Name: 해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 배우세요 성충 Drosophila melanogaster 뇌 해부 및 면역형광 염색법으로 신경 발달 연구를 수행하는 방법입니다. 이 기술은 버섯몸 및 광수용체 신경 세포의 형태학적 결함을 신속하게 식별할 수 있습니다.

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우리는 처음 가르치는 SMK 뇌 해 부 기술 Changhui 박세리 Alysia Vrailas 모 티 머를 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 비판적 원고를 읽기 위한 켄 Moberg의 랩 그룹, 특히 크리스 라운드의 회원을 감사 합니다. Fas2를 인식 하는 항 체 (1D 4) 및 chaoptin (24B10) 개발 연구 Hybridoma 은행에서 입수 했다. 항 체 24B10 시 모어 관련 및 난시 Colley24,,6061로 DSHB에 예금 되었다, 항 체 1D 4 코리 굿 맨 22,,2356여는 DSHB에 예금 되었다. 플라이 주식 블루밍턴 재고 센터에서 얻은 했다. 우리는 또한 오하이오 농업 연구와 개발 센터 (OARDC) MCIC 이미징 센터 confocal 현미경의 사용에 대 한 이미지 그림 4A에서 두뇌를 감사 하 고 싶습니다 및 B. SMK NICHD에서 교부 금에 의해 지원 됩니다 (1 r 15 HD084241-01A1).

