Orthotopic 폐 암 세포 Engraftment의 효율성 증가 사전 조건 Bleomycin와 쥐의 기도

이 절차의 전반적인 목표는 종양 유발 폐암 세포를 마우스의 기도에 이식하는 효율성을 높이는 것입니다. 이 방법은 약물 내성의 원인 및 섬유증과 폐암 간의 관계를 포함하여 암 생물학의 주요 질문에 답하기 위해 새로운 전임상 모델을 확립하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 종양 시작 세포의 이식 효율을 다양한 마우스 균주의 폐로 증가시킨다는 것입니다.

이 기술의 의미는 치료로 확장되는데, 이는 치료에 대한 다양한 임상 반응을 보이는 것으로 알려진 더 다양한 인간 폐암 아형을 모델링할 수 있기 때문입니다. 이 프로토콜의 경우 먼저 마우스에 블레오마이신을 주입해야 합니다. 그런 다음 14일 후에 종양 세포를 주입합니다.

두 주사 절차는 매우 유사하며 여기에 설명되어 있습니다. 주사 2시간 전에 블레오마이신 스톡을 얼음에서 해동하고 작업 농도로 희석합니다. 얼음 위에 보관하십시오.

세포 bolus의 경우, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 현탁액을 준비합니다. 각 마우스의 시술 시간은 모두 합쳐 약 10분입니다. 발가락 꼬집기를 사용하여 적절한 마취를 확인하고 수의사 연고를 눈에 도포하십시오.

이때 마우스의 털이 짙은 경우 배쪽과 등쪽 갈비뼈 부분 전체를 면도하여 올바르게 이미지화할 수 있도록 합니다. 그런 다음 마우스를 플랫폼에 등을 대고 앞니로 고정하여 삽관 플랫폼에 마우스를 놓습니다. 세포 덩어리를 주입해야 하는 경우, 부드러운 분쇄로 지금 다시 현탁시킵니다.

이제 가슴 위쪽 부위를 밝히고 입을 벌린 다음 편평한 집게를 사용하여 혀를 부드럽게 당겨 냅니다. 바늘을 제거하여 기관을 위한 IV 카테터를 준비한 다음 기관 입구 위에 놓습니다. 그런 다음 카테터 상단이 앞니 근처에 올 때까지 카테터를 기관에 삽입하고 카테터 내부를 비춰 위치를 확인합니다.

그런 다음 50마이크로리터의 갓 만든 블레오마이신 또는 세포 현탁액을 카테터에 직접 분배합니다. 전체 볼륨이 카테터를 따라 이동할 때까지 몇 초간 기다립니다. 그런 다음 카테터를 제거하고 10% 표백제에 처분합니다.

마우스가 액체를 흡입하지 않는 경우 호흡을 주의 깊게 모니터링하고 카테터 위치를 조정하십시오. 마우스가 호흡을 멈추면 즉시 카테터를 제거하고 카테터를 다시 삽입하기 전에 마우스가 숨을 쉴 수 있도록 하십시오. 카테터를 제거한 후 5개의 처리된 마우스가 여전히 마취되어 이미지를 만들 준비가 되도록 절차를 계속 수행합니다.

복구를 위해 마우스를 복구 케이지의 IACUC 승인 가열 패드에 누운 상태로 놓고 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다. 세포를 주입한 후 2-3분 후에 인슐린 바늘을 사용하여 100마이크로리터의 루시페린을 안와를 역방향으로 주입합니다. 모든 이미징 세션마다 주사에 사용되는 눈을 번갈아 가며 사용합니다.

2분 정도 기다린 후 최대 5마리의 쥐를 동물 생물 발광 이미저에 흉골 누운 자세로 배치하고 발광 설정을 사용하여 등쪽 사진을 획득합니다. 제어판에서 해상도 및 감도 설정을 조정하여 세포의 발광을 측정합니다. 대부분의 응용 프로그램에서는 3분으로 시작하고, 범주화를 중간으로 설정하고, f/stop을 1로 설정하고, 시야를 d로 설정하고, 피사체 높이를 1.5로 설정합니다.

