Name: 형태학 및 Murine 악의 관절 돌기 세포 분석 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 학습하세요 생쥐 악관절 연골의 형태학적 및 세포적 변화 분석 방법을. 방사선 촬영과 조직학 분석을 활용하여 압축 하중의 영향을 정량적으로 평가할 수 있습니다.

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저자는 친절 하 게 제공 하 고 유전자 변형 쥐 리 첸 조직학 지원에 대 한 박사 데이비드 로우를 감사 하 고 싶습니다.
이 간행물에 보고 된 연구는 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구의 보너스 번호 K08DE025914에서 건강의 국가 학회 및 미국 협회의 교정 기초 Sumit Yadav에 의해 지원 되었다.

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</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.

이 원고는 형태학 측정 및 세포 분석 murine 악의 condyles mandibles의 방법을 설명합니다. 방사선 형태학 측정 작은 실험 동물에서 다른 뼈 분석을 사용할 수 있습니다. 또한, 세포 분석 (셀 정량화 및 연골 거리 매핑) 설치류 악의 관절 돌기에 국한 되지 않습니다 하지만 수많은 조직의 조직학 섹션 척도를 사용할 수 있습니다.
유전자 변형 마우스 모델 표현 형광 기자는 유전자 발현에 변화를 시각적으로 이해 우수한 도구입니다. Transgenes는 고객 센터의 prehypertrophic 및 hypertrophic 지역에서 그렇게 표현 됩니다 이후 더블 콜라겐 형광 기자 마우스 모델 (Col2a1XCol10a1)이이 보고서에 사용 되는 고객 센터의 연구에 특히 적합 했다 그 콜라겐 배포 평가 될 수 있습니다. 연구원에 형광 기자를 표현 하는 유전자 변형 마우스 모델에 액세스할 수 없는 경우에 조직학 단백질 표정 분석, 면역 형광 검사, 등의 다른 방법은 사용할 수...