1. 초파리 melanogaster 유전학 및 선택적 열 충격 절차
<ol>한 번 <li>파리를 건너 고 F1 자손 부 화는, 여성 및/또는 적절 한 유전자 형의 남성 얻을. 조사 되 고 두뇌 지역에 따라 파리 매일 수집 해야 하 고 두뇌 연결성의 연령에 따라 또는 성적으로 동종이 형 패턴을 보다 쉽게 구분할 수 있도록 성별 구분. 
	참고: 옵션: 파리 Repressible 셀 마커 (MARCM) 분석 12 , 47, 배아, 애벌레, 모자이크 분석에 사용 되는 또는 pupae 열을 30-45 분 동안 37 ° C에서 충격 을된 해야 합니다. 유도 mitotic 재결합. MARCM 분석에 대 한 버섯의 특정 영역을 대상으로 하기 위해서는 12로 결정 하 고 그림 5 B에 명시 된 일정에 따라 열 충격을 초과 한다. MARCM를 사용 하 여 버섯 시체 외 두뇌 지역 조사를 하는 경우 파일럿 실험 열 충격 될 최적의 결정을 수행 되어야 합니다. 다음 단계는에 관해서는 작성 하는 동안 eclosed 파리, pharate 성인 수 있습니다 또한 수 해 부 번데기 케이스를 제거 되 면 다음이 단계를 사용 하 여.</li>
</ol> 2. 해 부 역 준비 <ol><li>위치와 소스 stereomicroscope 및 빛 섬유 광섬유 goosenecks 큰 벤치탑에 첨부. 꾸준한 손 움직임을 홍보 하 여 손을 감소 &#34; 흔들어 &#34; 해 부, 하는 동안 적절 한 손과 팔 나머지 공간을 현미경 주위 사용할 수 필수적입니다. 현미경 및 현미경의 기지와 벤치의 가장자리 사이 4-6 인치 양쪽에 약 8-10 인치 인지 확인.</li>
	<li>채우기 2 또는 3 웰 스는 유리의 9 잘 또는 3-잘 접시 PTN 버퍼의 1.0 mL (0.1 M 나트륨 인산 버퍼 pH 7.2, 0.1% 비 계면 활성 제, 완전 한 버퍼 구성 요소에 대 한 자료 표 참조) 얼음 해 역 장소. 새로 해 부 두뇌가이 접시에 전송 되 고 정착 단계까지 저장.
	<ol><li>참고: 라이브 이미징 필요한 경우 절 개 버퍼 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 또는 HL3 버퍼 48 x 1 이어야 한다. 세포내 단백질 지역화가 필요한 경우 PBS 또한 사용할 수 있습니다 대체 버퍼 해 부 및 고정. 다음 고정, 세포 막의 permeabilization 다음 수행 해야 0.1% 또는 0.3% 비 세제를 포함 하는 PTN 세척을 사용 하 여.</li>
		<li>피 펫 팁 두뇌 microcentrifuge 관에 전송 하는 동안 플라스틱 피 펫 팁에 집착 하지 않도록 씻어 서 한 번 이상 (PTN) 등 세제를 포함 하는 버퍼를 해야 해 및 고정 PBS를 사용 하는 경우.</li>
	</ol></li> <li>실리콘 탄성 중합체를 포함 하는 해 부 접시를 만들 빈 35 m m 유리 또는 플라스틱 페 트리 접시를 사용 하 여. 간단히, 믹스 제조 업체에 따라 탄성 중합체 구성 요소 &#39; s 방향, 35 mm 접시에 부 어 하 고 평평한 표면에 하룻밤 유해. 엘라 스토 머 해 부 요리를 포함 하는 집게는 집게와 유리 접시와 같은 더 표면 사이 접촉 경우 쉽게 손상 될 수 있는 해 부의 좋은 팁을 보호 하기 위해 사용 되어야 한다. 우리는 또한 정기적으로 온라인 소매 업체에서 상업적으로 사용 가능한 실리콘 코팅 요리를 구입. 해 동안 대비를 증가, 실리콘 엘라 스토 머 해 부 요리 사 숯 (그리고 따라서 컬러 블랙)를 포함 하는 특히 유용 합니다.</li>
</ol> 3. 성인 뇌 해 부 절차 <ol><li>Anesthetize 3-5 일 오래 된 성인 D. melanogaster CO 2 또는 사용 하 여 얼음. 얼음을 사용 하 여, 유리병 파리를 포함 하는 것은 거꾸로 (아래 플러그 끝) ~ 5 분 얼음으로 유리병을 거꾸로 배치에 대 한 얼음 양동이에 방지 하는 장소에서 음식에 박 혀 되 고 파리. 일단 파리 anesthetized 되었습니다, 얼음에서 또는 플라이 패드 방출 CO 2에 차가운 금속 패드 또는 페 트리 접시 앉아에 파리 놓습니다. Neurodegeneration을 분석 하 고 머리를 해 부, 이전 파리 사용할 수도 있습니다.</li>
	<li>만들 전송 피 펫 또는 p200 피 펫을 사용 하 여 해 부 접시의 중앙에 PTN의 소량 (150-200 µ L) 장소는 &#34; 거품 &#34; PTN의. stereomicroscope 아래 해 부 접시와 놓고, 조명 조정 PTN의 거품 보기의 필드를 채우고 고 균일 하 게 조명 집중.</li>
	<li>파리를 조작 하는 그들은 &#34;를 배 &#34; (즉, 복 부 쪽) 금속 또는 CO 2 패드에 누워 있는 동안.</li>
	<li>#5 집게의 한 쌍을 사용 하 여 파악을 해 부 수, 유지 비행의 완전히 잠수함 그것은 PTN에서 해 부 접시에 파리의 복 부. 
	참고: 프로토콜의 나머지 부분에 대 한 모든 단계를 수행 해야 머리 PTN에 잠긴 동안.</li>
	<li>플라이 코의 파악 #5 집게의 두 번째 쌍을 사용 하 고 떨어져 시체에서 비행 머리를 분리 하려면 집게의 두 쌍. 복 부와 흉부를 삭제 합니다. 이 단계는 머리 나왔고는 PTN의 표면에 떠 허용 하지 중요 하다. 일단 머리에 떠 있는 그것은 매우 어려울 수 있습니다 두뇌를 분쇄 하지 않고 다시 파악. 
	참고:이 메서드를 사용 하 여 뇌와 복 부 신경 코드 간의 연결 절단 됩니다. CNS의 이러한 영역 간 그대로 연결 필요한 경우 50, 49 , 등의 대체 해 부 프로토콜을 따라야 한다. 코 머리 제거 되기 전에 비행 머리에서 분리, 구멍은 코가 있을 것입니다. 이 경우에, 비행 머리 한쪽 눈 근처 구멍의 가장자리에 파악. 서로 떨어져 집게의 두 쌍을 당기면 힘의 적당 한 금액을 사용 하 여 머리를 제거 합니다. 때때로, 머리는 신체에서 제거 되 면 본질적인 또는 복 부 신경 코드 남아 머리에 연결 된 및 해 부를 계속 하기 전에 제거 되어야 합니다.</li>
	<li>집게 한 쌍 코를 장악 하는 동안, 두 번째 쌍 바로 비행 눈의 중간 가장자리를 파악 한다. 천천히, 서로 떨어져 집게를 당겨. 이 단계는 안정 측면 힘의 작은 금액으로 수행 되어야 한다. 집게는 서로 그렇다 하 고 천천히 이동, 코 머리 떠나 고 머리 표 피에 중앙 구멍을 만들고 해야 합니다. 두 번째 쌍에서 오른쪽 눈의 중간 부분을 공개 하지 않고 코 집게의 첫 번째 쌍 삭제. 
	참고: 성인 D. melanogaster 두뇌는 꼬리에 (즉, 후부/후면) 비행 헤드의 지역. 머리의 그 지역 파악을 따라서, 피해 야 한다. 이상적으로,만 고 rostral (즉, 전면) 부분의 중간 망막 근처 머리는 겸 자에 의해 직접 파악 해야 한다. 두뇌와 관련된 기관 지금 표 피에 중앙 구멍을 통해 볼 수 있어야 합니다. 이 시점에서 기관 구멍에서 튀어나와의 흰색 힘 줄 스레드 수 제거 하 고 삭제.</li>
	<li>집게의 두 번째 쌍 (머리 표 피에 중앙 구멍의 가장자리)에서 왼쪽된 망막의 내측 가장자리를 잡고. 망막과 관련 된 표 피 제거, 180 ° 각도로 서로 멀리 집게를 당겨 천천히. 로 망막 기본 광 엽에서 분리, 당신은 긴장에 약간의 감소를 느껴야 한다. 천천히 찢 어 시 엽을 방지 하기 위해 진행. 
	참고:이 단계는 집게를 너무 빨리 분리의 찢 어에 발생할 수 있습니다.e 광 엽 또는 버섯 몸 구조의 중단. 때때로, 표 피를 제거 될 것 이다 하지만 망막의 광 엽에 연결 된 상태로 유지 됩니다. 버섯 시체를 이미징 하는 경우 완전히 전체 망막을 제거할 필요는 없습니다. 그러나, 다른 뇌 영역 (예: 광섬유 뇌 돌출부의 망막 신경 innervation)의 분석 48 , 51에 의해 설명 된 대로 완전히 제거 되 고 망막을 요구할 수 있습니다. 
	참고: 망막은 천천히 두뇌의 기본 광 엽에서 분리 해, 광 엽 해야 관찰 불투명 흰색 구조 백색, 힘 줄 기관으로 덮여 있습니다. 한 망막 제거 되었습니다 일단 삭제 될 수 있습니다. 분석할 때 망막 신경의 길, 광 엽 손상을 방지 하려면 특정 배려가 단계가지고 한다. 해 부에 초점을 맞춘 추가 프로토콜 및 포토 리셉터 뉴런의 라이브 이미징이 또한 사용할 수 48.</li>
	<li>이제 조심 스럽게 가능한 보이는 기도의 제거. 기도 포함 되어 또는 나중 부동 하 고, 잠재적으로, 나중에 immunostaining 단계 동안 손실 될 두뇌를 일으키는 공기를 채울 수 있습니다. #5 집게의 매우 날카로운 쌍을 사용 하 여 뇌에서 선택 기도 제거 하려면.</li>
	<li>집게의 두 쌍을 사용 하 여 왼쪽된 비행 망막의 중간 영역을 파악 하 여 나머지 망막 및 주변 표 피를 제거 합니다. 신중 하 게 망막과 표 피 제거를 절반 망막 눈물. 어떤 경우에는 두뇌를 분쇄 하지 않고 남아 있는 표 피를 제거 증명 특히 도전 한다. 이러한 경우에 우리는 복 부 신경 코드의 나머지 가닥 대신 장악 될 수 있다 집게 한 쌍에 의해 집게의 다른 쌍 신중 하 게 표 피의 마지막을 제거 하는 동안 나타났습니다.</li>
	<li>PTN 포함 9 또는 3 잘 요리 한 잘 해 부 두뇌 이동 p200 피 펫을 사용 하 여. 동일한 유전자 형의 두뇌는 잘 동일에 함께 풀링된 고 얼음에 보관 해야 합니다. 뇌 조직의 해 부의 1 시간 이내 고정 되어야 한다. 머리 작은 배치에서 고정 하 고 두뇌의 많은 수 필요한 경우 풀링된 수 있습니다. 대부분의 경우에는 경험 있는 연구원 수 일반적으로 두뇌를 해 부와 약 3-5 분에 유리 컬렉션 접시에 그것을 전송</li>
