Name: 성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 학습하세요 성인 피부 조직에서 ROCK 억제제를 활용해 1차 인간 각질형성세포를 분리하는 효율적인 방법을. 이 단순화된 프로토콜은 세포 생물학 및 재생의학 연구에 활용 가능합니다.

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이 작품은 국가 주요 연구 및 개발 프로그램의 중국 (2017YFA0104604), 국가 자연 과학 재단의 중국 (NSFC, 81772093)의 일반 프로그램에 의해 지원 되었다 과학 및 기술 개발 프로그램의 소 주 (ZXL2015128) 자연 과학 재단의 장쑤 성 (BK20161241), 고 산동 태 산 학술 상 (tshw201502065).

이 프로토콜에서 사용 하는 인간의 조직 기관의 인간 연구 윤리 위원회의 지침에 따라 처리 된 (NO.2015120401, 날짜: 2015 년 5 월 12 일).
1입니다. 준비
<ol><li>얼음 처럼 차가운 Dulbecco의 10 mL 50 mL 튜브에 병원에서 성형 수술에서 삭제 수집 신선한 성인 복 부 피부 조직이 글 중간 (DMEM)으로. 표본은 세포 생존 능력에 크게 영향을 주지 않고 최대 72 h 4 ° C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>아래에 설명 된 시 약 및 문화 매체를 준비 합니다.<ol>
<li>인산 염 버퍼 솔루션 (PBS) 세척 솔루션 준비의 50 mL에 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 mg/L) 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>두 효소 소화 솔루션의 준비: (1) dispase (2.5 mg/mL에서 DMEM) 50 mL를 준비 하 고 50 mL의 유형 I 콜라 (2.5 mg/mL에서 DMEM) 별도로 기존의 방법; (2) 50 mL dispase의 혼합물을 준비 하 고 나에 게 콜라를 입력 (디졸브 125 mg dispase 가루와 125 밀리 그램의 유형 I 콜라 분말 DMEM의 50 ml에서) 새로운 방법에 대 한. 참고: 모든 효소 솔루션 해야 0.22 μ m 스 트레이너와 필터링 하 고 유지 at4 ° c.</li>
		<li>소화 솔루션을 준비 하는 두 가지 방법에 대 한: 0.05 %trypsin 및 0.25 %trypsin 상업적으로 구입 했다. 10 mg/mL DNase 준비 나 DNase PBS의 5 mL에 분말의 50 밀리 그램을 용 해 하 여 솔루션 0.22 μ m 스 트레이너와 필터링 하 고-20 ° c.에 그것을 저장</li>
		<li>효소 소화를 무력화 하는 매체의 500 mL를 준비: DMEM 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 보완.</li>
		<li>500 mL 접종 매체 (성장 요소가 포함 된 매체, G-매체 라는)의 준비: DMEM/F12 (3:1) 매체 1% 페니실린/스, 40 µ g/mL fungizone, 40 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자 2 (FGF2) 20 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF)를 포함 하 고 2 %B27 보충입니다.</li>
		<li>100 m m 세포 배양을 pretreat 나 실 온에서 30 분 동안 콜라겐의 형식을 포함 하는 코팅 매트릭스 2 mL와 함께 요리.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 종래의 방법
<ol><li>
피부 조직 전처리
	<ol>
<li>피부 조직의 1.5 c m2 를가 고 그것을 씻어 10 mL의 PBS; 1 x 다음, 30 대 70% 에탄올 10 mL로 씻어 s 그것을 품 어 및 세척 솔루션 (PBS 2% 페니실린과 스 포함), 5 분의 10 mL와 함께 2 배. 참고: 모든 세척 100 mm 셀 문화 요리 층 흐름 후드 내부에서 수행 됩니다.</li>
