을 쥐에게 주입하고 수술 후 통증 완화를 위해 부프레노르핀을 주입한 후 동물이 가열 패드에서 마취에서 회복할 수 있도록 합니다.
수술 다음 날에는 이전과 같이 이소플루란으로 마취를 유도합니다. in vivo micro-CT 스캐너를 사용하여 쥐를 스캔합니다. 스캔하고 마취에서 회복한 후 쥐를 가정용 케이지로 되돌립니다.
분석을 위해 척추 데이터를 분리하려면 마이크로 CT 평가 프로그램을 클릭하고 메뉴에서 샘플을 선택하십시오. 그런 다음 마우스를 사용하여 슬라이스의 개별 척추뼈를 윤곽을 그립니다. Z 막대를 사용하여 다음 슬라이스로 이동하고 동일한 방식으로 개별 척추뼈의 윤곽을 그립니다.
파일을 클릭하여 윤곽이 있는 척추뼈를 별도의 파일로 저장하고 두 개의 슬라이스마다 GOBJ를 저장합니다. 그런 다음 기준 척추를 설정한 후 micro-CT 환경으로 가져옵니다. micro-CT 평가 프로그램, 파일, GOBJ 로드를 클릭하고 이전에 생성된 GOBJ를 선택하여 기준 척추에 대해 정의된 VOI를 등록된 대상 척추에 적용합니다.
마지막으로 마이크로 CT 평가 프로그램을 사용하여 평가를 위해 VOI를 보냅니다. 이 정면 3D 이미지는 결함 발생 하루 후의 대표적인 척추 결함 이미지를 보여줍니다. 공허의 뼈 형성은 빨간색으로 표시됩니다.
이것은 동일한 영역의 시상 2D 이미지이며 마지막으로 축 방향 2D 이미지입니다. 여기에서 볼 수 있듯이 뼈 형성은 시간이 지남에 따라 발생하며 종방향 이미징으로 감지됩니다. 골 부피 밀도와 겉보기 밀도는 다중 비교를 위해 Bonferroni 보정과 함께 반복 측정 양방향 ANOVA를 사용하여 계산하고 비교했습니다.
여기에서 볼 수 있듯이, 뼈 부피 밀도와 겉보기 밀도는 척추 결손이 발생한 후 2주 후부터 크게 증가합니다. 이 절차에 따라 조직학 및 면역조직화학과 같은 다른 방법을 수행하여 어떤 세포가 존재하는지, 결손에서 어떤 단백질이 발현되는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 누드 쥐에서 여러 척추 결함을 만들고 이러한 결함에서 시간 경과에 따른 뼈 재생을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 프로토콜은 골다공증 관련 척추 압박 골절의 누드 쥐 모델을 만드는 방법을 설명하고, 반자동화된 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용한 생체 내 평가를 허용합니다. 이 접근법은 골다공증 조건에서 뼈 재생에 대한 잠재적인 치료법의 연구를 촉진합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경 과학
- 뼈 재생
- 골다공증 연구
배경
- 골다공증은 특히 척추에서 골절 위험을 증가시킵니다.
- 누드 쥐는 치료 연구에서 면역 거부 반응을 피하기 위해 사용됩니다.
- 마이크로 컴퓨터 단층 촬영은 뼈의 상세한 구조 분석을 제공합니다.
- 뼈 재생 메커니즘을 이해하는 것은 효과적인 치료법을 개발하는 데 중요합니다.
연구 목적
- 골다공증 관련 골절을 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 모델을 확립합니다.
- 새로운 치료법이 뼈 재생에 미치는 효과를 평가합니다.
- 반자동화된 방법을 통해 구조 분석의 정확성을 향상시킵니다.
사용된 방법
- 산소 내 이소플루란을 사용한 마취 유도.
- 누드 쥐에서 척추 압박 골절 생성.
- 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용한 골 치유의 종단 평가.
- 치료 효과가 뼈 재생에 미치는 영향 평가.
주요 결과
- 모델에서 척추 압박 골절의 성공적인 유도.
- 구조 평가를 위한 반자동화 분석의 타당성을 입증했습니다.
- 잠재적인 치료법이 뼈 재생을 향상시키는 데 유망함을 보였습니다.
- 연구 결과는 골다공증 치료 효과의 이해에 기여합니다.
결론
- 누드 쥐 모델은 골다공증 관련 골절을 연구하는 데 효과적입니다.
- 반자동화된 마이크로 컴퓨터 단층 촬영은 분석 정확도를 향상시킵니다.
- 이 연구는 골다공증에 대한 새로운 치료법의 개발을 지원합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Longitudinal semiautomated microcomputed tomography (μCT) enables precise, reproducible quantification of bone regeneration in preclinical osteoporosis-related vertebral fracture models. This approach supports predictive confidence in evaluating novel bone regenerative therapies and de-risks translational advancement by standardizing structural outcome measures. The method is positioned to inform early discovery, target validation, and preclinical decision-making for osteoporosis and bone tissue engineering portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of bone regeneration hypotheses in a controlled, immunodeficient in vivo system.
- Supports functional target validation by quantifying new bone formation over time in response to candidate interventions.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating treatment effects from immune confounders.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, semiautomated workflow for generating and analyzing vertebral defects across cohorts.
- Delivers reproducible, quantitative μCT outputs suitable for comparative screening of regenerative compounds or biomaterials.
- Enables high-content, longitudinal assessment of bone volume and density changes, supporting robust assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant endpoints for osteoporosis and vertebral fracture repair.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by using clinically relevant imaging and analysis metrics.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates with demonstrated in vivo efficacy in a reproducible model.
Pipeline & Workflow Integration
This semiautomated μCT-based analysis integrates from early discovery through preclinical evaluation, enabling seamless transition of candidates from hypothesis testing to lead identification and translational validation.
- Discovery Biology: Quantitative imaging supports hypothesis-driven assessment of bone regeneration mechanisms.
- Screening: Standardized defect creation and imaging facilitate reproducible, scalable compound evaluation.
- Analytics: Automated registration and volume-of-interest analysis yield robust, comparable structural metrics.
- Translational Research: Longitudinal imaging aligns with clinical endpoints and supports biomarker development.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable to other longitudinal imaging-based bone and tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in bone regeneration studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput of in vivo imaging analyses.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of regenerative medicine candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in small animal surgery, μCT imaging, and quantitative image analysis.
- Demands access to in vivo μCT scanners and compatible analysis software for automated registration and VOI definition.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptable to other bone or tissue defect models where longitudinal imaging is beneficial.
- Dependent on animal model suitability and imaging infrastructure availability.