</ol> 4. 고정 및 Immunofluorescent 얼룩이 절차 <ol><li>0.5 mL microcentrifuge 튜브 4% paraformaldehyde PTN에 희석의 0.5 mL 가득 9-잘 접시에서 해 부 두뇌를 전송 p200 피 펫을 사용 하 여. 동일한 유전자의 적어도 10-15 두뇌는 하나의 microcentrifuge 관으로 결합할 수 있습니다. (슬라이드에 두뇌의 장착)까지 모든 나머지 단계 0.5 ml microcentrifuge 튜브에 완료 됩니다. 
	주의: Paraformaldehyde (PFA) 증기 두건에서 처리 되어야 합니다. PFA 폐기물 저장 하 고 적절히 폐기 해야 합니다. 20 %paraformaldehyde 유리 ampules에 구입한 microcentrifuge 튜브에 aliquoted 및 필요한 때까지-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
	<li>증기 두건 안쪽 락을 실 온에서 느린 속도로 20 분 동안 4 %paraformaldehyde 두뇌를 품 어.</li>
	<li>고정, 다음 중력에 의해 microcentrifuge 튜브의 하단에 정착을 두뇌 허용. 
	참고: 때때로, 두뇌 microcentrifuge 튜브의 측면에 충실 수 있습니다. 이 경우, 검지와 엄지 사이 튜브를 옆으로 회전 하거나 두뇌의 침 몰 홍보를 벤치에 관을 매우 부드럽게 일반적으로 도움이 됩니다.</li>
	<li>제거 정착 제는 p1000 사용 하 여 플라스틱 및 수행 2 &#34; 빠른 &#34; 세척 사이 microcentrifuge 튜브의 하단에 정착 하는 머리를 수 있도록 PTN의 500 µ L로 세척. 이러한 빠른 세척 하는 동안 모든 두뇌 microcentrifuge 튜브의 아래쪽에 중력에 의해 정착 되 면는 PTN 교환할 수 있습니다 즉시 신선한 버퍼; 추가 세척 시간은 필요 없습니다. 
	참고: 일반적으로, 뇌 제거를 걸고 하는 것이 좋습니다는 튜브에 여분의 버퍼를 떠나입니다. 피 펫 팁의 주의 깊은 검사 자주 없는 두뇌 튜브에서 잘못 제거 된 것을 보장 하기 위해 필요 합니다. 만약 두뇌 실수로 끝으로 pipetted, microcentrifuge 튜브에 다시 그들을 분배, 정착, 두뇌에 대 한 대기 및 다음 남아 있는 모든 여분의 PTN 제거 계속.</li>
	<li>마지막 빠른 세척 후 3을 수행을 p1000 피 펫을 사용 &#34; 긴 &#34; 세척: 로커/nutator에 실 온에서 PTN 및 20 분에 대 한 세척의 500 µ L를 추가. 모든 미래 &#34; 긴 &#34; 20 분 동안 세척 되어야 합니다. 
	참고: 다음이 세척, 머리 고정에 따라 저장 될 수 있습니다 하룻밤 PTN에서 4 ° C에서.</li>
	<li>마지막 세척 p1000 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 로커 또는 0.5 ml 차단 솔루션 [PTN + 5% 정상 염소 혈 청 (NGS)] 실내 온도에 적어도 30 분 동안 실 온에서 nutator에 두뇌를 품 어.
	<ol><li>염소 2 차 항 체는 후속 프로토콜 단계에서 사용 됩니다. 다른 종에서 이차 항 체 사용 될 차단과 항 체 솔루션에 그 종 (보다는 NGS)에서 정상적인 혈 청 사용 해야 합니다.</li>
	</ol></li> <li>P1000 피 펫을 사용 하 여, 차단 솔루션을 제거 하 고 추가 PTN (PTN 5 %NGS + 희석된 주 항 체)에 희석 하는 주 항 체. 1 차적인 항 체를 사용 하 여 처음으로, 그 항 체의 최적의 희석 실험적으로 결정 되어야 합니다. 
	참고: 버섯 몸 신경, 시각화에 대 한 Fas2를 인식 하는 항 체 일반적으로 사용 됩니다. 이러한 항 체 항 1D 4 체로 발달 연구 Hybridoma 은행 (DSHB)에서 사용할 수 있습니다 및 PTN + 5% 희석된 1시 20분 해야 NGS. 
	참고: 포토 리셉터 뉴런을 시각화, chaoptin를 인식 하는 항 체 일반적으로 사용 됩니다. Chaoptin 항 체 항 체 24B10로 DSHB에서 사용할 수 있으며 PTN + 5% 희석된 1시 20분 해야 NGS. 
	참고: 고정 프로세스는 일반적으로 형광 녹색 형광 단백질 (GFP) 등 형광 단백질에서 제거합니다. 따라서, MARCM를 사용 하 여 개별 MB 뉴런의 axonal 지도 분석을 사용 항 체를 인식 하는 GFP.</li>
	<li>2-3 박 4 주 항 체 솔루션 로커/nutator에 있는 두뇌를 품 어 ° c.</li>
	<li>1 차 항 체를 가진 외피, 다음 microcentrifuge 튜브의 하단에 정착 하 고 다음 주 항 체 솔루션을 제거 하 고 머리 허용.</li>
	<li>P1000 피 펫을 사용 하 여 수행 2 &#34; 빠른 &#34; 세척 및 3 &#34; 긴 &#34; 각 워시 사이 microcentrifuge 튜브의 아래쪽에 중력에 의해 정착 두뇌 신중 하 게 수 있도록 20 분 PTN의 0.5 mL로 세척 단계 4.4 및 4.5에서 위에서 설명한 대로,</li>
	<li>적절 한 붙일 표시 된 이차 항 체와 실 온에서 3 h에 대 한 품 두뇌. 2 차 항 체는 일반적으로 0.5 ml PTN + 5% 희석 1: 200의 농도에서 NGS. 
	참고: 일단 형광등 2 차 항 체를 추가 두뇌에서에서 지켜져야 한다 실험의 나머지 부분에 대 한 어두운. 
	참고: 경우 잔여 GFP 형광 남아, 그것은 이차 항 체 fluorophore GFP로 비슷한 여기/방출 파장을 갖는 표시를 사용 하는 것이 좋습니다 MARCM 분석을 수행할 때에 (예를 들어, Fluoroscein isothyocyanate (FITC) 또는 Alexa488).</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브의 하단에 정착 하 고 이차 항 체 솔루션을 제거 하 고 머리를 허용 다음 이차 항 체 외피.</li>
	<li>수행 2 &#34; 빠른 &#34; 세척 및 3 &#34; 긴 &#34; 각 워시 사이 microcentrifuge 튜브의 하단에 정착 머리 수 있도록 신중 하 게 단계 4.4 및 4.5에서 위에서 설명한 대로 20 분 PTN의 0.5 mL로 씻어,</li>
	<li>다음 3 &#34; 긴 &#34; 20 분 세척, 사용 가능한 많은 버퍼를 제거 하는 p200 피 펫.</li>
	<li>추가 75 µ L 형광 방지 페이드의 두뇌를 장착 중간. 피 펫 두뇌 그리고 혼합 한 번 피 펫 팁으로 장착 매체. 이후 두뇌 모자 또는 microcentrifuge 튜브의 측면에 갇혀 될 수 있습니다 튜브를 반전 하지 마십시오. 
	참고: 설치 매체에는 두뇌의 정지, 다음 관 수 fluorophore 냉각 속도를 알루미늄 호 일에 싸여 되며 4 ° C에서 밤새 껏 저장. 경우 필요한 두뇌 4 ° C에서 며칠 동안 저장 될 수 있다 하지만 이상적으로 마운트되어야 슬라이드에 최대한 빨리.</li>
</ol> 5. 현미경 슬라이드 및 이미징에 성인 D. melanogaster 두뇌 장착 <ol><li>빌드는 &#34; 다리 &#34; 슬라이드. 2 위치 &#34; 기본 &#34; coverslips 대략 1 cm 충전 된 슬라이드에 떨어져. 슬라이드의 충전 된 측 직면 하 고 있는지 확인 합니다. 그림 3 A와 같이 손톱 폴란드어와 슬라이드를 coverslips를 준수 합니다. 이러한 기본 커버 전표에서 하지 심지 않는 미디어 장착 되도록 손톱 폴란드어와 각 기본 커버 슬립의 3 개의 외부 가장자리를 밀봉 하기 위하여 일반적으로 도움이 된다. 손톱 폴란드어 건조 보자 (10-15 분) 진행 하기 전에.</li>
	<li>는 stereomicroscope 아래 슬라이드를 배치 하 고 해 부 두뇌를 포함 하는 두 개의 coverslips 사이 공간으로 설치 미디어 솔루션 플라스틱. 제공 하기 위해 더 많은 반면, 유용 벤치 탑과 평행 되도록 목이 빛을 기 동시 키는 것.</li>
	<li>제거를 피 펫을 사용 하 여 슬라이드에서 미디어를 추가 장착 되는 슬라이드 두뇌 플라스틱 하지 않도록 주의.</li>
	<li>심지 떨어져 추가 설치 미디어입니다. 이것은 두뇌를 다음 단계 더 정확 하 게 배치할 수.</li>
	<li>한 쌍의 집게와 stereomicroscope를 사용 하 여 세를 직면 하는 더듬이 돌출부와 그리드 패턴에서 슬라이드에 머리 위치</li>
	<li>장소 커버 슬립 (는 &#34; 다리 &#34;) ( 그림 3 A) 두뇌에. 다리 커버 슬립의 측면을 봉인 하기 위해 손톱 폴란드어를 사용 하 여 어디에 그들은 문의 &#34; 기본 &#34; 커버 전표.</li>
	<li>신선한 설치 미디어 ( 그림 3 B) 다리 아래 센터 구멍 채우기 천천히 p200 피 펫을 사용 하 여. 센터 coverslip의 오픈 가장자리에 한 번에 한 방울을 놓고 장착 미디어 센터 브리지 coverslip 아래 심지를 허용 합니다. 전체 캐비티 미디어, 장착으로 채워질 때까지 계속 다음 위쪽 인감 및 분명 손톱 폴란드어와 아래쪽.</li>
	<li>손톱 폴란드어 건조 되 면, 즉시 슬라이드 이미지 또는-20에서 광선이 꽉 슬라이드 상자에 저장할 ° c.</li>
	<li>1 주일 이내 두뇌 여기 레이저와 레이저 검사 confocal 현미경을 사용 하 여 이미지 및 큐브 선택한 형광 이차 항 체에 적절 한 필터. 버섯 몸 뉴런의 Z-스택 이미지 20 X 40 X 목표를 사용 하 여 얻을 수 있습니다 일반적으로. 포토 리셉터 망막 신경 세포 이미징 높은 확대를 요구할 수 있습니다.</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