		<li>조직 100 mm 셀 문화 접시에 있는 피하 지방 층을 제거 하 고, 다음, 피부 조직 (무게는이 프로토콜에 1 g)를 무게를 멸 균가 위로 잘라. 참고: 충분 한 트리밍은 진 피에서 표 피의 효율적인 분리에 대 한 매우 중요 합니다. 노란 지방 층 구분할 수 있습니다 쉽게 시각적으로.</li>
		<li>아래 진 피 쪽으로 또 다른 100 m m 메 마른 요리 조직을 전송 하 고, 다음, 피부 조직을 메스 블레이드를 사용 하 여 3-4 m m-와이드 스트립으로 잘라. 참고: 지방 층과 진 피 쪽 쉽게 시각적으로 인식 된다.</li>
		<li>100 m m 문화 접시에 피부 조직에 2.5 mg/mL dispase 솔루션의 10 mL를 추가 하 고, 다음, 4 ° C (더 이상 20 h)에서 하룻밤 접시를 품 어. 참고: dispase 솔루션의 금액의 조직의 각 그램의 소화에 대 한 dispase 솔루션의 10 mL를 사용 하 여 계산할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
피부 조직에서 표 피의 분리
	<ol>
<li>둘째 날에는 정밀한 족집게를 사용 하 여 진 피에서 표 피를 벗기십시오. 참고: 표 피를 벗기다 어려운 경우 dispase 소화 충분 하지 않았다, 일반적으로 조직의 부족 한 잘라내기 때문입니다. 이 경우에 조직 이상 보육 시간이 필요합니다.</li>
		<li>메스;를 사용 하 여 조직 슬러리에 세포 배양 매체의 500 µ L로 벗 겨 표 피를 말하다 그런 다음, 50 mL 튜브에 0.25 %trypsin 10 mL와 함께 그것을 resuspend 하 고 그것에 알 떨고와 37 ° C에서 물 욕조에 20 분을 품고.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수집 및 기본 세포의 배양
	<ol>
<li>중화 솔루션 (10 mL이 프로토콜에서)의 동일한 볼륨을 추가 하 여 트립 신 활동을 무력화.</li>
		<li>10 mL 혈 청 학적인 피 펫으로 20 x 위아래로 솔루션 pipetting으로 표 피 세포를 해리 하 고 어떤 잔여 조직 파편을 제거 하는 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 셀 솔루션을 전달 합니다.</li>
		<li>여과; 후 5 분 동안 200 x g 에서 셀 솔루션을 원심 세척에 대 한 중립화 매체에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고, 다음, 셀 펠 렛을 얻기 위해 200 x g 에 다시 원심.</li>
		<li>낮은 칼슘, 혈 청 무료 keratinocyte 매체 (SFM) 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 총 셀 수를 계산 하 고, 약 2 x 106 셀 100 mm 셀 문화 요리 코팅 매트릭스와 청소용된으로 SFM의 10 mL 다음, 접시에이 솔루션의 10 µ L를가지고 (포함 하는 유형 I 교원 질). 참고: 코팅은 종래의 방법에 대 한 필요한 단계 이다.</li>
		<li>문화 매체 마다 2 d를 변경 합니다. 참고: 전과 문화 매체를 변경한 후 현미경으로 세포 접착을 확인 하십시오.</li>
		<li>그들은 약 80%에 도달할 때 셀 통로 합류. 참고: 모든 문화 요리는 청소용 코팅 매트릭스와 함께.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 새로운 방법
<ol><li>
피부 조직 전처리
	<ol>
<li>조직 설명 대로 위의 (2.1 단계) 종래의 방법에 대 한 수집 합니다.</li>
		<li>씻어 피부 조직 1 x 10 mL PBS의 그리고, 다음, (무게는이 프로토콜에 약 1 g) 전자 규모에 의해 살 균 플라스틱 용기에 무게. 참고: 조직의이 프로토콜에 필요한 최소 무게는 0.1 g, 때문에 사용 하는 조직 표본은 너무 작은 경우 셀의 충분 한 수를 얻기 어렵다. 궁극적으로 연산자의 처리 용량에 따라 달라 집니다이 프로토콜에 대 한 조직의 최대 무게가 있다.</li>
		<li>겸 자 30 대 70% 에탄올 10 mL와 피부 조직 린스를 사용 하 여 s.</li>
		<li>조직 2 품 어 세척 솔루션 (2.1.1 단계에서 준비), 5 분 동안 각 시간 10 mL x. 참고: 위에서 언급 된 모든 세척 단계 100 mm 셀 문화 요리 층 류 두건 (조직 문화 후드) 내부에서 수행 됩니다.</li>