TMJ craniofacial 지역에 위치한 독특한 로드 베어링 조인트 이며 fibrocartilage의 형성 된다. MCC는 TMJ의 말하기와 masticating, unhindered 턱 운동을 하 여 관절 기능을 위해 필수적 이지만 일반적으로 관절염1를 포함 한 퇴행 성 질환에 의해 영향을 받습니다. TMJ 고객 센터2,3,,45의 구성 요소 구조와 세포 변화를 선도 외부 자극 및 로드 변경에 적응 하는 능력이 있다. MCC의 부하 베어링 속성 그것의 성분, 물, 콜라겐 네트워크를 포함 하 고 밀도가 proteoglycans 포장 사이 상호 작용에 의해 설명 될 수 있다. 고객 센터는 콜라겐과 비 콜라겐 단백질의 종류를 나타내는 4 개의 고유 셀룰러 영역: 1) 표면 또는 관절 영역; 요구; 로드에 응답 하는 2) 증식 영역, 미 분화 간 엽 세포의 구성 성숙한 chondrocytes 표현 콜라겐 유형 2; 3) prehypertrophic 영역 구성 그리고 4)는 hypertrophic 영역, 콜라겐 표현 hypertrophic chondrocytes 10 다를 입력 하는 지역 및 석 회화를 받 다. 비 mineralized 지역 proteoglycans 압축 력을6에 저항을 제공 하는 풍부 하다.
Hypertrophic 영역에서 골 chondrogenesis에서 전환 발생 하면 고객 센터의 지속적인 강화는 악의 관절 돌기7의 마찰의 뼈의 강력한 미네랄 구조를 보장. Unmineralized 및 광물 화 된 지역에서 세포질 변화는 궁극적으로 악의 관절 돌기에 mandible 형태학 및 구조 변화에 리드. 고객 센터의 모든 세포질 영역 및 마찰의 부분의 강화 작용의 항상성 유지, 부하 베어링 용량, 건강과 TMJ의 무결성을 필수적입니다.
여러 콜라겐 유전자 변형 마우스 모델 (Utreja 그 외 여러분에 의해와 같이) 8 모든 transgenes는 MCC에서 표현 됩니다 때문에 콜라겐 식의 변화를 이해를 사용 하 여 훌륭한 도구입니다. 깊이 조직학 평가, 대 한 조직학 얼룩 매트릭스 증 착, 강화 작용, 세포 증식, apoptosis, 뿐만 아니라 고객 센터의 다른 세포 층에 단백질 식 공부 하는 데 사용 됩니다.
이 원고, 조직학 및 형태학 분석 쥐의 악의 관절 돌기의 MCC 및 마찰의 뼈에서 세포 및 구조 변화를 평가 하는 데 사용 됩니다. 또한, 세포 정량화 방법, 형광 조직학 이미지를 분석 하 고 가벼운 현미경 슬라이드를 매핑 설명 되어 있습니다. 고객 센터 및 마찰의 뼈9세포 형태학 변화 원인, 메서드를 로드 압축 정적 TMJ 또한 우리의 방법을 확인 하기 위해 그림입니다.
형태학 및 악의 관절 돌기에 설치류의 mandible 조직학 변화 결정 또는 endochondral 나오고의 다른 지역 및 추가 광물 화 된 직물의 형태 분석 여기에 설명 된 방법은 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>MX20 방사선 촬영 시스템</td><td>Faxitron X-Ray LLC&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>디지마이저 이미지 소프트웨어&nbsp;</td><td>MedCalc 소프트웨어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cryomatrix 임베딩 수지</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>수동 현미경 Axio Imager Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td>208562</td><td></td></tr><tr><td>노란색 형광 단백질 필터&nbsp; - EYFP</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>청록색 형광 단백질 필터 - ECFP</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>빨간색 형광 단백질 필터 - Cy5</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 아세테이트 무수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 L-타르타르트 이염기성 이수화물&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>228729</td><td></td></tr><tr><td>아질산나트륨&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>ELF97 기판</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E6600</td><td></td></tr><tr><td>ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS 키트</td><td>Life Technologies</td><td>C10339&nbsp;</td><td>EdU(5-에티닐-2'-데옥시우리딘) 포함&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 단일염기&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>톨루이딘 블루 O&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>어도비 포토샵&nbsp;</td><td>Adobe Systems Incorporated</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate 완충 식염수 정제(PBS)</td><td>Research Products International</td><td>P32080-100T</td><td></td></tr><tr><td>CNA Beta III 니켈 프리 Archwire</td><td>Ortho Organizers, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad 프리즘&nbsp;</td><td>GraphPad 소프트웨어, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

형태학 및 murine 악의 관절 돌기 세포 분석 방법

A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle

턱 관절 (TMJ) 외부 자극에 적응 하는 능력 있고 변경 로드 condyles의 위치 뿐만 아니라 악의 condylar 연골 (MCC)의 구조와 세포 구성 요소에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 원고에는 이러한 변경 및 마우스 (즉, 압축 정적 TMJ 로드)에서 TMJ의 로드를 변경 하는 방법을 분석 하는 방법을 설명 합니다. 여기에 그림 구조 평가 Digimizer 소프트웨어를 사용 하 고 작은 뼈의 방사선에서 수행 되는 간단한 형태학 접근 이다. 또한, 휴대의 분석 선도 콜라겐 식, 뼈, 세포 분열, 변경에 변화와 proteoglycan 메일 고객 센터에서 설명 하는. 이러한 변화는 긍정적인 형광 픽셀을 사용 하 여 계산 하 여 조직학 단면도-의 정량화 이미지 소프트웨어 및 측정 거리 매핑 및 스테인드 영역 Digimizer-는 또한 설명 했다. 여기에 표시 된 메서드는 murine TMJ에 국한 되지 않습니다 하지만 추가 뼈 작은 실험 동물의 및 endochondral 나오고의 다른 지역에서 사용 될 수 있습니다.