위에서 설명한 해 부 및 시각화 방법을 immunostaining의 다양 한에서 사용할 수 있습니다 하 고 이미징 응용 프로그램을 라이브. 우리 일반 immunostaining 프로토콜을 설명 했습니다 하 고 있는 MARCM를 사용할 수 있는 개별 버섯 몸 뉴런의 axonal 형태를 시각화 하는 방법 중 하나를 강조 했습니다. 또한, 다른 뇌 영역에서 고정 된 이미지에 대 한 이러한 일반적인 절차를 사용하실 수 있습니다 또는 갓 해 부 성인 두뇌48,65. 예를 들어 증강 트랩, 리포터 유전자 또는 모방 라인66의 표현 패턴을 분석할 때 라이브 영상 보다 효율적인 접근을 제공할 수 있습니다. 방지 하기 위해 떼어낸된 조직에서 GFP의 라이브 영상 동안에 세포 죽음에서 아티팩트를 캡처, 두뇌 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 또는 HL3 미디어48x 1에 해 부, 다리 슬라이드 PBS (또는 HL3), x 1에 탑재 된 고 미만 15-20 분 관리에에서 몇 군데 또한 GFP 형광의 시각화를 방해할 수 있기 때문에, 이미징, 이전 해 부 두뇌에서 가능한 많은 기도 제거로 이동 한다.
버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 형태를 평가 하기 위한 얼룩 조건이 상대적으로 잘 설립24,61,67이 셀에 대 한 관심의 특정 단백질의 지역화 하는 동안 종류는 광범위 한 문제 해결 및 최적화 필요할 수 있습니다. 특히, 항 체 희석, 차단 버퍼 구성 요소 농도, 및 고정를 포함 하 여 몇 가지 중요 한 단계는 가장 재현 가능 하 고 신뢰할 수 있는 결과를 생성 최적화 되어야 합니다. 첫째, 기본 항 체의 최적 농도 결정 되어야 합니다. 비록 상업적으로 사용할 수 있는 항 체 자주 권장된 희석 (그리고 우리는 종종 처음 그 농도 사용 하 여 시작), 초파리 조직에 이러한 값 경험적으로 결정 거의 됩니다. 따라서, 테스트 범위 위와 제조업체의 시작 제안 자주 아래 좀 더 구체적인 얼룩이 지기 귀착되는 1 차적인 항 체 희석의 시리즈. 1 차적인 항 체 희석 얼룩 정확도에 큰 영향을 미칠 수 있습니다 정확 하 게 결정 되어야, 시간 두뇌는 포함 하는 1 차적인 항 체에서 알을 품을 하는 동안 솔루션 전체 결과에 거의 영향와 상당히 달라질 수 있습니다. 잠복기 해 부 Fas2 항 체 1 차적인 항 체와 두뇌 2, 3, 4 ° c.에도 4 일 때 예를 들어 우리가 비슷한 결과 관찰 해야 적어도 2 박 권장, 하지만 우리는 밤에 대 한 1 차적인 항 체 솔루션에 두뇌를 incubated 또한 있고 재현 얼룩을 얻은. 중요 한 것은, 두뇌는 실내 온도 (또는 4 ° C에서 1 박) 3 h 이차 항 체에 알을 품을 하는 시간의 양을 제한 뇌 조직에도 일반적인 바인딩을 2 차 항 체의 도움이 됩니다.
둘째, 그것은 제거 원치 않는 배경 신호를 추가 "차단" 시 약을 사용 하 여 필요할 수 있습니다. 옵션 ~ 10%, 1-10% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 또는 추가 하는 차단 및 1 차/2 항 체 솔루션, 초파리 배아 (참조 4 ° C에서 하룻밤 주 항 체의 사전 흡착 NGS의 농도 증가 등 참조68, 단원 2.9, 3 단계).
모든 고정을 위한 제안 버퍼 PTN를 사용 하 여 위의 프로토콜을 작성 하는 동안 세척, 그리고 항 체 외피 단계, 조직 고정 (PLP, PEM, 자료 테이블에 나열 된) 등 다른 버퍼에 심오한 차이 발생할 수 있습니다. 신호 강도입니다. 예를 들어 이전 학문은 E  조직, PBS에 희석 하는 전통적인 4 %paraformaldehyde 고정 때 애벌레 imaginal 디스크에서 감지 되지 않습니다 하지만 조직 PLP 버퍼 (켄 Moberg, 개인 고정 때 명확 하 게 표시 됩니다 설명 했다 통신, 및69참조). 버퍼에 변화 뿐만 아니라 조직 고정도 크게 영향을 미칠 수 immunofluorescent에 대 한 시간과 온도 변경 하는 구성 요소 얼룩 하 고 필요한 경우 경험적으로 결정 될 수 있다. 일반적으로, 고정 시간 충분 세포 구성 성분의 충분 한 가교에 대 한 및 장기적인 유지 관리 하면서 전반적인 세포 형태학의 제한 이상 가교 및 단백질 epitopes의 "매장"을 방지 하기 위해 충분. 따라서, 처음 새로 구입한 1 차 항 체에 대 한 착 조건을 최적화, 우리 일반적으로 정착 시간 약 20 분을 제한 하 고 종종 추운 온도에서 조직을 고정 시킬 것 이다.
몇 가지 컨트롤이 어떤 면역 형광 실험 관찰된 표현 형에 transgenes/유전 배경 효과 뿐만 아니라 1 차 및 이차 항 체의 특이성 조사에 포함 되어야 합니다. 특히 사용 되 고 기본 항 체 관심사의 단백질을 인식 하는지 여부를 확인, 파리 부족이 단백질 또는 단백질 overexpressing 조직에서에서 조직 컨트롤로 포함 되어야 합니다. 초과 순화 된 항 원 단백질의 1 차적인 항 체 비행 두뇌에서 다른 epitopes를 인식 하는지 여부를 확인 하려면 포함할 수 있습니다. 마지막으로, 모든 형광 신호 1 차 항 체는 생략 하는 경우 현재 선택한 2 차 항 체에 의해 일반적인 바인딩 수준을 나타냅니다.
몇 가지 중요 한 컨트롤 또한 유전 배경 기여 또는 transgenes 착 강도 또는 신경 형태학의 존재를 평가 하기 위해 포함 되어야 합니다. 예를 들어 그림 5 에서 MARCM 실험에 사용 되는 파리에는 여러 transgenes (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, 욕조 &#62; GAL80, 및 OK107 GAL4), 각각의 버섯 몸 형태에 대 한 효과 대 한 별도로 분석 해야 합니다. 파리의 아주 최소, 버섯 몸 형태에 OK107 GAL4 및 UAS-CD8-GFP를 분석 되어야 합니다. 열 충격의 효과 평가 하기 위해 해야 할 수도 있습니다를 Flp recombinase 생산 분석 하 여 버섯 몸 개발에 포함 하는 hsFLP 및 FRT82B 있습니다. MARCM는 주어진된 단백질 axonal 지도 제어 하는 여부에 자율적으로 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다,이 결론을 정확 하 게 확인 하는 데 필요한 컨트롤 수가이 기술의 마이너 제한 수 있습니다. 덜 복잡 한 실험에서 유사한 컨트롤 또한 적용 됩니다. 예를 들어 GAL4/UAS 시스템은 모든 신경 세포의 단백질의 최저의 식 RNAi transgene와 함께에서 사용 되는 실험 걸릴. 이 실험에서 두 개 이상의 transgenes 있을 것입니다: elav GAL4 등 UAS RNAi transgene 팬 신경 GAL4 드라이버. 포함 하는 각 이러한 transgenes 혼자 파리에 버섯 몸 신경의 형태 실험 조건 어디 파리 같은 비행에 모두 transgenes 항구 이외에 조사 한다.
마지막으로, 관심사의 단백질은 버섯 몸 신경 표현 여부를 확인 하려면 Fas2 항 체와 공동 얼룩 두뇌에 일반적으로 필요가 있다. 또는, 형광 단백질 같은 GFP, RFP, 또는 막 바인딩된 CD8-GFP GAL4/UAS 시스템을 사용 하 고 관심사의 단백질을 인식 하는 항 체와 조합 사용 표현 또한 수 있습니다. Fas2 버섯 몸 α와 β 돌출부를 형성 하는 fasciculated 축 삭 인식, 이후 GAL4 기반, 막 도약 CD8-GFP를 사용 하 여 버섯 몸 뉴런을 표시 하는 데 특히 유용 했습니다.
결함 axonal 지도에 자주는 아니지만 100% 침투 하 고 심지어 두뇌 동일한 유전자 형의 몇 가지 변화를 보여줄 수 있습니다. 따라서, 새로 분석 버섯 몸 또는 포토 리셉터 길 돌연변이 체 대립 유전자 결함에 대 한 생성, 다른 대립 유전자 및 접근의 조합을 활용 합니다. 문학에서 대부분의 연구는 몇 가지 다른 방법을 단백질 axonal 지도 제어 셀 자치 역할 여부 조사를 사용 하 여: 나) 길의 분석 (선호를 사용 하 여 다른 뉴 homozygous null 파리에 결함ll 대립 유전자), ii) 길의 분석 파리의만 (일반적으로 통해 RNAi), 신경 단백질 부족에 결함 iii) 길 결함과 iv의 MARCM 분석) 구조 유전자가 homozygous null의 뉴런에서 다시 표현 하는 실험 파리. 이상적으로, 유전자 형 당 몇 다스 두뇌 신경 형태학에 결함에 대 한 분석 되어야 합니다.
프로토콜 설명 여기 고정된 조직 내에서 단백질의 immunofluorescent 지역화에 주로 초점을 맞추고, 비록이 기술의 몇 가지 미래의 애플 리 케이 션 이미지 라이브 뇌 조직에 개발 되고있다. 일단 두뇌는 (일반적으로 셀 문화 미디어)에 해 부, 그들은 다음 수 교양 25 ° c.에 몇 일 동안 이러한 비보 전 자란 메서드는 다양 한 생물 학적 과정, 부상70,71, 세포내에 따라 축 삭 재생을 촉진 하는 단백질의 활동을 조사 하기 위하여 개발 되 고 있다 신호 역학72, 그리고 신경 개발73.