		<li>다른 100 mm 셀 문화 살 균 접시 전송 조직.</li>
		<li>메스를 사용 하 여 말하다 조직을 철저 하 게 조직 슬러리에.</li>
		<li>젖은 조직 유지를 200 µ L의 PBS 마다 5 분을 추가 합니다. 참고: 단계 3.1.5-3.1.7 약 15 분 소요. 위의 단계를 모두 상 온에서 수행 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
피부 조직의 소화
	<ol>
<li>무 균된 조직 솔루션 50 mL 튜브로 전송 합니다. 피부 조직의 모든 1g에 대 한 효소 혼합물의 10 mL를 추가 합니다. 무 균 조직 효소를 철저 하 게 혼합.</li>
		<li>1 시간 동안 37 ° C에 물 목욕에 떨고와 혼합물을 품 어.</li>
		<li>37 ° c.에 물 목욕에서 또 다른 30 분 소화 혼합물에 0.25 %trypsin (2.5 mL이 프로토콜에서)의 1/5 볼륨 추가</li>
		<li>DNase를 추가 나 1: 100 (v/v) 비율로 (이 프로토콜에 250 µ L) 효소 혼합물에 솔루션 및 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수집 및 기본 세포의 배양
	<ol>
<li>1:1 비율로 중립화 매체의 12.5 mL을 추가 하 여 소화 프로세스를 중지 합니다. 약 20 배, 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 세포 분열을 위한 솔루션을 위쪽 및 아래쪽 플라스틱.</li>
		<li>조직 파편을 제거 하는 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 해리 셀을 필터링 합니다. 200 x g 5 분 관찰 튜브의 하단에 펠 릿에서 상쾌한 원심</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 200 x g 세포를 수집 5 분에 다시 중화 매체, 그리고 원심 분리기의 10 mL와 함께 셀 펠 릿을 세척.</li>
		<li>Y-27632의 10 µ M와 접종 매체 (G-중간 단계의 1.2.5) 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>총 셀 수를 계산 하 고, 다음, 대략 2 x 106 셀 100 mm 셀 문화 접시에 G 매체의 10 mL 접시 솔루션의 10 µ L를 가져가 라. 참고: precoating 단계는 새로운 방법에 대 한 필요 하 고 피부 층의 아무 제거도 필수.</li>
		<li>3 d, 후 접종 매체를 낮은 칼슘 SFM 매체 바꿉니다. 문화 매체 마다 2 d를 변경 합니다. 참고: 매체 변경 전후 세포 접착을 확인 하십시오.</li>
		<li>그들은 약 80%에 도달할 때 셀 통로 합류. 참고: 필요한 경우 0.05% trypsin 2 분에 대 한 셀을 pretreat 고 표 피 세포를 trypsinizing 전에 피부 세포를 오염 제거에 PBS 가진 세포를 씻어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 셀 뿌리고
<ol><li>제거 매체, PBS, 셀을 세척 하 고, 다음, (각 100 m m 접시) 당 0.05 %trypsin 2 개 mL를 추가.</li>
	<li>5 분 동안 인큐베이터 (5% CO2와 37 ° C)에서 세포를 품 어.</li>
	<li>모든 세포는 문화 접시에서 분리 된 ㄴ 다는 것을 확인 하는 현미경을 사용 하 여 셀을 확인 합니다.</li>
	<li>추가 10 %DMEM 8 mL FBS 효소 반응 중화 하 고, 다음, 15 mL 튜브에 세포를 수집을.</li>
	<li>셀 펠 렛을 얻기 위해 5 분 동안 200 x g 에서 원심.</li>
	<li>상쾌한을 천천히 제거, SFM 매체의 10 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend 그리고 셀의 수를 계산 합니다.</li>
	<li>각 100 mm 셀 접시에 SFM의 10 mL로 플레이트 1 x 106 셀.</li>
	<li>매체 마다 2 d를 변경 합니다.</li>
</ol>

