해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

이 초파리 뇌 박리 프로토콜의 전반적인 목표는 면역 형광, GFP 표지 단백질 국소화 및 생체 외 배양 실험과 같은 광범위한 응용 분야에 사용할 수 있는 성체 파리의 온전한 뇌를 얻는 것입니다. 이 방법은 특정 단백질의 역할과 신호 경로, 뇌 발달 중 뉴런 연결 패턴 확립과 같은 발달 생물학 및 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 일단 숙달되면 성인 뇌의 특정 영역에서 형태학적 결함을 면역학적으로 식별할 수 있는 빠르고 효과적인 방법을 제공한다는 것입니다.

이 절차는 플라이 헤드에서 외골격을 제거하는 데 많은 주의와 연습이 필요할 수 있기 때문에 배우기 어려울 수 있습니다. 움직임은 느리고 신중해야 하며, 해부기구의 팔은 안정을 유지하기 위해 잘 지지되어야 합니다. 실제 실험을 위해 관심 유전자형을 실제로 해부하기 전에 빨간 눈 파리와 흰 눈 파리를 대상으로 연습하는 것이 좋습니다.

해부를 준비하려면 마취된 관심 파리를 차가운 금속 패드나 얼음 위에 올려 놓은 페트리 접시에 놓습니다. 또는 이산화탄소를 방출하는 플라이 패드를 사용하십시오. 다음으로, 해부 접시 중앙에 소량의 PTN을 넣어 PTN 거품을 만듭니다.

그런 다음 실체 현미경으로 균일한 조명 아래에서 PTN 기포로 시야를 채웁니다. 이제 파리가 배가 나오도록 조작하고 복부를 통해 PTN으로 파리를 옮깁니다. 동물을 PTN에 완전히 담그고 PTN에 잠긴 전체 해부를 수행합니다.

두 번째 집게로 주둥이를 잡고 머리를 몸에서 떼어냅니다. 때때로 주둥이는 제거되지만 머리는 몸에 붙어 있습니다. 이 경우 한쪽 망막의 내측 가장자리를 잡고 측면에 힘을 가하여 머리를 제거합니다.

복부와 흉부는 버리십시오. 이 단계에서는 PTN에 헤드를 유지하는 것이 중요합니다. 중추 뇌에서 VNC로의 연결은 이 방법을 사용하여 명확하게 분석할 수 없습니다.

다음으로, 큐티클의 중앙 구멍 가장자리에 있는 왼쪽 망막의 내측 가장자리를 잡고 집게를 서로 직접 분리하여 흰색의 끈적끈적한 기관으로 덮인 불투명한 구조인 시신경이 찢어지는 것을 방지하기 위해 천천히 잡아당깁니다. 망막이 해리됨에 따라 장력이 약간 감소합니다. 뇌가 찢어지는 것을 막기 위해서는 각 눈의 내측 가장자리를 잡고 겸자를 아주 천천히 잡아당기는 것이 매우 중요합니다.

너무 빨리 움직이면 뇌 형태가 변형되거나 뇌 조직이 손상될 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 각 쌍의 집게로 큐티클을 잡고 반대 방향으로 매우 천천히 당깁니다. 올바르게 수행되면 큐티클이 뇌 조직에서 분리되어 뇌는 손상되지 않은 상태로 유지되어야 합니다.

이 단계에서는 매우 날카로운 집게가 필요합니다. 그런 다음 주변의 큐티클을 한 조각씩 조심스럽게 제거합니다. 완고하게 붙어있는 큐티클을 제거하면서 뇌가 부서지지 않도록 남은 VNC를 움켜쥐어 뇌를 안정시키는 데 도움이 될 수 있습니다.

마지막으로, P200 피펫을 사용하여 절개된 뇌를 고정 및 면역 염색을 위해 PTN으로 채워진 플레이트의 웰로 옮깁니다. 현미경으로 P200 피펫을 사용하여 동일한 유전자형을 가진 10-15개의 절개된 뇌를 PTN에 희석된 4%파라포름알데히드로 채워진 0.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 실온에서 천천히 흔들면서 20분 동안 뇌를 배양합니다.

고정 후 뇌가 튜브 바닥에 정착하도록 한 다음 고정제를 제거합니다. 다음으로, 세척당 500마이크로리터의 PTN으로 두 번의 빠른 세척을 수행합니다. 뇌가 튜브에 정착하자마자 PTN을 교환하십시오.

다음으로, 실온에서 부드러운 교반을 사용하여 PTN으로 세 번 긴 세척을 수행합니다. 이러한 세척 후, 뇌는 섭씨 4도의 PTN에서 하룻밤 동안 저장될 수 있습니다. 마지막 PTN 세척을 제거한 후 실온에서 최소 30분 동안 0.5ml의 차단 용액에 뇌를 배양하고 부드럽게 교반합니다.