초파리 신 경계 인간과 설치류 보다 작습니다, 하지만 그 복잡성 척추 대응 이해를 강력 하 고 친근 한 모델을 제공 합니다. 대부분의 경우에서 척추와 파리의 게놈 신 시스템 개발의 메커니즘을 지정 하는 매우 비슷한 단백질을 인코딩합니다. 사실, 많은 유전자의 필요한 척추 신경 개발에 대 한 포함 하 여, 파리에 orthologs 관계가 신호 경로에 컨트롤 패턴, 성체, 및 axonal 지도1,2,3 ,,45. 예를 들어 netrin 포유류에 D. melanogaster6,,78axonal 지도에 필요한 ligand 이다. Netrin 미 발달 병아리 뇌 조직6에서 원래 고립 된 동안, 후속 연구 밝혀졌다 그 netrin 초파리8미 발달 중앙 신경 시스템 (CNS)의 개발 하는 동안 보존된 역할을 담당. 다른 연구 보존된 ligands와 초파리 및 척추 동물9길에 필요한 수용 체를 식별 하는 배아 초파리 CNS에서에서 유전 스크린을 사용 했습니다.
최근 작품의 많은 방법을 조사는 배아 비행 CNS는 ligands, 수용 체, 그리고 세포내 신호 단백질 axonal 안내8,9에 필요한 식별 하는 과거에 광범위 하 게 사용 되었다, 이 단백질은 또한 개발의 나중 단계 동안 길 결정을 제어합니다. 특히, 버섯 몸 (MB) 및 포토 리셉터 망막 신경 개발 (그림 1)의 조사는 제어 길, 시 냅 스 형성, 축 삭 가지 치기, 그리고 신경의 다른 여러 측면 메커니즘에 대 한 통찰력 제공 하고있다 개발10,11,12,13,14,15,,1617. 포토 리셉터 신경 세포는 lamina 라는 성인 두뇌의 지역에 비행 망막 연결 되며 골 수와 뇌 (18,19의 검토), 버섯 몸 신경 동안 시각적 정보를 릴레이 대 한 중요 한 중앙 비행 뇌에 위치 하 고 학습 및 메모리20,21에 필요한. 포토 리셉터 신경 및 Kenyon 셀 이라고 하는 버섯 시체의 내장 신경 그들의 시 냅 스 후 목표를 찾을 수 봤이 보존된 diffusible 연락처-종속 axonal 지도 및 메커니즘을 활용 합니다. 성인 파리에 표시 되 고, 이외에 포토 리셉터와 MB 뉴런 수 있습니다 또한 직접 구상 될 애벌레 및 번데기 항 체 또는 리포터 유전자22,23,,2425에. 쉽게 다른 발달 시간 지점에서 신경 세포의 두 집합을 시각화 하는 기능 신경 개발의 여러 측면에 대 한 최상의 모델으로 그들의 사용을 승진 했다.
정상적인 신 시스템 개발의 메커니즘을 이해 하는 모델로 사용 되 고, 이외에 최근 학문은 설명 했다 파리도 다양 한 허약한 X 증후군 (FXS)26 포함 하 여 인간의 질병의 정확한 모델로 사용할 수 있습니다. , 지적 장애 (ID)27,,2829,30,31, 그리고 다른 사람32. 예를 들어 ZC3H14의 분자 기능 연구, 최근 인간의 지적 장애에 연결 하는 유전자 만들었습니다 ZC3H14 ortholog의 Nab230라는 null 대립 유전자를 사용 하 여 ID의 비행 모델. 파리 Nab2 부족 심각한 메모리 장애가 있고, 인간 환자에서 관찰은 무슨 업과 확장 많은 꼬리, 또는 환자 파생 셀 라인33,34. 중요 한 것은, 파리 Nab2를 또한 부족 그들의 성인 버섯 시체34, 무슨 파리 FXS 증후군 유전자 FMR135부족에서 관찰은 유사한 심각한 두뇌 형태학 결함을 표시 합니다. 따라서, 파리는 정상적인 두뇌 개발 및 그것을 방해 하는 질병을 연구 하는 중요 한 모델 생물으로 사용할 수 있습니다.
마지막으로, 동작, 사용 가능한 유전 도구의 광대 한 배열을 함께 모니터링 높은 처리량 메서드의 액세스 가능성 확인 초파리 모델 유기 체와 같은 복잡 한 동작을 제어 하는 뇌 영역을 식별에 대 한 선택의 학습 및 메모리, 수 면, 구애, 갈증, 그리고 다른36,,3738,39. 비행 유전학의 "도구 상자"의 센터에 있는 1 개의 특히 유용한 도구가입니다 GAL4/UAS 체계 (그림 2). 이 시스템40,41 유전자 또는 transgenes 다운스트림의 상류 활성화 순서 (UAS)의 식을 높이기 위해 조직 특정 표현의 Gal4 transcriptional 활성 제를 사용 합니다. 이 시스템의 수정 허용, 예를 들어 정확 하 게 제어할 특정 뉴런42,43, overexpress 또는 노크 다운 관심44, 의 특정 유전자의 흥분 연구원 45, 실시간 칼슘 역학 vivo에서46, 분석 하 고 신경 계보41를 리포터 유전자를 표현. 또한 Repressible 셀 마커 (MARCM) 시스템12,47와 모자이크 분석의 창조에 대 한 허용 mitotic 재결합 GAL4/UAS 시스템의 조합입니다. MARCM는 axonal 지도12,47에 필요한 세포 신호 구성 요소를 식별 하기 위해 단일 신경 추적에 광범위 하 게 사용 되었습니다. 이들과 다른 기술을 신 경계 기능에 필요한 세포질 기계 장치에 다양 한 중요 한 통찰력 제공, 비록 대부분 필요는 초파리 뇌 먼저 수 해 부; 두뇌의 주의 제거는 두뇌 지구 사이 정확한 두뇌 형태학 및 연결 패턴을 유지 해야 합니다. 다음 프로토콜 사용으로 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런예 신경 인구로 안내 하는 절 개 하 고 immunofluorescent 성인 얼룩 초파리 두뇌.

