Name: Un protocolo para la inmunohistoquímica y la distribución in situ de ARN dentro del embrión temprano de Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 34 s
Description: Aprende inmunohistoquímica e hibridación in situ para localizar proteínas y ARN en embriones de Drosophila melanogaster. Este protocolo mejora la adherencia de muestras lipídicas a portaobjetos.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (# 31771377 / 31571273 / 31371256), el Programa de Científicos Distinguidos Extranjeros del Departamento Nacional de Educación (#MS2014SXSF038), el Fondo de Investigación de universidades centrales del Departamento Nacional de Educación (#GK201301001/201701005 / GERP-17-45), y XZ cuenta con el apoyo del Fondo de Tesis Doctoral Sobresaliente (#2019TS082 / 2019TS079), Programa Clave del Departamento de Educación Provincial de Shaanxi (#20JS138), el Proyecto Juvenil del Programa de Investigación Básica en Ciencias Naturales del Departamento Provincial de Ciencia y Tecnología de Shaanxi (#2020JQ-885).

1. Preparación de platos de agar de jugo de uva
<ol><li>Añadir 5 g de agar y 5 g de sacarosa a 150 ml de agua destilada. Hervirlo con un microondas hasta que el agar y la sacarosa se disuelvan por completo. Mezcle 50 ml de jugo de uva 100% y la solución juntos.</li>
	<li>Añadir 1 ml de ácido propiónico al 100% para hacer la concentración final al 0,5% de ácido propiónico. Vierta 25 ml de la solución preparada en cada plato. Después de que el agar se haya solidificado, guarde el medio a 4 °C.</li>
</ol>2. Revestimiento de diapositivas
<ol><li>Pretratar diapositivas con detergente. Lave los toboganes 3 veces con agua del grifo y una vez con agua destilada. Luego secan los portaobjetos en un horno de 45 °C durante 2 h.</li>
	<li>Sumerja los portaobjetos en aproximadamente 450 ml de solución de ácido sulfúrico de dicromato de potasio (20 g de dicromato de potasio, 40 ml de agua destilada y 400 ml de ácido sulfúrico concentrado) durante 24 horas. Lave los toboganes 3 veces con agua del grifo y una vez con agua destilada.<ol>
<li>Seque los toboganes en un horno de 45 °C durante dos horas. Sumergir en etanol al 95% durante más de 2 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 0,5 g de sulfato de cromo potasio y 5 g de gelatina a 1 L de agua destilada. Disolver en un baño de agua a 60 °C antes de su uso. La gelatina de alumbre cromado se puede almacenar a 4 °C durante largos períodos.</li>
	<li>Deje caer 10 μL de gelatina de alumbre cromado en la diapositiva y cubra completa y uniformemente toda la superficie de la diapositiva con la solución. Coloque el portaobjetos con el lado de gelatina hacia arriba en un horno a 42 °C durante 48 h. Las diapositivas preparadas se pueden almacenar a 4 °C para su uso posterior. NOTA: Este es un paso crítico. El recubrimiento completo es necesario. Para la mosca de la fruta y su embrión, este enfoque de recubrimiento deslizante parece más eficiente que el recubrimiento de polilisina.</li>
</ol>3. Incrustación de embriones de Drosophila
<ol><li>
Colección de embriones de Drosophila NOTA: Recolectamos embriones de Drosophila en cuatro períodos de 0-2 horas (blastodermo sincitial), 2-3 horas (blastodermo celular), 3-12 horas (gastrula temprana) y 12-24 horas (gastrula tardía)18. La proporción de los principales tipos de embriones en cada período se muestra en la Tabla 1.<ol>
<li>Coloque 400-500 moscas en una botella de recolección de plástico y cubra la botella con el plato de agar de jugo de uva que contiene extracto de levadura. Los embriones de Drosophila se colocan en el agar de jugo de uva a temperatura ambiente.</li>
		<li>Recolectar cuatro períodos de embriones, agregando suavemente 2 mL de PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) a cada placa para flotar los embriones. Transfiera alrededor de 200 embriones a un tubo de centrífuga de 50 ml y manténgalo en hielo durante 2 minutos para asentar los embriones.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pre-incrustación<ol>
<li>Transfiera 200 embriones de Drosophila a un tubo centrífugo de 1,5 ml. Mantenga el tubo en hielo durante 2 minutos para asentar los embriones y luego deseche el sobrenadante con pipeta con cuidado. Añadir 1 ml de lejía al 50% en el tubo y agitarlo suavemente durante 2 min. NOTA: El blanqueador debe prepararse fresco, y la cantidad de lejía puede variar dependiendo de la cantidad de embriones recolectados.</li>
		<li>Recolecte suavemente los embriones vertiéndolos en papel de filtro y lávelos 3 veces con 1 ml de PBS en cada momento.</li>
		<li>Transfiera los embriones con papel de filtro a aproximadamente 5 ml de n-heptano.</li>
		<li>Transfiera la mezcla a un tubo de centrífuga fresco de 1,5 ml. Agregue 1 ml de metanol y agítelo suavemente. Recolectar embriones después de la sedimentación.</li>
		<li>Retire el sobrenadante y lave los embriones en 1 ml de PBS 3-5 veces.</li>
		<li>Fijar los embriones con 400 μL de solución de Bouin (71% de ácido pícrico saturado, 24% de formalina, 5% de ácido acético) durante 30 min. Lave los embriones fijos 3 veces en 1 ml de PBS durante 5 minutos cada vez.</li>
		<li>Para agregar embriones, transfiera las muestras a un tapón de goma y retire el PBS.</li>
		<li>Preparar la solución de agarosa-PBS al 1,2% y mantener la solución a 60 °C. Agregue 200 μL de solución de agarosa-PBS al 1,2% sobre los embriones para fijarlos en un bloque de agar.</li>
