형태학 및 Murine 악의 관절 돌기 세포 분석 방법

이 실험의 전반적인 목표는 방사선 사진 및 조직학적 분석에서 형태 측정 측정을 사용하여 마우스의 하악 과두 연골에서 압축 하중의 영향을 관찰하는 것입니다. 이러한 지표는 설치류의 하악 과두 내의 구조적 및 세포 변화에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에 표시된 기술의 주요 장점은 다른 작은 동물이나 참여한 동물을 분석하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.

이 프로토콜의 경우, 사용할 준비가 된 분리되고 절개된 마우스 하악골이 있어야 합니다. 페트리 접시에서 하악골을 X-ray 캐비닛 시스템으로 옮깁니다. 그런 다음 26k볼트에서 5초 동안 방사선 사진을 찍습니다.

이제 분석 소프트웨어에서 이미지를 열어 형태 측정을 수행합니다. 먼저 단위 버튼을 사용하여 스케일 바를 설정합니다. 다음으로, 마커 스타일 2를 사용하여 6개의 해부학적 점을 선택합니다.

먼저 하악 과두의 가장 뒤쪽 지점을 점 1로 선택합니다. 다음으로, 포인트 2에 대해 절개 프로세스를 선택합니다. 그런 다음 점 3에 대한 시그모이드 노치에서 가장 깊은 점을 선택합니다.

다음으로, 하악골 골격의 오목한 부분에서 가장 깊은 지점인 4번 지점을 선택한 다음 과두 관절 표면의 가장 앞쪽 지점인 5번 지점을 선택합니다. 이제 과두 관절 표면의 가장 뒤쪽 지점을 점 6으로 선택하고 길이 도구를 사용하여 길이 측정을 진행합니다. 다음으로, 점 3에서 4까지의 수직선 도구를 사용하여 점 1에서 점 3과 4 사이의 선까지 수직의 길이인 과두 길이를 측정합니다.

그런 다음 점 1과 점 2 사이의 하악 길이를 측정합니다. 마지막으로 5번과 6번 포인트 사이에 있는 과두 머리 너비를 측정합니다. 데이터를 저장하려면 화면 오른쪽의 측정 목록을 복사하십시오.

고정되었지만 석회질화되지 않은 하악골을 삽입하기 전에 PBS의 30% 자당에 밤새 담그십시오. 다음날, 여분의 연조직을 절개하고 하악 과두를 조심스럽게 자릅니다. 이제 샘플을 플라스틱 주형에 넣고 과두의 내측 표면이 주형 바닥에 닿고 샘플이 주형 바닥과 평행하도록 합니다.

그런 다음 임베딩 레진에 담그고 드라이아이스 조각으로 레진을 식힙니다. 다음으로, 더 많은 임베딩 레진으로 금형을 마무리합니다. 냉동고 또는 드라이 아이스로 냉각 된 차가운 2 개의 메틸 부탄으로 옮깁니다.

식힌 후에는 절단을 위해 표본을 섭씨 영하 20도 또는 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 과두의 시상절의 MCC에서 Col10a1 발현을 정량화하려면 이미지 분석 소프트웨어 패키지에서 조직학적 이미지를 열고 올가미 도구를 사용하여 관심 영역을 선택합니다. 이 경우 MCC 영역이 선택됩니다.

히스토그램 상자에 보고되는 영역의 픽셀 수를 기록해 둡니다. 그런 다음 색상 범위를 조정하여 Col10a1 빨간색 픽셀을 선택합니다. 스포이드 도구를 사용하여 이미지에서 빨간색 픽셀을 선택하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 히스토그램 상자에 보고된 대로 영역의 빨간색 픽셀 수를 기록합니다.

영역에서 빨간색 픽셀의 비율은 Col10a1 표현의 양을 나타냅니다. 이제 동일한 기본 기술을 사용하여 MCC 및 연골하 뼈의 TRAP 활성을 정량화합니다. 먼저 연골하 뼈 영역의 연골을 분석할 영역으로 선택하고 전체 픽셀을 기록해 둡니다.

그런 다음 ELF97 기판에 의해 생성된 노란색 픽셀을 선택합니다. 양수 픽셀의 수를 기록하고 TRAP 양수 픽셀의 비율을 계산합니다. 이제 DEFI에 의해 파란색으로 역염색된 EDU 양성 세포를 정량화합니다.

다시 한 번, 관심 영역을 선택한 다음 그 안에 있는 파란색 픽셀을 정량화합니다. 또한 이 방법을 사용하여 동일한 영역에 있는 EDU 양의 픽셀 수를 확인할 수 있습니다. 압축 TMJ 하중을 받은 마우스의 형태 측정은 하중이 하악골 및 과두두 길이를 크게 증가시킨 것으로 나타났습니다.

그럼에도 불구하고, 하중은 과두 폭에 큰 변화를 가져오지 않았습니다. 콜라겐 분포를 정량화한 결과 Col10a1 발현과 적재된 동물의 과두의 MCC가 크게 증가한 것으로 나타났습니다. 반면, Col2a1 발현은 대조군과 크게 다르지 않았다.

TRAP 활성은 과두와 적재된 마우스의 연골하 영역에서 증가했으며 서브 증식도 마찬가지였습니다. EDU 염색은 증식 세포의 수를 나타냅니다. MCC의 프로테오글리칸 분포는 Toluidine 블루 염색 영역과 거리 지도를 평가하여 정량화했습니다.

적재된 그룹의 과두의 MCC에서 거리 매핑이 크게 증가했습니다. 그러나 프로테오글리칸 염색 영역은 그룹 간에 통계적으로 다르지 않았습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 설치류의 하악 과두에서 세포와 구조적 변화를 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.