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<li>Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+procurement+of+epithelial+stem+cells+from+human+tissue+specimens+using+a+Rho-associated+protein+kinase+inhibitor+Y-27632%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+Y-27632+increases+the+cloning+efficiency+of+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+by+improving+their+adherence+and+ROS-scavenging+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).</li>
<li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Rho-associated+protein+kinase+%28ROCK%29+inhibitor+to+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

상처를 치료 클리닉에서 3 년 이상에 대 한 교양된 기본 HKCs 널리 이용 되었습니다 그리고, 그때 이후로, 그것은 항상 중요 했다 효율적으로 적시에 임상 응용 프로그램에 대 한 셀의 충분 한 번호를 얻을. 따라서, 실제로 기존의 절연 메서드와, 진 피에서 표 피 분리, 어렵게 셀과 낮은 수 성인 셀 통로의 낮은 수율으로 인해 이러한 요구 사항을 충족 합니다. 여기, 우리는 우리가 효율적으로 연구소 및 임상 응용 프로그램에 더 적당 한 이전 보고서13,14에 따라 성인 조직에서 HKCs를 개발 하는 새로운 간단한 방법을 설명 합니다.
주의 새로운 방법에 대 한 최상의 결과 달성 하기 위해 다음 중요 한 단계에 지불 한다. 첫째, 균질 절차는 중요 한 단계; 부족 한 균질 효소 소화와 해리 셀의 낮은 수율에서 결과의 효율성 영향을 명확 하 게 것입니다. 둘째, 트립 신 소화 ...

목표 임상 응용 성인 조직에서 기본 인간의 keratinocytes (HKCs)을 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 개발 했다. 피부의 기저 층에 피부 표 피 줄기 세포 증식 및 분화 keratinocytes 피부1,2,3, 의 기능을 유지 하기 위해 제공 하는 높은 잠재력을가지고 4. HKCs 피부 조직 목적을 위해 피부 조직 공학 및 재생, 특히 손상 된 피부의 복구와 임상 응용 프로그램5,6에 대 한 유전자 치료에 널리 이용 된다에서 격리. HKC-기반 응용 프로그램에 대 한 중요 한 문제는 파악 하 고 확장 하는 높은 잠재적인 생체 외에서7,8HKCs의 큰 숫자입니다. 다양 한 연구 그룹 줄기 같은 HKCs의 문화를 생산 하는 방법을 개발 했습니다, 하지만 이러한 방법을 수행 하 고 낮은 셀 수율 등 피부 견본 형식에 의해 제한 되 고 다른 제한이 복잡 하 고 시간이 많이 소요 되기도 9를 사용합니다. 예를 들어, 피부 조직에서 HKCs을 전통적인 방법은 진 피6에서 표 피의 분리 2 단계 효소 소화를 포함 한다. 그 방법은 일반적으로 신생아 조직을 위해 잘 작동 하지만 성인 조직에서 세포를 분리 하는 데 사용 하는 경우 그것은 매우 어려워집니다.
Y-27632, 억제제로 관련 단백질 키 니 아 제 (바위)의 표 피 줄기 세포 격리와 식민지 성장10,,1112의 효율성을 크게 향상을 보고 되었습니다. 이전 연구에서 우리는 Y-27632 상피 세포의 클론 성장을 촉진 하지만 차동 접착 분자13의 식을 조절 하 여 피부 세포의 수확량 감소를 발견 했다. 우리는 또한 성장과 기본 표 피 세포의 수익률을 지 원하는 G-매체 라는 새로운 조건된 접종 매체 설립. G-매체 Y-27632와 결합 하 여이 새로운 메서드는 표 피-진 피 분리13,14단계 제거 효소 소화 후 저절로 피 및 피부 세포를 분리할 수 있습니다. 이전 보고서를 바탕으로, 우리는 지금 성인 피부 조직에서 HKCs을이 새로운 방법의 상세한 절차를 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Countess 자동 세포 계수기</td><td>Invitrogen Inc.&nbsp;</td><td>C10227</td><td>자동 세포 계수&nbsp;</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026333</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004380</td><td>세포 원심분리기</td></tr><tr><td>항온 셰이커</td><td>Shanghai Boxun</td><td>150036</td><td>수조용</td></tr><tr><td>전자 저울</td><td>Harbin Zhonghui</td><td>1171193</td><td>조직 계량용</td></tr><tr><td>세포 배양 접시</td><td>Eppendorf</td><td>30702115</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>50ml 원심분리기 튜브</td><td>KIRGEN</td><td>171003</td><td>세포 원심분리기용</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Corning은</td><td>431792</td><td>Cell filtration</td></tr><tr><td>Phosphate 완충 용액</td>을 통합했습니다. <td>Solarbio Life Science&nbsp;</td><td>P1020-500</td><td>세척 용액</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>C11995500</td><td>중화 배지 구성 요소</td></tr><tr><td>정의 K-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>10785-012</td><td>표피 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>항생제</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>생물학 산업</td><td>04-001-1AC5</td><td>중화 매체 구성 요소</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>25300-062</td><td>HKC 해리용</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin&nbsp;</td><td>베이징 솔라바이오 사이언스 & Technology</td><td>T1350-100</td><td>HKC 해리용</td></tr><tr><td>코팅 매트릭스 키트</td><td>Life Technologies</td><td>R-011-K</td><td>코팅 매트릭스</td></tr>용 <tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>HKC 절연</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 유형 I</td><td>Life Technologies</td><td>17100-017</td><td>HKC 절연용</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Sigma</td><td>9003-98-9</td><td>HKC 절연</td></tr><tr><td>F12용 영양소 믹스, Hams</td><td>Life Technologies</td><td>31765035</td><td>G-medium</td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Life Technologies</td>의 <td>구성 요소 17504044</td><td>G-medium</td></tr><tr><td>FGF-2의 성장 인자 Millipore</td><td>Merck Biosciences</td><td>341595</td><td>G-medium</td></tr><tr><td>Y-27632</td>의 성장 인자 <td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>ROCK 억제제</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td>G-medium</td></tr><tr><td>EGF Recombinant Human Protein</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td>Growth factor in G-medium</td></tr><tr><td>Cell Counting Kit-8</td><td>Thermo Scientific</td><td>NC9864731</td>세포 <td>증식 및 세포독성 분석</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human Cytokeratin5</td><td>Hewlett-Packard Development Company</td><td>MA-20142</td><td>HKC</td></tr><tr><td>의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색용토끼 항 인간 Loricrin</td><td>Covance</td><td>PRB-145p</td><td>HKC의 분화 마커를 확인하기위한 면역 형광 염색</td></tr><tr><td>용 마우스 항 인간 Vimentin</td><td>세포 신호 기술</td><td>3390</td><td>피부 섬유 아세포</td></tr><tr><td>Integrin &alpha의 면역 형광 염색; 6(GOH3)</td><td>산타크루즈&nbsp;</td>HKC의 <td>SC-19622</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>IgG2a FITC</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>SC-2831</td><td>&alpha의 음성 대조 항체; 6-인테그린&nbsp; 유세포 분석 분야&nbsp;</td></tr></tbody></table>