<table><tbody><tr><td>미세 해부 겸자 / 핀셋</td><td>Ted Pella</td><td>505-NM</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 접시</td><td>생활 시스템 기기</td><td>DD-50-S-BLK</td><td>amazon.com</td></tr><tr><td>Fas2 항체</td><td>발달 연구 Hybridoma Bank</td><td>1D4</td><td></td></tr><tr><td>Chaoptin 항체</td><td>발달 연구 Hybridoma Bank</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP 항체</td><td>Aves 연구실</td><td>GFP-1010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 염소 안티 마우스 2차 항체</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 염소 안티 닭 2차 항체</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 염소 안티 마우스 2차 항체</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>20% 파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 서비스</td><td>RT15713</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 슬라이드</td><td>ThermoFisher</td><td>99-910-01</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립</td><td>ThermoFisher</td><td>12-553-454</td><td></td></tr><tr><td>Na 인산염 완충액 일염기</td>성 <td>시그마</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Na 인산염 완충액 이염기성</td><td>시그마</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ml</td><td></td></tr><tr><td>손톱 광택</td><td>전자 현미경 서비스(EMS)</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Leica S6D with KL300 LED 광원</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9-well 접시(스폿 플레이트)</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>너트/로커</td><td>Fisher</td><td>22-363-152 또는 88-861-041</td><td></td></tr><tr><td>35mm 접시</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td></td></tr><tr><td>실가드</td><td>피셔</td><td>50-366-794</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>피셔</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Potential Fixation Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTN Buffer</td><td></td><td></td><td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, 일반적으로 0.1M NaPhosphate 완충액 0.5L를 구성하고 필요에 따라 한 번에 50ml를 분취</td></tr>합니다 <tr><td>PLP 완충액</td><td></td><td></td><td>2% 파라포름알데히드, 0.01M NaI04, 0.075M 라이신, 0.037M NaPO4, pH 7.2, 10ml H2O + 7.5ml 0.1M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5ml 0.1M Na2HPO4에 0.36g 라이신을 얼음에 용해합니다. 사용 직전에, 이 완충된 라이신 용액 15ml를 50mg NaIO4(소듐 오디에이트) + 2ml 20% 고급 파라포름알데히드(EMS) + 3ml H2O</td></tr><tr><td>PEM 버퍼</td><td></td><td></td><td>0.1M 파이프 pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, 이 버퍼는 편리하게 2x 재고로 만들고 8% 파라포름알데히드(PFA)로 희석하여 4% PFA</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td>의 최종 농도를 제공할 수 있습니다><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Fly Bloomington</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elav (c155)-GAL4</td><td></td><td>BL458</td><td>Pan-neuronal GAL4 driver</td></tr><tr><td>w*;;; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 854</td><td>모든 버섯체 뉴런용 GAL4 드라이버 (OK107-GAL4 삽입은 4번째 염색체에 있음)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td><td></td><td>BL 7362</td><td>GAL4 드라이버(2번째 염색체)</td></tr>y<tr><td>(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64305</td><td>알파 및 베타 엽용 GAL4 드라이버, UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*; 201Y-GAL4</td><td></td><td>BL 4440</td><td>주로 버섯 몸체의 감마 엽 (제 2 염색체)</td></tr> <tr><td>y (1), w (67c23)의 감마 엽을위한 GAL4 드라이버;버섯 몸체 감마 엽 용 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64296</td><td>GAL4 드라이버, UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w *, elav (c155) -GAL4, hsFLP도 포함; FRTG13, Tub>Gal80/CyO</td><td></td><td>BL 5145</td><td>MARCM 스톡, 2번째 염색체</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL5146</td> MARCM 스톡에 FRT 부위 및 GAL80 포함, X 염색체 y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP<td>에 hsFLP, 범신경 GAL4 및 CD8-GFP 포함</td></tr><tr><td>;; FRT82B, 터브>갈80/TM3, Sb(1); OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44408</td><td>MARCM 3번째 염색체</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP를 뒤집기 위한 재고; FRT40A, 욕조>갈80; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL44406</td> 2번째 염색체 w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A<td>를 뒤집기 위한 MARCM 스톡</td></tr><tr><td>; UAS-CD8-GFP/사이오;; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44407</td><td>MARCM X 염색</td></tr>체 <tr><td>y(1), w*를 뒤집기 위한 재고; UAS-CD8-GFP/CyO</td><td></td><td>BL 5137</td><td>GFP 라벨링 세포 표면(CD8은 막관통 단백질)</td></tr><tr><td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 5139</td> MARCM 스톡은 2번째 염색체 y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP<td>에 FRT 부위와 CD8-GFP를 포함합니다</td></tr><tr><td>. Pin(1)/CyO</td><td></td><td>BL 28832</td><td>MARCM 스톡, X 염색체 w*에 hsFLP 및 CD8-GFP 포함</td></tr><tr><td>; FRTG13, Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5140</td><td>MARCM 스톡, 2번째 염색체 y(1), w*;에 FRT 부위 및 GAL80 포함</td></tr><tr><td> FRT82B, Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5135</td><td>MARCM 스톡, 3번째 염색체에 FRT 부위 및 GAL80 포함</td></tr></tbody></table>

