형태학 및 Murine 악의 관절 돌기 세포 분석 방법

본 실험의 전반적인 목적은 방사선 사진의 형태측정학적 측정과 조직학적 분석을 통해 마우스 하악 과두 연골에서 압축 하중의 영향을 관찰하는 것입니다. 이러한 지표들은 설치류 하악 과두 내의 구조적 및 세포적 변화에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기서 제시된 기술의 주요 장점은 다른 소형 골격 또는 관절 동물을 분석하는 데에도 사용될 수 있다는 점입니다.

본 프로토콜을 위해, 분리 및 해부된 마우스 하악골을 준비하십시오. 페트리 접시에 담긴 하악골을 X선 촬영 캐비닛 시스템으로 옮깁니다. 그 후, 26 kilovolts에서 5초 동안 방사선 사진을 촬영합니다.

이제 분석 소프트웨어에서 이미지를 열어 형태측정학적 측정을 수행합니다. 먼저, 단위 버튼을 사용하여 스케일 바를 설정하십시오. 다음으로, 마커 스타일 2를 사용하여 6개의 해부학적 지점을 선택하십시오.

먼저, 하악과(mandibular condyle)의 가장 후방 지점을 1번 지점으로 선택합니다. 다음으로, 절흔 돌기(incisored process)를 2번 지점으로 선택합니다. 그런 다음, 시그모이드 절흔(sigmoid notch)의 가장 깊은 지점을 3번 지점으로 선택합니다.

다음으로, 하악지 오목부의 가장 깊은 지점인 4번 지점을 선택한 후, 과두 관절면의 가장 앞쪽 지점인 5번 지점을 선택하십시오. 이제 과두 관절면의 가장 뒤쪽 지점을 6번 지점으로 선택하고, 길이 측정 도구를 사용하여 길이 측정을 진행하십시오. 그다음, 3번 지점에서 4번 지점까지 수직선 도구를 사용하여 과두두 길이를 측정하는데, 이는 1번 지점에서 3번과 4번 지점 사이의 선까지의 수직 거리입니다.

그런 다음, 1번 지점과 2번 지점 사이의 하악 길이를 측정합니다. 마지막으로, 5번 지점과 6번 지점 사이의 과두 머리 너비를 측정합니다. 데이터를 저장하려면 화면 오른쪽에 있는 측정 목록을 복사하십시오.

고정되었으나 탈회되지 않은 하악골을 임베딩하기 전에, PBS 내의 30% sucrose 용액에 하룻밤 동안 담가둡니다. 다음 날, 과도한 연조직을 제거하고 하악과두를 조심스럽게 절단합니다. 이제 샘플을 플라스틱 몰드에 넣는데, 이때 과두의 내측면이 몰드 바닥에 닿게 하고 샘플이 몰드 바닥과 평행하도록 배치합니다.

그런 다음, 시료를 매립 수지에 담그고 드라이아이스 조각으로 수지를 냉각합니다. 다음으로, 몰드의 윗부분을 매립 수지로 더 채웁니다. 이를 냉동고나 드라이아이스로 냉각시킨 차가운 2-methyl butane으로 옮깁니다.

냉각된 시료는 절편 제작을 위해 -20 °C 또는 -80 °C에서 보관하십시오. 하악과 시상면 절편의 MCC에서 Col10a1 발현량을 정량화하려면, 이미지 분석 소프트웨어 패키지에서 조직학적 이미지를 열고 올가미 도구를 사용하여 관심 영역을 선택합니다. 여기서는 MCC 영역을 선택합니다.

히스토그램 상자에 표시된 해당 영역의 픽셀 수를 확인하십시오. 다음으로, 색상 범위를 조정하여 Col10a1 적색 픽셀을 선택합니다. 스포이드 도구를 사용하여 이미지에서 적색 픽셀을 선택하고 확인(OK)을 클릭하십시오. 그런 다음, 히스토그램 상자에 표시된 영역 내 적색 픽셀 수를 기록하십시오.

해당 영역 내의 적색 픽셀 비율은 Col10a1 발현량을 나타냅니다. 이제 동일한 기본 기술을 사용하여 MCC와 연골하골의 TRAP 활성도를 정량화하십시오. 먼저, 분석 영역으로 연골하골 부위의 연골을 선택하고 전체 픽셀 수를 기록하십시오.

그 다음, ELF97 기질에 의해 생성된 노란색 픽셀을 선택합니다. 양성 픽셀의 수를 기록하고 TRAP 양성 픽셀의 분율을 계산합니다. 이제 DEPI로 청색 대조 염색된 EDU 양성 세포를 정량화합니다.

다시 한번 관심 영역을 선택한 후, 해당 영역 내의 청색 픽셀 수를 정량화합니다. 동일한 영역에서 EDU 양성 픽셀 수를 결정하는 데에도 이 방법을 사용하십시오. 압축성 TMJ 하중을 가한 생쥐의 형태 측정 결과, 하중 부하로 인해 하악골과 하악과두의 길이가 유의미하게 증가한 것으로 나타났습니다.

그럼에도 불구하고, 하중 부하는 하악과 너비의 유의미한 변화를 일으키지 않았습니다. 콜라겐 분포를 정량화한 결과, 하중을 가한 동물의 하악과에서 Col10a1 발현과 MCC가 유의미하게 증가한 것으로 나타났습니다. 반면, Col2a1 발현은 대조군과 큰 차이가 없었습니다.

하악과(condyles)의 연골하 영역과 하중이 가해진 마우스에서 TRAP 활성이 증가했으며, sub proliferation 또한 증가했습니다. EDU 염색은 증식 세포의 수를 나타냅니다. MCC의 프로테오글리칸 분포는 Toluidine blue 염색 면적과 거리 맵을 평가하여 정량화되었습니다.

부하를 가한 그룹의 하악과 MCC에서 거리 매핑(distance mapping)이 유의미하게 증가했습니다. 그러나 프로테오글리칸(proteoglycan) 염색 영역은 그룹 간에 통계적 차이가 없었습니다. 이 영상을 시청하고 나면 설치류 하악과의 세포 및 구조적 변화를 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.