기술 통계는 형태학 측정 (악의 길이, condylar 길이, condylar 폭) 및 조직학 분석의 분포를 검사를 수행 했다. 결과 로드 그룹 (즉, 마우스 베타 티타늄 스프링 압축 선적을 복종)와 (즉, 일치 하는 모든 프로시저에는 영향을 받지 않은 통제 쥐) 컨트롤 그룹 사이 비교 되었다. 수단 간의 통계적으로 유의 한 차이 짝이 없는 t-검정, 및 p-값에 의해 결정 되었다 < 0.05 통계적으로 중요 한 것으로 간주 되었다.
형태학 측정, 단계 4 및 그림 3에서 설명한 대로 로드의 mandibles 및 제어 그룹에서 수행 했다. 크게 증가 mandible 길이 제시 로드 그룹 (로드: 16.62 ± 0.23 m m 제어 대: 16.21 ± 0.2 m m; p < 0.0...

이 원고 형태학 및 설치류의 악의 관절 돌기 내의 세포질 변화를 분석 하기 위한 메서드를 제공 합니다.

형태학 및 Murine 악의 관절 돌기 세포 분석 방법

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the ...

본 실험의 전반적인 목적은 방사선 사진의 형태측정학적 측정과 조직학적 분석을 통해 마우스 하악 과두 연골에서 압축 하중의 영향을 관찰하는 것입니다. 이러한 지표들은 설치류 하악 과두 내의 구조적 및 세포적 변화에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기서 제시된 기술의 주요 장점은 다른 소형 골격 또는 관절 동물을 분석하는 데에도 사용될 수 있다는 점입니다.본 프로토콜을 위해, 분리 및 해부된 마우스 하악골을 준비하십시오. 페트리 접시에 담긴 하악골을 X선 촬영 캐비닛 시스템으로 옮깁니다. 그 후, 26 kilovolts에서 5초 동안 방사선 사진을 촬영합니다.이제 분석 소프트웨어에서 이미지를 열어 형태측정학적 측정을 수행합니다. 먼저, 단위 버튼을 사용하여 스케일 바를 설정하십시오. 다음으로, 마커 스타일 2를 사용하여 6개의 해부학적 지점을 선택하십시오.먼저, 하악과(mandibular condyle)의 가장 후방 지점을 1번 지점으로 선택합니다. 다음으로, 절흔 돌기(incisored process)를 2번 지점으로 선택합니다. 그런 다음, 시그모이드 절흔(sigmoid notch)의 가장 깊은 지점을 3번 지점으로 선택합니다.다음으로, 하악지 오목부의 가장 깊은 지점인 4번 지점을 선택한 후, 과두 관절면의 가장 앞쪽 지점인 5번 지점을 선택하십시오. 이제 과두 관절면의 가장 뒤쪽 지점을 6번 지점으로 선택하고, 길이 측정 도구를 사용하여 길이 측정을 진행하십시오. 그다음, 3번 지점에서 4번 지점까지 수직선 도구를 사용하여 과두두 길이를 측정하는데, 이는 1번 지점에서 3번과 4번 지점 사이의 선까지의 수직 거리입니다.그런 다음, 1번 지점과 2번 지점 사이의 하악 길이를 측정합니다. 마지막으로, 5번 지점과 6번 지점 사이의 과두 머리 너비를 측정합니다. 데이터를 저장하려면 화면 오른쪽에 있는 측정 목록을 복사하십시오.