성인 피부 조직에서 기본 인간의 keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

기본 인간 keratinocytes 신선한 피부 조직 및 그들의 확장에서 에 체 외에서 고립 된 실험실 연구와 임상 응용 프로그램에 대 한 널리 사용 되었습니다. 인간의 keratinocytes의 기존의 격리 방법은 포함 한다 낮은 세포 회복 율 및 감소 셀 성인 조직에서 1 차 셀을 생성 효율적으로 입증 된 2 단계 순차 효소 소화 절차를 생존 능력입니다. 우리는 최근 매체에 노 키 니 아 제 억제 물 Y-27632를 활용 하 여 피부 조직에서 인간의 기본 상피 조상 세포 분리 고급 방법 보고. 전통적인 프로토콜에 비해,이 새로운 방법 간단 하 게, 쉽게, 그리고 보다 적게 시간이 걸리는, 그리고 상피 줄기 세포 수확량 증가 이며 그들의 줄기 세포 특성을 향상 시킵니다. 또한, 새로운 방법론, 진 피에서 표 피의 분리는 필요 하지 않습니다 이며, 따라서 여러 유형의 성인 조직에서 세포를 분리 하는 데 적합 한. 이 새로운 격리 방법 기존 방법의 주요 단점을 극복 하 고 높은 힘 실험실 및 임상 응용 프로그램에 대 한 많은 수 표 피 세포의 생산에 대 한 더 적합 합니다. 여기, 우리가 새로운 방법을 자세히 설명합니다.

새 메서드 (그림 1A)와 기존의 방법 (그림 1B)의 도식 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다. 기존의 방법은 2 일 절차는 2 단계 소화 합니다. 대조적으로, 새로운 방법은 작업에 약 3 시간 소요 단계 소화 합니다. 중요 한 것은, 한 단계 새로운 방법 접종 매체에 Y-27632의 존재에 달려 있는 동시에 두 개의 인구 (표 피 및 피부 세포)를 얻을 수 있습니다. 또한, 초기 문화 시간 같은 수의 셀 분리 후 주사 하는 경우 합류 약 80%에 도달 하는 표 피 세포의 최소 3 일 종래의 방법 보다는 더 적은 일반적으로 걸립니다.
새로운 방법 식민지 형태학에 성장 더 기본 표 피 세포를 생성 합니다....