차단액을 제거한 후 차단액에 희석된 1차 항체를 첨가하고 부드러운 교반으로 2일 동안 섭씨 4도에서 뇌를 배양합니다. 5개의 세척 PTN 세척 연대를 사용하여 1차 항체를 제거합니다. 그런 다음 2차 항체를 적용합니다.

이러한 항체가 흔들림으로 빛으로부터 보호된 상태에서 실온에서 3시간 동안 조직과 함께 배양할 수 있도록 합니다. 2차 항체 용액에서 뇌를 배양한 후 PTN 세척 연대를 적용합니다. 세척할 때마다 샘플을 호일로 덮고 가능한 한 많은 버퍼를 제거하여 마무리합니다.

다음으로, 75마이크로리터의 형광 페이드 방지 장착 매체를 추가하고 브레인과 배지를 파이펫 팁 안팎으로 한 번만 흘려보냅니다. 그런 다음 튜브를 호일로 싸서 섭씨 4도에서 며칠 동안 보관할 수 있지만 이상적으로는 장착을 직접 진행하는 것이 좋습니다. 두뇌를 장착하려면 다리 슬라이드를 만드십시오.

두 개의 베이스 커버를 양전하를 띤 슬라이드에서 약 1cm 간격으로 미끄러지도록 배치합니다. 양전하를 띤 면이 위를 향하도록 하십시오. 그런 다음 손톱 광택제로 커버 슬립을 슬라이드에 부착하고 광택제를 완전히 건조시킨 후 진행합니다.

다음으로, 슬라이드를 실체 현미경 아래에 놓고 피펫 뇌와 매체를 커버 슬립 사이의 공간에 넣습니다. 뇌의 시각화를 개선하기 위해 조명을 조정해야 합니다. 다음으로, 슬라이드에서 추가 장착 매체를 흡인하고 뇌를 피하도록 주의하십시오.

그런 다음 남아 있는 여분의 장착 매체를 제거합니다. 이렇게 하면 뇌를 더 정확하게 배치할 수 있습니다. 이제 집게를 사용하여 뇌의 더듬이가 위를 향하도록 격자 패턴으로 방향을 잡습니다.

그런 다음 뇌 위에 커버 슬립을 놓고 손톱 광택제를 사용하여 베이스 커버 슬립에 부착된 상단 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 이제 중앙 캐비티에 새 장착 매체를 드롭 방향으로 로드하여 모세관 작용에 의해 매체가 커버 슬립 아래로 당겨질 수 있도록 합니다. 캐비티가 채워지면 투명한 손톱 광택제를 사용하여 완전히 밀봉하십시오.

설명된 방법은 버섯 몸체를 포함하여 성인 뇌 내의 거의 모든 구조를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 뇌의 이 영역은 학습과 기억에 필요합니다. 버섯 몸체는 fasciculin 2 단백질을 인식하는 항체를 사용하여 쉽게 시각화할 수 있습니다.

이 단백질은 알파 엽과 베타 엽뿐만 아니라 중앙에 위치한 타원체에서 많이 발현됩니다. 이 기술은 버섯체 뉴런의 적절한 축삭 유도에 필요한 여러 세포 과정을 식별할 수 있게 해주었습니다. 이러한 과정의 중단은 뇌 정중선 영역을 가로지르는 부적절한 축삭돌기 투영 및 알파 엽 누락과 같은 다양한 돌연변이 표현형을 유발합니다.

이러한 돌연변이 표현형은 종종 불완전하게 침투하기 때문에 여러 뇌의 검사가 필요합니다. 축삭돌기 경로 찾기에서 단백질의 자율적 역할을 조사하기 위해 Markham 기술을 사용하여 비형광 야생형 배경에서 개별 GFP 양성 돌연변이 또는 야생형 뉴런의 축삭 유도 결정을 시각화할 수도 있습니다. 여기에 설명된 방법을 사용하면 성인 초파리 뇌의 가상 영역을 신뢰할 수 있고 재현 가능한 시각화할 수 있습니다.

여기에서는 버섯체 뉴런에 초점을 맞췄습니다. 이 프로토콜의 텍스트 버전에서는 시신경의 시각화도 시연했습니다. 다른 연구에서도 유사한 기술을 사용하여 pars intercerebralis, clock neurons 및 antennal lobe projection neuron을 시각화했습니다.

일단 숙달되면, 제대로 수행된다면 각 뇌는 3분에서 5분 안에 해부될 수 있다. 이 절차를 시도하는 동안 현미경 근처에서 팔을 안정화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 천천히 움직이고 작은 큐티클 조각을 한 번에 하나씩 제거하는 것도 중요하다.

너무 빨리 움직이면 기저에 있는 뇌 조직에 원치 않는 손상이 발생할 수 있습니다. 면역형광 기반 현미경 실험에 절개된 뇌를 사용하는 것 외에도 뇌 조직을 추가 실험에 사용할 수도 있습니다.