주사가 성공적이면 한쪽 폐 또는 양쪽 폐의 가슴 위쪽 부위에서 신호가 감지됩니다. 세포가 기관 입구에 밀집되어 있으면 주입이 실패한 것입니다. 등쪽 이미지를 촬영한 후 마우스를 뒤집어 복부 이미지를 획득하고 필요에 따라 설정을 조정합니다.

이미징 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 수술 후 관리를 진행합니다. 그런 다음 생착 3일 후 및 그 후 매주 이 이미징 프로토콜을 반복합니다. 이미지를 분석하려면 생물 발광 분석 소프트웨어를 사용하십시오.

먼저 시리즈에서 적절한 모든 이미지를 로드합니다. 이 섹션은 하나의 소프트웨어 패키지에 자세히 설명되어 있습니다. 다음으로, 시리즈의 첫 번째 이미지에서 각 마우스에 대해 관심 있는 정사각형 영역을 만들고 전체 폐 영역을 포함하는 가슴 위쪽 영역에 배치합니다.

그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 모든 관심 영역 복사 기능에 액세스하고 이 도구를 사용하여 그룹의 각 이미지에 동일한 관심 영역을 적용합니다. 그런 다음 각 이미지 내에서 각 마우스의 가슴 위쪽을 덮도록 사각형의 위치를 조정합니다. 복부와 등쪽 보기 모두에 대해 이 작업을 수행합니다.

이제 이미지 창의 왼쪽 상단 모서리에서 photons 함수를 선택합니다. 그런 다음 측정 옵션을 선택합니다. 그런 다음 관심 영역의 데이터가 출력 테이블에 총 플럭스로 표시됩니다.

필요에 따라 이 데이터를 분석합니다. 면역이 손상되었을 때, 흉선이 없는 마우스는 블레오마이신으로 치료되었습니다. cell-bolus 생착 이전에, 블레오마이신(bleomycin)을 투여한 마우스에서는 14일째까지 일시적인 섬유화가 관찰되었으나, 비히클 처리된 마우스에서는 관찰되지 않았다.

다음으로, 확립된 인간 폐암 세포주인 H2030의 세포를 이 쥐의 폐로 기관내로 전달했습니다. 35일 후, 블레오마이신을 투여한 마우스는 폐 종양 부담이 높았습니다. 그러나 차량 처리 동물에서는 종양이 발견되지 않았습니다.

폐-종양 부담은 조직학을 사용하여 확인하였다. 비히클로 전처리된 폐는 종양 결절의 증거가 없었지만, 블레오마이신 전처리된 폐는 큰 종양 결절이 있었습니다. 전이성 H2030 BrM 3 세포주를 이식한 후 39일에서 57일까지 생물 발광이 너무 강하여 이미징을 할 수 없었기 때문에 생체 외 먼 장기에서 전이를 분석했습니다.

다양한 조직에서 작은 병변을 발견할 수 있으며, 이는 이 방법이 자연적으로 전파되는 질병을 연구하는 데 유망하다는 것을 시사합니다. 이 기술을 마스터하면 이미징 없이 5마리의 마우스로 구성된 케이지당 10분, 마우스의 이미징 시 케이지당 20분 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 카테터가 제대로 삽입되었는지 확인하고 동물의 호흡을 모니터링하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 약리학적 연구 또는 적출된 조직의 아미노아세트 화학과 같은 다른 방법을 수행하여 생착된 종양이 약물에 어떻게 반응하는지 또는 폐에 특이적인 종양 기질 상호 작용을 특성화하는 것과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 생리학적으로 관련된 환경에서 환자 유래 이종 이식편을 포함하여 다양한 마우스 균주 및 종양 모델에 적용할 수 있습니다. 블레오마이신으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 생물학적 위험 후드를 조작하고 적절한 폐기