해 부 및 immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

신 시스템 개발 순차적 일련을의 여러 신호 경로 규제 네트워크 조정 되는 이벤트를 포함 한다. 이 경로에 관련 된 단백질의 많은 포유류와 과일 파리 초파리 melanogaster, 유사한 조직 원리의 개발 하는 동안 존재 제안 등 다른 진핵생물 사이 보존 봤을 유기 체입니다. 중요 한 것은, Drosophila 성체, 차별화, axonal 지침 및 synaptogenesis을 포함 한 포유류에 필요한 프로세스를 규제 하는 세포질이 고 분자 메커니즘을 식별 하기 위해 광범위 하 게 사용 되었습니다. 파리 또한 인간의 neurodevelopmental 질병의 다양 한 모델을 성공적으로 사용 되어 왔습니다. 여기 우리는 단계별 기정, 고정, 및 성인 초파리 뇌 내 단백질의 immunofluorescent 지역화에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜 두 예제 신경 인구 버섯 몸 신경, 망막 대뇌에 집중 하 고 개별 버섯 몸 신경 Repressible 셀 마커 (MARCM) 기법으로 모자이크 분석을 사용 하 여 추적을 선택적 단계를 포함. 야생-타입 및 돌연변이 두뇌에서 예제 데이터 axonal 지도 결함에 대 한 채 점 기준의 간략 한 설명과 함께 표시 됩니다. 이 프로토콜 하이라이트 두 잘 설립 항 체 버섯 몸 및 포토 리셉터 뉴런, 다른 초파리 뇌 영역 및 다른 뇌 영역 내에서 단백질의 지 방화의 형태를 조사 하는 동안 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 조사.

이 프로토콜 설명 해 부와 성인 초파리 melanogaster 의 immunostaining 뇌 조직. 특히,이 프로토콜은 신경 개발의 많은 측면을 기본 일반적인 원리를 밝히기 위해 정확 하 게 사용할 수 있는 예제 신경 하위 집합으로 초파리 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 사용을 강조 표시 합니다.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

본 Drosophila 뇌 해부 프로토콜의 전반적인 목표는 면역형광법, GFP 표지 단백질 국소화 및 ex-vivo 배양 실험과 같은 광범위한 응용 분야에 사용할 수 있도록 성체 초파리로부터 손상되지 않은 뇌를 얻는 것입니다. 이 방법은 특정 단백질과 신호 전달 경로의 역할, 뇌 발달 과정 중 신경 연결 패턴의 확립과 같이 발생 생물학 및 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 숙달되면 성체 뇌의 특정 영역에서 형태학적 결함을 면역학적으로 식별할 수 있는 신속하고 효과적인 방법을 제공한다는 점입니다.초파리 머리에서 외골격을 제거하는 작업에는 상당한 주의와 연습이 필요하므로, 이 절차를 익히는 것이 어려울 수 있습니다. 동작은 천천히 신중하게 이루어져야 하며, 손떨림을 방지하기 위해 해부 도구의 팔 부분을 잘 지지해야 합니다. 실제 실험을 위해 관심 있는 유전자형을 해부하기 전에, 적안 초파리와 백안 초파리를 대상으로 충분히 연습하는 것이 좋습니다.해부를 준비하기 위해, 마취된 대상 초파리를 차가운 금속 패드 위나 얼음 위에 놓인 페트리 접시에 둡니다. 또는 이산화탄소를 배출하는 초파리 패드를 사용할 수도 있습니다. 그다음, 해부 접시 중앙에 소량의 PTN을 떨어뜨려 PTN 방울을 만듭니다.그 다음, 실체 현미경 하에서 균일한 조명을 사용하여 시야를 PTN 버블로 채웁니다. 이제 초파리의 배가 위로 향하도록 조작한 후, 복부를 이용해 한 마리씩 PTN 내부로 옮깁니다. 개체를 PTN에 완전히 잠기게 하고, 모든 해부 과정을 PTN에 잠긴 상태에서 수행합니다.두 번째 핀셋으로 주둥이를 잡고 머리를 몸체에서 당겨 분리합니다. 때로는 주둥이만 제거되고 머리는 몸체에 붙어 있는 경우가 있습니다. 이럴 때는 망막 한쪽의 내측 가장자리를 잡고 외측으로 힘을 가해 머리를 제거하십시오.복부와 흉부를 제거합니다. 이 단계에서는 머리 부분을 PTN 내에 유지하는 것이 매우 중요합니다. 중앙 뇌에서 VNC로 이어지는 연결 부위는 이 방법으로는 분석할 수 없습니다.다음으로, 큐티클 중앙 구멍의 가장자리에서 왼쪽 망막의 내측 가장자리를 잡고, 흰색의 실 같은 기관으로 덮인 불투명한 구조물인 시엽이 찢어지지 않도록 핀셋을 서로 반대 방향으로 천천히 벌려 당깁니다. 망막이 분리되면서 장력이 약간 감소하게 됩니다. 뇌가 찢어지는 것을 방지하려면, 각 눈의 내측 가장자리를 잡고 핀셋을 매우 천천히 벌리는 것이 매우 중요합니다.너무 빠르게 움직이면 뇌 형태가 변하거나 뇌 조직이 손상될 수 있습니다. 여기에서 보는 바와 같이, 각 핀셋으로 큐티클을 잡고 매우 천천히 반대 방향으로 당기십시오. 올바르게 수행했다면 큐티클이 뇌 조직에서 분리되어 뇌가 온전하게 남아야 합니다.이 단계에서는 매우 날카로운 핀셋이 필요합니다. 다음으로, 주변의 큐티클을 조심스럽게 조금씩 제거합니다. 잘 떨어지지 않는 큐티클을 제거할 때는, 뇌가 짓눌리는 것을 방지하기 위해 남아 있는 VNC를 잡아 뇌를 고정하는 것이 도움이 될 수 있습니다.마지막으로, P200 파이펫을 사용하여 적출한 뇌를 고정 및 면역염색을 위해 PTN이 채워진 플레이트의 웰로 옮깁니다. 현미경 하에서 P200 파이펫을 사용하여 동일한 유전형의 적출된 뇌 10~15개를 PTN으로 희석한 4% paraformaldehyde가 채워진 0.5 milliliter 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음, 실온에서 천천히 흔들어주며 뇌를 20분 동안 배양합니다.고정 후 뇌 조직이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 기다린 다음, 고정액을 제거합니다. 이어서 PTN 500 microliters를 사용하여 빠르게 2회 세척합니다. 뇌 조직이 튜브에 가라앉는 즉시 PTN을 교체하십시오.다음으로, 상온에서 부드럽게 교반하며 PTN으로 세 번 길게 세척합니다. 세척 후, 뇌 조직은 4°C의 PTN에 넣어 하룻밤 동안 보관할 수 있습니다. 마지막 PTN 세척액을 제거한 후, 0.5 mL의 블로킹 용액에 뇌 조직을 넣고 상온에서 부드럽게 교반하며 최소 30분 동안 인큐베이션합니다.블로킹 용액을 제거한 후, 블로킹 용액에 희석한 1차 항체를 첨가하고 4°C에서 완만하게 교반하며 2일 동안 뇌 조직을 배양합니다. 5회 세척 PTN 세척 절차를 사용하여 1차 항체를 제거합니다. 그런 다음, 2차 항체를 처리합니다.이 항체들을 조직과 함께 실온에서 빛을 차단한 상태로 3시간 동안 쉐이킹하며 배양하십시오. 뇌 조직을 2차 항체 용액에서 배양한 후, PTN 세척 과정을 수행하십시오. 각 세척 단계 후에 샘플을 호일로 덮고, 마지막으로 버퍼를 최대한 제거하여 마무리하십시오.다음으로, 75 µL의 형광 방지 마운팅 용액(anti-fade mounting medium)을 첨가하고, 피펫 팁을 통해 뇌 조직과 용액이 한 번만 드나들도록 흐르게 합니다. 튜브를 은박지로 감싸 4 °C에서 며칠 동안 보관할 수 있으나, 가급적 즉시 마운팅을 진행하는 것이 좋습니다. 뇌 조직을 마운팅하기 위해 브리지 슬라이드를 제작합니다.양전하 처리된 슬라이드 위에 두 개의 베이스 커버슬립을 약 1cm 간격으로 배치합니다. 이때 양전하 처리된 면이 위를 향하도록 확인하십시오. 그다음 매니큐어를 사용하여 커버슬립을 슬라이드에 고정하고, 다음 단계로 넘어가기 전에 매니큐어를 완전히 건조시킵니다.다음으로, 슬라이드를 실체 현미경 아래에 두고 커버글라스 사이의 공간에 뇌와 배지를 피펫으로 분주합니다. 이때 뇌가 더 잘 보일 수 있도록 조명을 조절하십시오. 그다음, 뇌가 빨려 들어가지 않도록 주의하며 슬라이드에서 과도한 마운팅 배지를 흡입하여 제거합니다.그 후, 남은 과잉 봉입제를 흡수시켜 제거합니다. 이렇게 하면 뇌의 위치를 더 정확하게 잡을 수 있습니다. 이제 핀셋을 사용하여 뇌의 촉각엽(antennal lobes)이 위를 향하도록 격자 패턴으로 배열합니다.그 다음, 뇌 조직 위에 커버슬립을 덮고, 매니큐어를 사용하여 상단 커버슬립과 하단 커버슬립이 맞닿는 가장자리 부분을 밀봉합니다. 이제 중앙 공동에 새로운 마운팅 용액을 한 방울씩 떨어뜨려, 모세관 현상에 의해 용액이 커버슬립 아래로 스며들게 합니다. 공동이 가득 차면 투명 매니큐어를 사용하여 완전히 밀봉합니다.설명된 방법은 버섯체(mushroom bodies)를 포함하여 성체 뇌 내의 거의 모든 구조를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 뇌의 이 영역은 학습과 기억에 필수적입니다. 버섯체는 fasciculin 2 단백질을 인식하는 항체를 사용하여 쉽게 시각화할 수 있습니다.이 단백질은 알파 및 베타 엽과 중앙에 위치한 타원체에 높게 발현됩니다. 이 기술을 통해 버섯체 뉴런의 적절한 축삭 유도에 필요한 여러 세포 프로세스를 식별할 수 있었습니다. 이러한 프로세스가 손상되면 뇌 정중선 영역을 가로지르는 부적절한 축삭 투사나 알파 엽의 소실과 같은 다양한 돌연변이 표현형이 나타납니다.이러한 돌연변이 표현형은 흔히 불완전 침투율을 보이므로, 여러 개의 뇌를 조사해야 합니다. 단백질이 축삭 경로 탐색에서 수행하는 자율적인 역할을 조사하기 위해, 비형광 야생형 배경에서 GFP 양성 돌연변이 또는 야생형 뉴런 개별 세포의 축삭 유도 결정을 시각화하는 Markham 기술을 사용할 수 있습니다. 본 방법은 성체 초파리 뇌의 거의 모든 영역을 신뢰성 있고 재현 가능하게 시각화할 수 있게 해줍니다.여기서는 버섯체 뉴런에 집중하였습니다. 이 프로토콜의 텍스트 버전에서는 시각엽의 시각화 과정 또한 시연하였습니다. 다른 연구들에서는 이와 유사한 기술을 사용하여 뇌간 중간부(pars intercerebralis), 시계 뉴런 및 촉각엽 투사 뉴런 등 다양한 부위를 시각화하였습니다.제대로 수행한다면, 숙련되었을 때 뇌 하나를 3분에서 5분 사이에 해부할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 현미경 근처에서 팔을 안정시키는 것이 중요합니다. 또한 천천히 움직이며 큐티클 조각을 한 번에 하나씩 제거하는 것이 중요합니다.너무 빠르게 이동하면 하부 뇌 조직에 원치 않는 손상을 줄 수 있습니다. 면역형광 기반 현미경 실험을 위해 분리된 뇌를 사용하는 것 외에도, 뇌 조직은 추가적인 실험에 활용될 수 있습니다.