		<li>Saque el bloque del tapón y guárdelo en PBS. NOTA: Durante el enfoque previo a la incrustación, el pro-calentamiento es fundamental para tener éxito. Sugerimos encarecidamente que los tubos de la centrífuga y las puntas de la micropipeta, que se utilizarán en este paso, deben calentarse completamente antes de operar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incrustación de parafina<ol>
<li>Sumerja el bloque de agar preincrustado en etanol al 35%, etanol al 50%, etanol al 75% y etanol al 85% durante 15 minutos cada uno. Luego sumerja 2 veces en etanol al 95% y etanol al 100%. NOTAS: Aproximadamente 5-10x de volumen de bloque de cada uno seguido de un fijador graduado durante 15-30 minutos es necesario dependiendo del número de embriones en el bloque.</li>
		<li>Sumergir el bloque de embriones en solución 100% etanol y xileno (proporción 1:1) durante 15 min.</li>
		<li>Transfiera el bloque al xileno durante 1 minuto para que el tejido embrionario sea transparente.</li>
		<li>Sumerja el bloque en xileno y parafina (proporción 1:1) durante 30 min.</li>
		<li>Sumerja el bloque en parafina I, parafina II y parafina III durante 2 h cada vez.</li>
		<li>Llene la caja de incrustación con parafina de antemano y luego transfiera suave y horizontalmente el bloque a la parte inferior de la caja de incrustación. Después de que la parafina se solidifique naturalmente, el bloque de parafina solidificada se puede almacenar a 4 ° C. NOTAS: La muestra preincrustada se puede utilizar en la crioseccion siguiendo los siguientes pasos. Después de que los embriones están preincrustados con agarosa como se describió anteriormente, las muestras simplemente se incrustan en el compuesto OCT. Posteriormente, la criosección se puede llevar a cabo de acuerdo con el protocolo de criosección de rutina. Posteriormente, se pueden utilizar enfoques de tinción regulares en las secciones.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Tinción de hematoxilina-eosina
<ol><li>Preparar secciones embrionarias de Drosophila . Coloque las secciones preparadas en un horno a 60 ° C durante 15 minutos y luego sumerja las secciones en xileno 2 veces durante 10 minutos cada una. Sumergir las secciones una vez en etanol al 100% y xileno (proporción 1:1) durante 2 min.</li>
	<li>Hidratar las secciones en 100% etanol I, 100% etanol II, 95% etanol, 85% etanol, 75% etanol, 50% etanol, y en agua destilada durante 3 min.</li>
	<li>Manche las secciones con solución de hematoxilina durante 2 min. Sumerja los portaobjetos en una solución de alcohol ácido al 1% (1 ml de ácido clorhídrico, 100 ml de etanol al 70%) rápidamente y lave los portaobjetos en agua destilada.</li>
	<li>Sumerja las diapositivas en etanol al 50%, etanol al 75%, etanol al 85% y etanol al 95% secuencialmente.</li>
	<li>Manche las secciones con solución de eosina durante 1 min.</li>
	<li>Deshidrate los portaobjetos en 95% etanol I, 95% etanol II, 95% etanol III, 100% etanol I, 100% etanol II y 100% etanol III durante 1 min cada vez.</li>
	<li>Despeje las diapositivas en 100% xileno I, 100% xileno II y 100% xileno III durante 5 minutos cada vez.</li>
	<li>Monte las diapositivas con bálsamo neutro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
</ol>5. Tinción periódica de metenamina ácido-plata
<ol><li>Desparafinar e hidratar las secciones de parafina del embrión de Drosophila en agua destilada.</li>
	<li>Oxidar las secciones en ácido periódico al 1% durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Enjuague los toboganes en agua destilada 3 veces durante 1 minuto cada uno.</li>
	<li>Incubar los portaobjetos en aproximadamente 40 ml de solución de trabajo de metenamina de plata recién filtrada (3% de metenamina, 5% de nitrato de plata, solución de borato de sodio al 5%) durante 1 h y 20 minutos a 60 °C. Luego enjuague los toboganes en agua destilada durante 1 min.</li>
	<li>Tonifica las diapositivas en cloruro de oro al 0,2% durante 2 min y luego enjuaga las diapositivas en agua destilada durante 1 min.</li>
	<li>Coloque los portaobjetos en tiosulfato de sodio al 3% durante 3 minutos y luego enjuague los portaobjetos en agua destilada durante 1 minuto.</li>
	<li>Contramanten las diapositivas en hematoxilina durante 30 s. Lave los toboganes en agua corriente del grifo durante 3-5 minutos.</li>
	<li>Deshidrate los portaobjetos en etanol al 70%, etanol al 80%, 95% etanol I, 95% etanol II, 95% etanol III, 100% etanol I y 100% etanol II durante 5 minutos cada uno.</li>
	<li>Despeje las diapositivas en 100% xileno I, 100% xileno II y 100% xileno III durante 5 minutos cada uno.</li>
	<li>Monte las diapositivas en bálsamo neutro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
</ol>6. Inmunohistoquímica
<ol><li>Desparafinar y rehidratar secciones de parafina del embrión de Drosophila a PBS siguiendo el protocolo estándar19.</li>
	<li>Trate los portaobjetos con 0,3% de H2O2 en metanol durante 10 min a temperatura ambiente y evite la luz.</li>
	<li>Precaliente el tampón de recuperación de antígenos apropiado a aproximadamente 100 °C en un recipiente con los portaobjetos en el vaporizador de verduras. El recipiente también debe tener una tapa. Coloque las diapositivas en el contenedor. Cierre la tapa del vaporizador.<ol>