여기 선물이 주 인간의 keratinocytes 성인 피부 조직에서 효율적으로 격리 하는 프로토콜. 이 메서드는 접종 매체에 자연스럽 게 피부 세포에서 상피 세포를 분리 하 록 억제 물 Y-27632를 사용 하 여 기존의 절차를 단순화 합니다.

성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

이 비디오의 일반적인 목표는 성인 피부 조직에서 1차 인간 표피 세포를 분리하고 배양하는 새롭고 간단한 방법을 소개하는 것입니다. 이 고급 방법은 실험실 및 임상 응용 분야 모두에서 많은 수의 잠재력이 높은 표피 세포를 생산하는 데 더 적합합니다. 무게를 측정하기 전에 PBS로 조직을 씻으십시오.전자 저울로 피부 조직의 무게를 잰다. 70% 에탄올로 피부 조직을 30초 동안 헹굽니다. PBS의 조직을 항생제로 두 번 배양할 때마다 5분씩 배양합니다.조직을 다른 멸균 접시로 옮기고 메스 날을 사용하여 철저히 균질화합니다. 조직을 적시지 않도록 5분마다 200마이크로리터의 PBS를 추가합니다. 균질화된 조직을 50ml 튜브로 옮깁니다.피부 조직 1g당 10ml의 효소 혼합물을 첨가하십시오. 효소를 균질화된 조직과 철저히 혼합합니다. 혼합물을 섭씨 37도의 수조에서 흔들어 배양합니다.그 후 0.25%트립신의 부피의 1/5을 추가합니다. 섭씨 37도의 수조에서 30분 동안 배양을 계속합니다. 혼합물에 Dnase I 용액을 1:100 비율로 첨가합니다.그런 다음 5분 더 배양합니다. 동일한 부피의 중화 배지를 추가하여 분해 과정을 중단합니다. 용액을 약 20회 동안 위아래로 피펫팅합니다.100마이크로미터 세포 여과기를 통해 해리된 세포를 여과하여 조직 파편을 제거합니다. 200g에서 5분간 원심분리기를 사용합니다. 튜브 바닥에 있는 펠릿을 관찰하십시오.상등액을 제거하고 세포 펠릿을 10ml의 중화 배지로 세척합니다. 그런 다음 200g에서 5분 동안 원심분리합니다. 접종 배지에 세포 펠릿을 10 micromolar ROCK inhibitor로 재현탁시킵니다.100mm 배양 접시에 10번째에서 6번째 세포를 두 번 플레이트합니다. 3일 후, 접종 배지를 무혈청 각질 세포 배지로 교체하십시오. 이틀에 한 번씩 매체를 교체하십시오.세포가 밀도의 약 80%에 도달하면 세포를 통과시킵니다. PBS로 세포를 씻으십시오. 필요한 경우 2분 동안 트립신화하고 PBS로 세포를 세척하여 오염된 진피 세포를 제거합니다.동일한 부피의 중화 매체를 첨가합니다. 200g에서 5분간 원심분리기를 사용합니다. 마지막으로 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다.인간 피부 조직에서 분리된 각질세포는 두 가지 방법으로 별도로 배양했습니다. 기존 방법은 2일 절차가 포함된 2단계 분해입니다. 대조적으로, 새로운 방법은 수행하는 데 약 3시간이 걸리는 1단계 소화입니다.3일차에는 새로운 방법으로 배양된 많은 세포 클러스터를 쉽게 찾을 수 있지만 기존 방법을 사용할 때는 이러한 현상이 발생하지 않습니다. 5일째 되는 날, 새로운 방법이 더 많은 양의 일차 세포를 생산하는 것이 관찰되었습니다. 배양된 각질세포의 분화 상태를 테스트하기 위해 기저 세포 마커 K5와 말단 분화 마커 Loricrin을 분석했습니다.전체 세포의 90%가 K5 양성이었지만 3번 통로에서 로리크린이 발현된 세포는 10% 미만이었으며, 이는 이들이 미분화 각질세포임을 나타냅니다. 우리는 격리 중 진피 세포의 오염을 조사하기 위해 진피 섬유아세포에서 발현되는 비멘틴의 발현을 확인했습니다. 초기 계대에서는 약 3%의 진피 세포가 나타났지만, 3차 계대에서는 약 0.02%의 진피 세포만 검출되었으며, 이는 계대 통과 후 표피 세포의 순도가 높았음을 나타냅니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

인간의 피부에서 가능한 성인 상피 줄기 세포를 분리의 신속하고 강력한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 모낭과 세포 배양에 대한 단세포 suspensions 또는 조직의 파편의 격리에 따버릴 다음 피부 콜라겐 매트릭스의 효소 소화를 활용합니다.