dissection-immunofluorescent-staining-mushroom-body-photoreceptor

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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초파리 성인 뇌 해부: 파리 신경생물학의 방법

이 비디오는 돌연변이 초파리 뇌의 버섯체에서 표현형 결함을 시각화하기 위한 상세한 면역염색 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜은 버섯 몸체의 적절한 형태학적, 기능적 발달을 촉진하는 축삭 유도에 관여하는 단백질인 Fas2에 대한 항체를 사용하는 것입니다.

Immunostaining을 통한 초파리 뇌의 버섯체 뉴런 시각화

초파리의 성체 구조는 상상 원반이라고 하는 주머니와 같은 구조에서 파생됩니다. 이러한 디스크의 분석은 조직 결정, 구획 경계 설정, 세포 증식, 세포 운명 사양 및 평면 세포 극성을 포함한 많은 발달 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 광/형광 현미경 검사를 위해 가상 디스크를 준비하는 데 사용됩니다.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서 초파리

성인 초파리 뇌는 신경 회로, 높은 뇌 기능, 복잡한 질환 연구를위한 유용한 시스템이다. 효율적인 방법은 뇌 기반 연구를 용이하게 작은 비행 머리에서 전체 뇌 조직을 해부한다. 여기에 우리가 잘 보존 된 형태와 성인 두뇌의 간단한 한 단계 해부 프로토콜을 설명합니다.

간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜<em&gt; 초파리</em&gt; 두뇌

여기에서, 우리는 절단된 축색및 그들의 시냅스의 형태학적 그리고 기능적인 보존을 평가하기 위하여 Drosophila melanogaster에 있는 3개의 간단한 상해 유도한 축사 변성 (축세포 죽음) 분석사를 능력을 발휘하는 프로토콜을 제공합니다.

드로소필라 멜라노가스터에서 축사 사망 시축과 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가

이 프로토콜은 이미징을 위해 유충 및 성체 초파리 시신경엽을 준비하는 세 가지 단계인 1) 뇌 절개, 2) 면역조직화학, 3) 장착을 설명합니다. 3단계에 중점을 두었는데, 이는 특정 시신경엽 구조를 시각화하기 위해 뚜렷한 장착 방향이 필요하기 때문입니다.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization(시신경엽 시각화를 위한 유충 및 성체 초파리 뇌의 해부, 면역조직화학 및 마운팅)

이 연구는 참수, 고정, 동결 절제, 형광 염색, 면역 염색 및 이미징을 포함하는 조직 처리를 위한 단순화된 프로토콜을 제시하며, 이는 공초점 및 다광자 이미징으로 확장될 수 있습니다. 이 방법은 복잡한 해부에 필적하는 효능을 유지하며 고급 운동 기술의 필요성을 우회합니다. 정량적 이미지 분석은 광범위한 조사 잠재력을 제공합니다.

향상된 뇌 형광 염색 및 면역 염색을 위한 초파리 머리의 직접 동결 절편

배우세요 성충 Drosophila melanogaster 뇌 해부 및 면역형광 염색법으로 신경 발달 연구를 수행하는 방법입니다. 이 기술은 버섯몸 및 광수용체 신경 세포의 형태학적 결함을 신속하게 식별할 수 있습니다.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

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