<li>Mantenga el recipiente en el vaporizador durante 20 minutos desde este punto. Tenga en cuenta que la tapa del recipiente deslizante no debe apretarse por completo para que el vapor de agua pueda entrar durante el proceso de vaporización.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permita que las diapositivas vuelvan a temperatura ambiente antes de enjuagarlas suavemente en PBS-T (PBS con Tween-20, pH 7.2) 3 veces durante 5 minutos cada una, y luego enjuague las diapositivas en PBS 3 veces durante 1 minuto cada una.</li>
	<li>Bloquee los portaobjetos con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en PBS durante 60 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar los portaobjetos con anticuerpo primario (anti-FKBP12 a 1:1000) durante la noche a 4 °C o a temperatura ambiente durante 4 h.</li>
	<li>Lave las diapositivas en PBS-T 4 veces durante 5 minutos cada una.</li>
	<li>Aplique las diapositivas con polímero marcado con HRP conjugado con anticuerpos secundarios (anti-Conejo, 1:5.000) durante 90 min a temperatura ambiente. Haga esto en la oscuridad para evitar el blanqueamiento fotográfico.</li>
	<li>Lave las diapositivas en PBS-T 3 veces durante 5 minutos cada una.</li>
	<li>Incubar los portaobjetos con 5% 3,3'-diaminobenzidina-tetraclorhidrato (DAB) durante 2-10 min hasta que el color de los productos de reacción sea apropiado bajo microscopio.</li>
	<li>Contramante los portaobjetos en hematoxilina durante 30 s y lave los portaobjetos en agua destilada 2 veces durante 5 minutos cada uno.</li>
	<li>Deshidrate los portaobjetos en etanol al 50%, etanol al 70%, etanol al 90%, etanol al 95% y etanol al 100% durante 1 minuto cada uno.</li>
	<li>Despeje las diapositivas en 100% xileno I, 100% xileno II y 100% xileno III durante 5 minutos cada uno.</li>
	<li>Monte las diapositivas en bálsamo neutro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
</ol>7. Hibridación in situ 
NOTA: Las secciones embrionarias de Drosophila se prepararon con agua tratada con 0,01% de dietil pirocarbonato (DEPC). Todos los accesorios utilizados para la hibridación in situ aplican de DEPC durante la noche con antelación.
<ol><li>Preparación de ribosonda<ol>
<li>Linearice el ADN de la plantilla cortando en un sitio de enzima de restricción aguas abajo del inserto clonado utilizando una enzima de restricción que crea voladizos de 5 '. Después de la linealización, purifique el ADN de la plantilla mediante extracción de fenol / cloroformo y posterior precipitación de etanol. Utilice protocolos estándar.</li>
		<li>Agregue 1 μg de ADN de plantilla purificado a un tubo de centrífuga sin RNasa. Coloque el tubo de la centrífuga sobre hielo. Agregue suficiente agua tratada con DEPC al volumen total de 13 μL.<ol>
<li>Luego agregue los siguientes reactivos en orden: 2 μL de 10x mezcla de etiquetado NTP, 2 μL de tampón de transcripción 10x, 1 μL de inhibidor protector de RNasa, 2 μL de ARN polimerasa SP6 o ARN polimerasa T7.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mezclar la reacción mediante pipeteo y centrifugación en breve. Incubar durante 2 h a 37 °C. NOTA: Las incubaciones más largas no aumentan el rendimiento del ARN marcado. Un giro corto (~ 800 rpm) aplicado en el tubo de reacción es crítico antes de continuar con el siguiente paso. Este giro permitirá que todo el contenido, que podría generarse a partir de la incubación, llegue al fondo del tubo.</li>
		<li>Añadir 2 μL de DNasa I sin RNasa para eliminar el ADN de la plantilla e incubar durante 15 min a 37 °C.</li>
		<li>Añadir 2 μL de 200 mM de EDTA (pH 8.0) para detener la reacción. NOTA: Las sondas de ARN marcadas con DIG se pueden almacenar a -15 a -25 °C en etanol durante un año.</li>
	</ol></li>
	<li>Prehibridación de la sección embrionaria de Drosophila<ol>
<li>Coloque las secciones del embrión de Drosophila en un horno de 42 °C durante 48 h.</li>
		<li>Desparafinar los portaobjetos en 100% xileno durante 10 min dos veces.</li>
		<li>Hidratar los portaobjetos sumergiéndolos secuencialmente en etanol al 100%, etanol al 95%, etanol al 90%, etanol al 70% y etanol al 50% durante 5 min.</li>
		<li>Incubar los portaobjetos en PBS durante 5 min 3 veces para eliminar la solución fijadora/solución de Bouin del tejido.</li>
		<li>Lave los portaobjetos con 100 mmol/L de solución de glicina/PBS 2 veces durante 5 min cada uno.</li>
		<li>Lave las diapositivas con PBS 2 veces durante 5 minutos cada una.</li>
		<li>Incubar los portaobjetos con Tritón X-100 al 0,3% en PBS durante 15 min para permeabilizar las membranas.</li>
		<li>Lave las diapositivas con PBS 3 veces durante 5 minutos cada una.</li>
		<li>Incubar los portaobjetos en 15 μg/ml de proteinasa K libre de RNasa durante 30 minutos a 37 °C.</li>
		<li>Incubar los portaobjetos con paraformaldehído al 4% en PBS durante 3 min para detener la digestión.</li>
		<li>Lave las diapositivas con PBS 2 veces durante 5 minutos cada una.</li>
		<li>Incubar los portaobjetos en tampón de trietanolamina de 100 mM (pH 8.0) con anhídrido acético al 0.25% (v/v) 2 veces durante 5 min cada uno.</li>
		<li>Agregue agua DEPC en la cámara de humedad del portaobjetos. Añadir 20 μL de solución de prediridación (que contenga 100 μg/ml de ADN de espermatozoides de salmón) en los portaobjetos. Coloque las diapositivas en la cámara de humedad de la diapositiva. Incubar los portaobjetos a 42 °C durante 4 h. NOTA: Es necesario asegurar la estanqueidad de la tapa de la caja húmeda y que la caja húmeda se mantenga siempre en horizontal para evitar la volatilización y la desviación del tejido de la solución de prehibridación y la solución de hibridación seguida.</li>