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

이 비디오는 효소 분해와 기계적 파괴 방법을 조합하여 인간 피부의 표피층에서 가장 두드러진 세포인 각질 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 선택적 성장 배지를 사용하여 다른 피부 세포 유형보다 각질 세포의 우선적 성장을 돕습니다.

인간 피부 각질 세포 분리: 피부 샘플에서 1차 각질 세포를 배양하는 방법

우리는 인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 능성 피부에서 파생 된 전구체 (SKP) 세포를 분리하는 방법을보고합니다. 우리는 섬유 아세포 문화에서 파생 된 이러한 SKPs은 인간의 피부 생검에서 직접 파생 된 것과 유사한 줄기 세포 특성을 공유하는 것을 보여줍니다. 이러한 세포는 OCT4와 나노 등 능성 마커뿐만 아니라 신경 능선 마커 스틴을 표현한다.

인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 성인 줄기 세포 분리

이 원고는 뽑은 모발에서 인간 각질세포를 유도 및 유지하고 우발적 벡터에 의한 통합이 없는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)를 후속 생성하기 위한 단계별 절차를 제공합니다.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

표피 각질 형성 세포 (epidermal keratinocytes)는 기능적인 피부 장벽을 형성하고 외부 환경 모욕에 대한 숙주 방어의 최전선에 위치하고 있습니다. 여기에서는 신생아 및 성인 마우스 피부에서 표피 각질 형성 세포를 분리하고 1 차 배양하고 각질 세포에서 최종 분화 및 UVB 유발 염증 반응을 유도하는 방법을 설명합니다.

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

인간의 피부는 외부 환경에 대 한 방어의 첫 번째 줄 역할을 합니다. 우리는 성인 피부에서 기본 인간의 keratinocytes를 격리 하기 위한 방법을 제시. 이러한 격리 keratinocytes 수많은 실험 설정에 유용 하 고 공부 하는 분자 메커니즘 피부 생물학에 생체 외에서. 에 대 한 매우 적합 한...

생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작

이 프로토콜의 목표는 분자 생물학, 생화학, 형광 활성화 세포 선별 및 1 차 체외 용도 (예를 들어, 클로노겐성)와 같은 다양한 다운스트림 응용 을 위해 성인 마우스의 등쪽 피부로부터 표피 각질 세포를 분리하는 것입니다. 각질 세포).

마우스 표피 각질 세포와 체외 클로노겐 문화의 격리

여기서 우리는 3D 서스펜션 문화에서 표피 스페로이드의 체계적인 재배를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 상피 조직 유형과 여러 인간의 질병 및 조건의 모델링에 사용하기위한 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.

각질 줄기 세포 가소성을 모델링하기 위해 높은 처리량 표피 스페로이드 배양 시스템 구축

본 프로토콜은 성인용 마우스 입맛에서 파생된 구강 각질 세포의 격리 및 배양을 설명합니다. 면역스테인링을 이용한 평가 방법도 보고된다.

성인 마우스 입천장에서 1 차 구강 각막 세포의 격리 및 문화

근골격계 손상과 관련된 상처 치유에 대한 연구는 종종 슈완 세포 (SC), 각질 세포 및 섬유 아세포 간의 시험관 내 상호 작용의 평가를 필요로합니다. 이 프로토콜은 인간 포피로부터 이들 일차 세포의 분리, 배양 및 특성화를 기술한다.

인간 포피로부터의 일차 슈완 세포, 각질세포 및 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

이 프로토콜은 살아있는 세포 이미징에 사용하기 위해 갓 채취한(계대 0) 각질세포의 배양을 간략하게 설명합니다.

Keratinocyte Live Cell Imaging을 위한 1차 배양 생성

학습하세요 성인 피부 조직에서 ROCK 억제제를 활용해 1차 인간 각질형성세포를 분리하는 효율적인 방법을. 이 단순화된 프로토콜은 세포 생물학 및 재생의학 연구에 활용 가능합니다.

성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

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