고정되었으나 탈회되지 않은 하악골을 임베딩하기 전에, PBS 내의 30% sucrose 용액에 하룻밤 동안 담가둡니다. 다음 날, 과도한 연조직을 제거하고 하악과두를 조심스럽게 절단합니다. 이제 샘플을 플라스틱 몰드에 넣는데, 이때 과두의 내측면이 몰드 바닥에 닿게 하고 샘플이 몰드 바닥과 평행하도록 배치합니다.그런 다음, 시료를 매립 수지에 담그고 드라이아이스 조각으로 수지를 냉각합니다. 다음으로, 몰드의 윗부분을 매립 수지로 더 채웁니다. 이를 냉동고나 드라이아이스로 냉각시킨 차가운 2-methyl butane으로 옮깁니다.냉각된 시료는 절편 제작을 위해 -20 °C 또는 -80 °C에서 보관하십시오. 하악과 시상면 절편의 MCC에서 Col10a1 발현량을 정량화하려면, 이미지 분석 소프트웨어 패키지에서 조직학적 이미지를 열고 올가미 도구를 사용하여 관심 영역을 선택합니다. 여기서는 MCC 영역을 선택합니다.히스토그램 상자에 표시된 해당 영역의 픽셀 수를 확인하십시오. 다음으로, 색상 범위를 조정하여 Col10a1 적색 픽셀을 선택합니다. 스포이드 도구를 사용하여 이미지에서 적색 픽셀을 선택하고 확인(OK)을 클릭하십시오. 그런 다음, 히스토그램 상자에 표시된 영역 내 적색 픽셀 수를 기록하십시오.해당 영역 내의 적색 픽셀 비율은 Col10a1 발현량을 나타냅니다. 이제 동일한 기본 기술을 사용하여 MCC와 연골하골의 TRAP 활성도를 정량화하십시오. 먼저, 분석 영역으로 연골하골 부위의 연골을 선택하고 전체 픽셀 수를 기록하십시오.그 다음, ELF97 기질에 의해 생성된 노란색 픽셀을 선택합니다. 양성 픽셀의 수를 기록하고 TRAP 양성 픽셀의 분율을 계산합니다. 이제 DEPI로 청색 대조 염색된 EDU 양성 세포를 정량화합니다.다시 한번 관심 영역을 선택한 후, 해당 영역 내의 청색 픽셀 수를 정량화합니다. 동일한 영역에서 EDU 양성 픽셀 수를 결정하는 데에도 이 방법을 사용하십시오. 압축성 TMJ 하중을 가한 생쥐의 형태 측정 결과, 하중 부하로 인해 하악골과 하악과두의 길이가 유의미하게 증가한 것으로 나타났습니다.그럼에도 불구하고, 하중 부하는 하악과 너비의 유의미한 변화를 일으키지 않았습니다. 콜라겐 분포를 정량화한 결과, 하중을 가한 동물의 하악과에서 Col10a1 발현과 MCC가 유의미하게 증가한 것으로 나타났습니다. 반면, Col2a1 발현은 대조군과 큰 차이가 없었습니다.하악과(condyles)의 연골하 영역과 하중이 가해진 마우스에서 TRAP 활성이 증가했으며, sub proliferation 또한 증가했습니다. EDU 염색은 증식 세포의 수를 나타냅니다. MCC의 프로테오글리칸 분포는 Toluidine blue 염색 면적과 거리 맵을 평가하여 정량화되었습니다.부하를 가한 그룹의 하악과 MCC에서 거리 매핑(distance mapping)이 유의미하게 증가했습니다. 그러나 프로테오글리칸(proteoglycan) 염색 영역은 그룹 간에 통계적 차이가 없었습니다. 이 영상을 시청하고 나면 설치류 하악과의 세포 및 구조적 변화를 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