	</ol></li>
	<li>Hibridación de la sección embrionaria de Drosophila<ol>
<li>Retire la solución de prediridación y lave las diapositivas con 0,2 veces SSC (cloruro de sodio de 150 mM, citrato de sodio de 15 mM, pH 7,0) 3 veces durante 5 min cada una. Limpie el exceso de 0.2x SSC alrededor de las muestras de tejido.</li>
		<li>Aplique 30 μL de solución de hibridación de sonda (que contiene 2-6 ng de sonda de ARN marcada con digoxina diluyéndola en solución de prediridación) con una pipeta. Incubar los portaobjetos en la cámara de humedad del portaobjetos a 42 °C durante aproximadamente 20 h. NOTA: Asegúrese de la estanqueidad de la tapa como sugerencia de la última nota. De lo contrario, el secado causado por la fuga de pre-hibridación o pre-hibridación generará fondo sucio incluyendo pseudo-positivo en diapositivas.</li>
	</ol></li>
	<li>Hibridación<ol>
<li>Retire la solución de hibridación y lave las diapositivas con 4x solución SSC 4 veces durante 15 min cada una a 37 °C.</li>
		<li>Lave los portaobjetos en 2x solución SSC con 20 μg/ml de RNasa A durante 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Lave los portaobjetos en 1 solución SSC durante 15 min a 37 °C.</li>
		<li>Lave las diapositivas en solución 0.5x SSC durante 15 min a 37 °C.</li>
		<li>Lave los portaobjetos en solución 0.1x SSC durante 15 min a 37 °C.</li>
		<li>Lave las diapositivas con PBS 3 veces durante 5 minutos cada una.</li>
		<li>Lave los portaobjetos en tampón de lavado (100 mM de ácido maleico, 150 mM de NaCl, 0,3% (v/v) de Tween 20, pH 7,5) durante 1 min.</li>
		<li>Incubar los portaobjetos en 100 ml de solución de bloqueo recién preparada (suero de oveja al 2% en tampón de ácido maleico sin Tween 20) durante 30 minutos.</li>
		<li>Incubar los portaobjetos en 20 ml de solución de anticuerpos durante 45 minutos.<ol>
<li>Centrifugar el anticuerpo durante 5 min a 10.000 rpm en el vial original antes de cada uso, y pipetear la cantidad necesaria cuidadosamente desde la superficie. Diluir anti-digoxigenina-AP 1:5000 (150 mU/mL) en solución de bloqueo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lave las diapositivas en 100 ml de tampón de lavado 2 veces durante 15 minutos cada una para eliminar el conjugado de anticuerpos no unidos.</li>
		<li>Equilibre las diapositivas en 20 mL de tampón de detección (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9.5) durante 2-5 min.</li>
		<li>Incube los portaobjetos con 10 ml de solución de sustrato de color recién preparada en la cámara de humedad del portaobjetos. La reacción comienza en unos pocos minutos y se completa después de 16 h. No agite ni mezcle mientras se desarrolla el color.</li>
		<li>Lave los portaobjetos con 50 ml de agua destilada durante 5 minutos para detener la reacción.</li>
		<li>Seque la muestra durante la noche en la oscuridad.</li>
		<li>Deshidrate los portaobjetos en etanol al 70%, 80% etanol, 90% etanol, 95% etanol, 100% etanol I y 100% etanol II durante 3 min cada uno.</li>
		<li>Despeje las diapositivas en 100% xileno I, 100% xileno II y 100% xileno III durante 20 minutos cada uno.</li>
		<li>Monte las diapositivas con bálsamo neutro.</li>
		<li>Documente las imágenes y analícelas con la microscopía invertida y el software del fabricante. Realizar análisis de distribución utilizando ImageJ según densidad de señal positiva ya sea a lo largo del eje longitudinal o dentro de la zona diferencial de embriones. NOTA: Durante la incubación con la solución de sustrato de color recién preparada en el paso 7.4.12, el color de reacción se puede ver incluso con un ojo desnudo. Esta observación sobre cómo se puede inspeccionar el desarrollo del color bajo estereoscopio. Una vez que el color de la reacción es razonable y se puede llevar a cabo el paso 7.4.13 para detener la reacción.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La señalización de calcio mediada por RyRs e IP3Rs es una vía fundamental en muchos procesos fisiológicos y patológicos de animales vertebrados e invertebrados1,2,3,4. En humanos, las mutaciones puntuales, como la mutación R4496C asociada a CPVT, en el gen RyR2 conducen a la fuga de calcio del retículo sarcoplásmico del cardiomiocito, lo que resulta en disfunción cardíaca. Estas mutaciones se p...

La señalización de liberación de calcio inducida por calcio (CICR) desempeña un papel fundamental en muchos procesos biológicos, como el músculo esquelético/liso y la función vascular cardíaca, la proliferación celular y la apoptosis, el desarrollo, el envejecimiento, la plasticidad sináptica neuronal y la regeneración1,2,3,4,5,6 . Los receptores de rianodina (RyR) y los receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) son actores importantes en la vía de señalización del calcio controlada por sus reguladores proteína quinasa A (PKA), proteína quinasa II dependiente de Ca2+ / calmodulina (CaMKII), proteínas de unión a FK506 (FKBP), calsequestrina (CSQ), triadina y junctina1,2,3,4,5,6 . La expresión humana anormal y las mutaciones en estas proteínas pueden conducir a fisiología patológica como arritmias7 y proliferación oncogénica8,9.
