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- 각질세포(Keratinocyte)는 표피 또는 피부의 가장 바깥쪽 층에 존재하는 가장 두드러진 세포입니다. 그들은 진피 위에 여러 층으로 배열되어 있으며, 멜라닌 세포, 수지상 세포 및 메르켈 세포와 같은 다양한 다른 세포 유형과 관련이 있습니다.
각질세포를 분리하려면 먼저 인간 피부의 표피 조직을 채취합니다. 다음으로, 효소 분해 완충액으로 처리합니다. 완충액의 효소는 표피 조직에 존재하는 세포외 기질 단백질을 분해하여 세포 해리를 시작합니다. 이제 적절한 매체를 추가하고 조직을 기계적으로 파괴합니다.
해리된 세포를 현탁액으로 방출하려면 스트레이너를 통해 표피 세포 현탁액을 여과하여 세포 덩어리나 파편을 제거합니다. 표피 세포를 펠릿화하고 효소 함유 상등액에서 분리하기 위한 원심분리기. 상층액을 제거하고 바람직한 각질세포 성장 배지를 사용하여 세포를 재현탁합니다. 원하는 기간 동안 세포를 배양합니다.
배양 과정에서 최적화된 배지는 다른 표피 세포 유형에 비해 선택적 성장을 촉진하여 각질세포의 확장을 풍부하게 합니다. 다음 프로토콜에서는 성인 인간 피부 조직에서 각질 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.
- 성형 수술을 받는 건강한 성인 지원자로부터 10cm x 15cm 크기의 피부 샘플을 수집합니다. 냉각 요소가 들어있는 스티로폼 상자에 피부 샘플을 넣어 피부를 시원하게 유지하십시오. 필요한 경우 피부 샘플을 섭씨 4도에서 밤새 보관하십시오. 멸균된 가위, 메스, 집게를 사용하여 피부 아래 지방을 제거합니다.
그런 다음 바늘을 사용하여 접시 위에 있는 멸균 덮개의 피부 부분을 버클로 채웁니다. 살균 된 마른 거즈 패드로 피부를 깨끗이 닦습니다. 그런 다음 멸균된 거즈 패드에 70% 에탄올을 바릅니다. 그런 다음 발 대패를 사용하여 피부 부분의 상부 표피층을 잘라 9cm의 페트리 접시에 옮깁니다.
그런 다음 미리 준비한 DPBS/트립신/포도당 용액 25ml를 페트리 접시에 즉시 첨가합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 DPBS/트립신/포도당 용액을 제거하고 RPMI-10 1640 1640 10ml와 2% FBS를 첨가하여 트립신을 비활성화합니다.
이제 두 개의 집게로 피부 부분의 표피와 피부 구획을 부드럽게 긁고 교반하여 표피 세포를 배지로 방출합니다. 금속 필터를 통해 표피 세포 현탁액을 여과하고 여과액을 50ml 튜브에 수집합니다. FBS와 와류 없이 10초 동안 10ml RPMI-1640이 들어 있는 50ml 튜브에 나머지 피부 절편을 추가합니다.
금속 필터를 통해 이 현탁액을 표피 세포 현탁액이 들어 있는 50ml 튜브로 여과합니다. 그런 다음 총 부피 50밀리리터에 DPBS를 추가합니다. 세포 현탁액을 450 x g의 실온에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 세포 펠릿의 크기에 따라 표피 세포 펠릿을 섭씨 37도 KSFM의 약 10 밀리리터에 재현탁시킵니다.
Trypan Blue 염색 방법을 사용하여 현미경으로 세포를 계수합니다. 그런 다음 각 75제곱센티미터 배양 플라스크에 섭씨 37도 KSFM 12밀리리터와 함께 8배 10을 여섯 번째 셀로 옮깁니다. 세포가 균일하게 분포되도록 배양 플라스크를 부드럽게 흔듭니다. 습도 37%와 CO 5%의 섭씨 5도 인큐베이터에서 각질 세포를 배양합니다2. 2일 후에 매체를 교체한 다음 일주일에 3번 교체하십시오.