두개 안면 뼈의 세포 조직은 긴 가설하지만 직접 시각화 적이있다. 멀티 스펙트럼 셀 라벨 및 생체 라이브에서   영상은 제브라 피쉬 아래턱에 동적 셀 동작을 시각화 할 수 있습니다. 여기, 우리 세부 프로토콜은 Zebrabow에게 유전자 변형 물고기를 조작하고 직접 세포 인터 및 멕켈의 연골에서 연골 세포의 형태 학적 변화를 관찰한다.

배아 멕켈의 연골에 Zebrabow 클론 세포 분석을 통해 연골 세포 인터와 방향 확산의 시각화

많은 생물학적 구조 어려운 현대 형태 계측 학적 방법을 적용 할 수있어 쉽게 정의 최적 부족하다. 여기에서 우리는 크기를 정량화하고 변화를 형성하는 데 사용되는 세미 랜드 마크를 정의하는 계산 방법 다음 해부 및 microCT 스캔을 포함하여 마우스 음경 골 (음경의 뼈), 공부하는 방법을 설명한다.

음경 골의 해부, MicroCT 스캔 및 형태 학적 분석

우리는 응용 프로그램 제어 기계 부하 또는 영향의 후 그대로 murine 관절의 관절 표면에 세포 상해/죽음의 공간 범위를 평가 하는 방법을 제시. 관절염, 유전 요인 및 다른 로드 regimens 영향 chondrocytes 제자리에서 의 취약점을 조사 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

실시간 시각화 및 Chondrocyte 부상 때문에 완전히 그대로 Murine 연골 Explants 기계적 부하의 분석

이 프로토콜은 마우스 배아의 신선한 냉동 섹션에서 연골과 뼈의 분리를 위한 레이저 포획 미세 분부를 설명합니다. 연골과 뼈는 크레실 바이올렛 염색에 의해 빠르게 시각화되고 전사분석을 위한 고품질 RNA를 산출하기 위하여 정확하게 집합될 수 있습니다.

유전자 발현 분석을 위한 마우스 배아 연골 및 뼈의 레이저 포획 미세 해부

우리는 마우스에서 치열 교정 치아 운동을 생성하기위한 프로토콜과 교단없이 치주 인대의 콜라겐 섬유및 혈관의 3D 시각화방법을 제시한다.

만디큘러 뮤린 모델의 치열 교정 치아 운동 중 PDL 콜라겐 섬유의 3D 이미징

본 프로토콜은 내측 소인대를 절단하여 마우스 무릎을 불안정하게 한 후 관절 연골의 표면에 조절된 마이크로블레이드 스크래치를 기술한다. 이 동물 모델은 골괴사 형성, 골경화증 및 초기 단계 통증을 연구하기에 적합한 가속 형태의 골관절염(OA)을 제시합니다.

내측 반월판 및 연골 스크래치 쥐의 불안정화 가속화된 골관절염의 모델

이 프로토콜은 마우스에서 하악 제1대구치를 추출하는 방법에 대한 단계별 세부 사항을 보여줍니다. 턱뼈 치유 및 재생에 중점을 둔 연구자들에게 대안적인 방법을 제공합니다.

쥐 하악 어금니 추출 소켓 치유 모델 구축

여기에서 우리는 쥐 상악 모델에서 작동하는 관리 가능한 교정 치아 이동 프로토콜을 단계별로 보여줍니다. 각 단계에 대한 명확한 설명과 시각적 시연을 통해 연구원은 이 모델을 마스터하고 약간의 수정을 통해 실험 요구 사항에 적용할 수 있습니다.

쥐 상악 교정 모델의 확립

여기에서는 뼈 적응, 뿌리 흡수 및 기계적 자극에 대한 뼈 세포의 반응 메커니즘을 조사하는 데 적합한 모델 역할을 하는 치아 교정 운동(OTM)을 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 포괄적인 가이드는 OTM 모델, 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 획득 및 후속 분석에 대한 자세한 정보를 제공합니다.

생쥐의 치아 교정 운동 연구

여기에서는 마이크로컴퓨터 단층촬영을 기반으로 하는 방법을 자세히 설명하여 마우스의 두개악안면뼈의 3D 모델을 분할하고 측정하여 현재 방법으로 가능한 것보다 마우스의 두개악안면뼈 발달을 더 잘 평가할 수 있습니다.

3차원 마이크로컴퓨터 단층촬영을 사용한 마우스의 두개악안면 기형 분석

이 연구에서는 단계별 프로토콜을 설명하고 샘플 준비, 이미지 획득 및 데이터 분석을 포함하여 살아있는 세포에서 미토콘드리아의 형태학적 특성을 결정하기 위한 주요 세부 사항을 강조합니다. 이 방법은 다양한 조건을 연구하기 위해 미토콘드리아 형태를 검사하는 데 일반적으로 사용됩니다.

컨포칼 현미경을 사용한 살아있는 세포의 미토콘드리아 형태 측정

학습하세요 생쥐 악관절 연골의 형태학적 및 세포적 변화 분석 방법을. 방사선 촬영과 조직학 분석을 활용하여 압축 하중의 영향을 정량적으로 평가할 수 있습니다.

형태학 및 Murine 악의 관절 돌기 세포 분석 방법

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