Los FKBP regulan la liberación de calcio del reticular endoplásmico (RE) por los RyRs. Este proceso es esencial para el mecanismo de contracción y, por lo tanto, responsable de todo el movimiento mecánico generado por la contracción de miosina-actina a través de la liberación de calcio inducida por calcio junto con los RyR embrionarios1,2. En modelos de ratón, la falta de RyR2 y su regulador FKBP12/Calstabina es invariablemente letal, ya sea durante el desarrollo embrionario o en el período postnatal temprano10,11,12. Los ratones knockout FKBP12/Calstabin exhiben defectos cardíacos críticos con acoplamiento irregular excitación-contracción (CE) y edema cerebral durante el desarrollo embrionario. Esto indica que FKBP12/Calstabina juega un papel esencial en la regulación de la expresión del canal RyR2, que es importante tanto para el desarrollo cardíaco como cerebral10.
Las chispas de calcio conducidas por RyR se descubrieron inicialmente en la fase de formación de cigotos de los huevos de Medaka fertilizados13,14. Sin embargo, se han realizado pocas investigaciones sobre la función de la señalización del calcio en el desarrollo embrionario temprano. En Drosophila melanogaster, los resultados obtenidos de los mutantes DmFKBP12 S107 proporcionan una fuerte evidencia que respalda la importancia de este gen para el desarrollo larvario y una vida saludable, lo que se atribuye a su función contra el estrés oxidativo15,16. Recientemente, identificamos la localización dinámica de la proteína FKBP12/Calstabina y el ARN mensajero durante el desarrollo temprano de Drosophila melanogaster17. Utilizando los enfoques descritos en esta metodología, pudimos rastrear la expresión de FKBP12/Calstabina en D. melanogaster durante el blastodermo sincitial (0-2 h), blastodermo celular (2-3 h), gastrula temprana (3-12 h) y gastrula tardía (12-24 h). En este artículo, presentamos los protocolos detallados de cada enfoque en el estudio anterior, incluida la incrustación preembrionaria para la sección clásica de parafina, el tratamiento con diapositivas de pre-recubrimiento para secciones embrionarias, la tinción histoquímica y la inmunotinción, y la hibridación in situ de ARNm para la identificación de la expresión génica.

<table><tbody><tr><td>-20 grados; C Refrigerador</td><td>Meiling Biology & Médico</td><td>DW-YL270</td><td>Utilizado para el almacenamiento regente-80</td></tr> <tr><td>y grados; C Refrigerador de temperatura ultra baja</td><td></td><td>Thermo Forma 90 Series</td><td>Utilizado para el almacenamiento de regente</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBB6360V</td><td>Preparación de placas de agar de jugo de uva</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentos</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>Para la detección de compuestos marcados con digoxigenina</td></tr><tr><td>Incubadora bioquímica</td><td>Shanghai Bluepard Instruments</td><td>LRH-250</td><td>Hibridación Hibridación</td></tr><tr><td>Solución de Bouin</td><td>Reactivo químico Sinopharm en Pekín</td><td>69945460</td> Centrífuga de <td>inclusión de embriones de Drosophila</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>540BH07808</td><td>In-situ Tubo</td></tr> de <tr><td>centrífuga</td> de hibridación <td>Denville</td><td>C-2170</td><td>Colección de embriones de Drosophila</td></tr><tr><td>Alumbre de cromo</td><td>Reactivo químico Sinopharm en Beijing</td><td>10001018</td><td>Recubrimiento Portaobjetos Baño de</td></tr><tr><td>agua a temperatura constante</td><td>Jintan Henfeng Instruments</td><td>KW-1000DC</td><td>Tinción de hematoxilina-eosina, inmunohistoquímica, hibridación in situ y tinción de ácido peryódico-plata metenamina</td></tr><tr><td>Dako REAL Sistema de detección EnVision</td><td>Dako</td><td>K5007</td><td>En la reacción inmunohistoquímica o en la reacción de hibridación in situ, se une al anticuerpo antígeno primario y el objetivo se marca mediante tinción.</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>Kit</td></tr><tr><td>de marcaje de ARN DIG de</td><td></td> hibridación in situ Roche <td></td><td>11093274910 Marcaje de ARN con diagoxigenina-UTP por transcripción in vitro con ARN polimerasa SP6 y T7</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664</td><td>Las existencias de Drosophila melanogaster mutante</td></tr><tr><td>Horno de secado rápido eléctrico</td><td>Tianjin Taiste Instruments</td><td>101-0AB</td><td>Para el recubrimiento de portaobjetos y la inclusión de parafina</td></tr><tr><td>Eosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230251</td><td>Tinción de hematoxilina-eosina</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Reactivo químico Sinopharm en Beijing</td><td>100092680</td><td>Inclusión de parafina, tinción de hematoxilina-eosina, inmunohistoquímica, hibridación in situ y tinción</td></tr> <tr><td>de ácido peryódico-plata metenaminaGelatina</td><td>Sinopharm Reactivo químico en Pekín</td><td>10010328</td><td>recubrimiento Portaobjetos</td></tr><tr><td>Cloruro de oro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379948</td><td>Ácido peryódico-plata Tinción de metenamina</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136</td><td>Tinción de hematoxilina-eosina Kit</td></tr><tr>de<td>purificación de productos PCR de alta pureza</td><td>Roche 11732668001</td><td></td><td>Para la purificación de productos</td></tr> <tr><td>PCRCaja inteligente de temperatura y humedad constantes</td><td>Ningbo Jiangnan Instruments</td><td>HWS</td><td>Para el mantenimiento de moscas</td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>HyAgarose</td><td>14190108029</td><td>Pre-incrustación</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sinopharm Reactivo Químico en Beijing</td><td>10014108 Microscopio</td> de <td>Recolección de Embriones de Drosophila</td></tr><tr><td></td><td>ZEISS</td><td>Observer.A1</td><td>Tinción de hematoxilina-eosina, inmunohistoquímica, hibridación in situ y tinción de ácido peryódico-plata metenamina</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio MeVid</td><td>Labware Fabricación</td><td>P105-2001</td><td>portaobjetos de recubrimiento</td></tr><tr><td>Goma neutra</td><td>Reactivo químico Sinopharm en Pekín</td><td>10004160</td><td>Tinción de hematoxilina-eosina</td></tr><tr><td>N-heptano</td><td>Reactivo químico Sinopharm en Pekín</td><td>40026768</td><td>Embrión de Drosophila Colección</td></tr><tr><td>Cortadora de parafina</td><td>Instrumento científico Huahai</td><td>HH-2508III</td><<td>em>In-situ Parafina de hibridación</td></tr><tr><td></td><td>Reactivo químico Sinopharm en Pekín</td><td>69019461</td> Medidor de pH / mV de <td>inclusión de parafina</td></tr><tr><td></td><td>Sartorius</td><td>PB-10</td><td>Para determinar el valor de pH de una solución</td></tr><tr><td>Nitrato de plata</td><td>Reactivo químico Sinopharm en Beijing</td><td>10018461</td><td>Tinción de ácido peryódico-plata metenamina</td></tr><tr><td>Medidor de agua ultrapura</td><td>Thermo</td><td>AFXI-0501-P</td><td>In-situ Hibridación</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Reactivo químico Sinopharm en la 10023418 de Beijing</td><td></td><td>Incrustación de parafina</td></tr></tbody></table>

un protocolo para la inmunohistoquímica y la distribución in situ de arn dentro del embrión temprano de drosophila

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

La señalización de liberación de calcio inducida por calcio (CICR) juega un papel crítico en muchos procesos biológicos. Todas las actividades celulares, desde la proliferación celular y la apoptosis, el desarrollo y el envejecimiento, hasta la plasticidad sináptica neuronal y la regeneración, se han asociado con los receptores de rianodina (RyR). A pesar de la importancia de la señalización del calcio, el mecanismo exacto de su función en el desarrollo temprano no está claro. Como organismo con un período gestacional corto, los embriones de Drosophila melanogaster son sujetos de estudio principales para investigar la distribución y localización de las proteínas asociadas a CICR y sus reguladores durante el desarrollo. Sin embargo, debido a sus embriones ricos en lípidos y corion rico en quitina, su utilidad está limitada por la dificultad de montar embriones en superficies de vidrio. En este trabajo, presentamos un protocolo práctico que mejora significativamente la unión del embrión de Drosophila en diapositivas y detallamos los métodos para una histoquímica, inmunohistoquímica e hibridación in situ exitosas. El método de recubrimiento deslizante de gelatina de alumbre de cromo y el método de preincrustación de embriones aumenta drásticamente el rendimiento en el estudio de la proteína embrionaria de Drosophila y la expresión de ARN. Para demostrar este enfoque, estudiamos DmFKBP12/Calstabina, un conocido regulador de RyR durante el desarrollo embrionario temprano de Drosophila melanogaster. Identificamos DmFKBP12 ya en la etapa de blastodermo sincitial e informamos el patrón de expresión dinámica de DmFKBP12 durante el desarrollo: inicialmente como una proteína distribuida uniformemente en el blastodermo sincitial, luego localizando preliminarmente en la capa basal de la corteza durante el blastodermo celular, antes de distribuirse en la arquitectura neuronal y de digestión primitiva durante la fase de la capa de tres gemas en la gastrulación temprana. Esta distribución puede explicar el papel crítico que desempeña RyR en los sistemas de órganos vitales que se originan en estas capas: el ganglio suboesofágico y supraesofágico, el sistema nervioso ventral y el sistema musculoesquelético.

Las figuras describen los protocolos utilizados para superar el desafío de unir embriones de Drosophila de corion con alto contenido de lípidos y quitina (Tabla 1) a la superficie del portaobjetos de vidrio para su examen y experimentación. Utilizando el método de recubrimiento deslizante de gelatina de alumbre de cromo que se muestra en la Figura 1, mejoramos la unión de embriones de Drosophila a la superficie de los portaobjetos, mientras que el método de...

Aquí, describimos un protocolo para la detección y localización de la proteína embrionaria de Drosophila y el ARN desde la recolección hasta la preincrustación e incrustación, la inmunotinción y la hibridación in situ de ARNm.

Un protocolo para la inmunohistoquímica y la distribución in situ de ARN dentro del embrión temprano de Drosophila

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Como organismo con un período gestacional corto, los embriones de Drosophila melanogaster son sujetos de estudio principales para investigar la distribución y localización de proteínas y sus reguladores durante el desarrollo. Sin embargo, debido a sus embriones ricos en lípidos y corion rico en quitina, su utilidad está limitada por la dificultad de montar embriones en superficies de vidrio. En este trabajo, presentamos un método práctico que mejora significativamente la unión del embrión de Drosophila en diapositivas y detallamos nuestros métodos para una histoquímica, inmunohistoquímica e hibridación in situ exitosas.Antes de los pasos que se muestran aquí, las diapositivas deben lavarse con detergente, luego enjuagarse con agua del grifo y agua destilada antes de colocarse en el horno para que se sequen. Los portaobjetos secos deben remojarse suavemente en dicromato de potasio durante 24 horas antes de enjuagarse y secarse nuevamente, luego colocarse en etanol al 95% durante al menos dos horas. Durante este paso, puede preparar más diapositivas o la gelatina de alumbre cromado de acuerdo con nuestros métodos.La gelatina se puede almacenar en agua de baño de 60 grados antes de su uso. Para cubrir las diapositivas, deje caer una pequeña cantidad de gelatina en un borde de la diapositiva. Luego use otra diapositiva de vidrio para arrastrar lenta y uniformemente la gelatina a través de la superficie de la diapositiva que se va a recubrir.Esto crea una capa delgada y uniforme. Antes de ser puesto en una rejilla o aparato de secado para ser almacenado en un horno para permitir un secado completo durante otra noche o 48 horas. Los embriones se recolectan utilizando un plato de agar de jugo de uva, una vez listo, el plato de agar de jugo de uva se puede quitar.Inunde la placa con PBS y cepille suavemente con un cepillo suave para eliminar los embriones adheridos. Retire el embrión que contiene PBS a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros y deje reposar sobre hielo. Una vez que el embrión se asiente en hielo, retire suavemente el PBS sobrenadante.Tenga cuidado de no molestar al embrión en la parte inferior del tubo. Añadir 1 ml de lejía al 50% a la muestra y agitar suavemente durante dos minutos. Retire la lejía por filtración y lave los embriones en PBS tres veces.Preparar n-heptano. Una vez listo, lave los embriones del papel de filtro en n-heptano agitando suavemente el papel de filtro en la solución. Permita que los embriones se asienten en la parte inferior de la placa de n-heptano y recoja este n-heptano en un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.Agregue un mililitro de metanol al tubo, permita que la solución precipite y luego aspire el metanol n-heptano. Lave el embrión en PBS de tres a cinco veces para eliminar el metanol residual. Retire este PBS adicional y agregue el fijador de Bouin y deje reposar durante 30 a 60 minutos para fijar los embriones.Retire el fijador de Bouin y lave los embriones nuevamente en PBS tres veces. Prepare 1.2% de agarosa en PBS y manténgalo caliente en un baño de agua de 60 grados y luego prepare los embriones para incrustarlos aspirando suavemente PBS adicional en el que se ha almacenado. Tenga cuidado de no molestar a los embriones en la parte inferior, y luego aspire el tapón embrionario en la parte inferior de la solución y colóquelo suavemente en un molde de tapa de botella.Aspire cualquier PBS adicional de este molde antes de agregar gel de agarosa al 1.2%. Prepare una solución de PBS para almacenar estos tapones de agarosa. Una vez que la agarosa se ha solidificado, los enchufes individuales se pueden mover a este PBS para su almacenamiento.Aquí estamos mostrando el proceso de deshidratación secuencial. Permitiendo 15 minutos para la incubación cada vez. Luego retire del etanol 100% y fije en una solución uno a uno de etanol y xileno durante otros 15 minutos.Una vez retirado de esta solución uno a uno, retire en xileno puro durante un minuto. Ahora la muestra de tejido está lista para ser movida a una solución de parafina de xileno uno a uno calentada. Deje reposar durante 30 minutos antes de la incrustación final en 100% parafina.Pasa al primero de 100% parafina y descansa durante dos horas. Repite este proceso en sus dos y tres parafinas. La muestra ahora está lista para ser trasladada a un molde y el molde lleno de cera para completar el proceso de incrustación.Incrustación de embriones de Drosophila. Coloque las secciones de parafina preparadas de los embriones de Drosophila en un horno de 60 grados durante 15 minutos. Colóquelos en una solución 100% de xileno.Luego comenzamos la rehidratación. Coloque las diapositivas en cada una de estas soluciones durante tres minutos cada una. Una vez que el portaobjetos esté en agua destilada, colóquelo en la solución de hematoxilina durante dos minutos.Una vez completado, asegúrese de drenar la mayor cantidad posible de la solución de la diapositiva. Una vez que el portaobjetos se haya lavado en agua destilada, manche el portaobjetos en eosin durante un minuto. Finalmente, retire el portaobjetos de la eosina y lave en agua destilada.Una vez que este tobogán está limpio, ahora comenzamos nuestro proceso final de deshidratación. Finalmente se coloca en 100% xileno durante cinco minutos. Este proceso se repite en dos nuevas soluciones de 100% xileno y deja caer una pequeña cantidad de goma neutra a lo largo de un borde del portaobjetos.Tome este deslizamiento de la cubierta y colóquelo suavemente en un borde de la diapositiva. Primero desparafina las diapositivas colocando 100% xileno. Una vez que los portaobjetos se retiran del agua destilada, deben cubrirse con una solución ácida periódica al 1%.Luego desechamos el exceso de solución y enjuagamos en agua destilada. Colocando la diapositiva directamente en una solución precalentada. Una vez que esto se haya completado, enjuagamos el portaobjetos en agua destilada y luego teñimos la solución con cloruro de oro al 0,2% durante uno o dos minutos.A continuación, fijamos el tejido con 3% de tio sulfato de sodio durante tres minutos utilizando agua destilada. Y luego contramantención con hematoxilina. Después de la contratinción, la mancha se puede lavar con cualquiera de los tubos de agua destilada como se muestra aquí.Luego pasamos al proceso de deshidratación. Siga esto colocando las diapositivas directamente en 100% xileno y luego aplique una pequeña cantidad de goma neutra en la esquina de la diapositiva. Cubra suavemente con un resbalón de cubierta.Comience a preparar las diapositivas como antes desparafinando y xileno. Y luego en etanol de xileno uno a uno. Una vez que los portaobjetos están desparafinados, comenzamos a rehidratar su tejido y finalmente en PBS.Coloque las diapositivas en peróxido de hidrógeno al 0,3% hecho en metanol durante 10 minutos. Luego, las diapositivas se cubren con 20 ml de solución de recuperación de destino. Las diapositivas se pueden colocar en la caja de tinción.Coloque la caja de tinción en un vaporizador, asegurándose de que no se escape ninguna solución y que las diapositivas aún estén completamente cubiertas. Tenga en cuenta que la tapa de la caja de manchas no debe cerrarse por completo para que el vapor de agua pueda escapar durante el proceso de vaporización. Y luego enjuague suavemente en PBS-T tres veces.Deseche el exceso de solución y repita el proceso, esta vez con PBS. A continuación, incubamos las diapositivas en un bloque de peróxido durante cinco a 10 minutos y luego enjuagamos varias veces nuevamente en PBS-T y luego en PBS. Prepare el anticuerpo y caiga directamente sobre el tejido.Estos tejidos se pueden incubar o a temperatura ambiente durante cuatro horas. El anticuerpo secundario debe incubarse a temperatura ambiente durante 90 minutos, que se tiñe con 5% DAB durante dos a 10 minutos. Después de obtener el color apropiado, enjuague en agua destilada y luego contramante en hematoxilina.Después de esta tinción de hematoxilina, los portaobjetos pueden deshidratarse secuencialmente. Coloque los toboganes en 100% xileno y deje en remojo durante tres minutos. Luego deje caer pequeñas cantidades de goma neutra en un borde del portaobjetos.Una vez que se haya colocado una goma de mascar, tome la cubierta del portaobjetos y colóquela suavemente desde un borde de la diapositiva. Agregue un microgramo de ADN de plantilla lineal purificado a un vial de reacción estéril sin RNasa. Luego agregue suficiente agua destilada doble tratada con DEPC estéril sin RNasa para hacer un volumen de muestra total de 13 microlitros.Luego centrifuga brevemente e incuba durante dos horas a 37 grados centígrados. Para los experimentos de protección de la RNasa, recomendamos incubar durante 15 minutos con dos microlitros de Dnase-1, sin RNasa para eliminar el ADN de la plantilla. Una vez que se complete la etapa de incubación, detenga la reacción agregando dos microlitros de EDTA molar 0.2 a pH de ocho.Antes de los pasos que se muestran aquí, las diapositivas fueron desparafinadas y rehidratadas, de acuerdo con nuestro protocolo previamente demostrado. Después de la rehidratación, incube los portaobjetos en 0.01 mole por litro de PBS a un pH de 7.4 durante cinco minutos cada uno para eliminar la solución fijadora del tejido. Después de enjuagar en PBS, a continuación, enjuagamos con 100 milimolares por litro de solución de glicina durante cinco minutos dos veces para eliminar los grupos aldehídos libres del tejido.Después de este paso, enjuague las diapositivas con PBS durante cinco minutos. A continuación, incube en PBS que contenga 0.3% tritón X-100 durante 15 minutos antes de enjuagar y luego incube nuevamente con un microgramo por microlitro de proteinasa K.A continuación, fije las diapositivas con 4% de paraformaldehído y PBS a un pH de 7.2 durante tres minutos. Luego, lave las diapositivas antes de incubar con un tampón de trietanolamina molar de 0.1 pH 8, que contenga anhídrido acético al 0.25%.Puede optar por inclinar la caja en esta etapa para garantizar una cobertura completa con la solución. La caja se prepara agregando 20% de glicerol o agua DEPC al fondo de una caja de hibridación seca. A continuación, cubra las diapositivas en 20 microlitros de solución de pre hibridación.ADN de esperma de salmón a una concentración de 100 microgramos por mililitro a cada diapositiva. Y luego incubar a 42 grados centígrados durante cuatro horas. Esto se hace en una caja humidificada preparada previamente para garantizar que la solución no se seque durante este proceso.En la etapa posterior a la hibridación, es muy importante que la solución de hibridación se enjuague completamente a partir de sus muestras. Esto se puede hacer en enjuagues consecutivos de 15 minutos a 37 grados, utilizando cuatro veces la concentración SSC, dos veces la concentración, una vez la concentración, 0,5 veces la concentración y 0,1 veces la concentración de la solución SSC. Cada uno incubando durante 15 minutos a 37 grados centígrados.Una vez hecho esto, lave con PBS tres veces durante cinco minutos cada una antes de agregar el tampón de lavado. El tampón de lavado debe enjuagarse durante un minuto antes de los siguientes pasos Asegúrese de que el tampón de lavado esté completamente seco de las diapositivas antes de agregar la siguiente solución. Agregue 100 mililitros de solución de bloqueo a cada diapositiva e incube la diapositiva durante 30 minutos.Esto se hace mejor en un ambiente libre de luz para garantizar una buena tinción. A continuación, incube los portaobjetos durante 30 minutos nuevamente en 20 ml de solución de anticuerpos. Aplique la solución de anticuerpos directamente sobre los portaobjetos para obtener una cobertura completa de su tejido.Una vez que se complete la incubación, aplique 100 mililitros de tampón de lavado. Incubar durante 15 minutos en condiciones libres de luz para eliminar los conjugados de anticuerpos no unidos. Retire el tampón de lavado.A continuación, aplique 20 mililitros de tampón de detección y deje incubar durante aproximadamente cuatro minutos. Después de cuatro minutos, retire el búfer de detección. Seque los portaobjetos para asegurar que no haya solución adicional y agregue 10 mililitros de solución de sustrato de color recién preparada.Esta reacción comienza en unos pocos minutos, pero se completa después de 16 horas. Así que deje incubar durante ese período de tiempo en una condición libre de luz. Una vez detectados los puntos deseados donde se detectan las bandas, lave la diapositiva con 50 mililitros de tampón TE para detener la reacción.Y luego complete nuestro proceso de deshidratación y el proceso de montaje previamente mostrados para la goma neutra. Las figuras uno y dos demuestran el método de recubrimiento de gelatina de aluminio cromado para secciones de parafina y el método de incrustación para el perfil de expresión de FKBP12 y DmFKBP12 en embriones de Drosophila en desarrollo. La figura tres muestra la distribución proteica del anticuerpo FKBP12 detectado en las etapas del blastodermo celular sincitial.A partir de estos resultados histoquímicos, se puede ver que la expresión de FKBP12 está menos polarizada en el blastodermo sincitial, luego comienza a localizarse dentro de la membrana basal debajo del epitelio del trofoectodermo informa el gradiente con más expresión que se encuentra en los polos anterior y posterior. La figura cuatro, que sigue las etapas de relación gaseosa temprana y tardía del embrión de Drosophila, muestra que la proteína FKBP12 se restringe a ciertos componentes arquitectónicos del tejido embrionario primitivo. Con menos distribución extracelular que la observada en estadios gastroembrionarios tempranos y tardíos.Curiosamente, la distribución dinámica de proteínas descrita anteriormente no se acompaña de los cambios correspondientes en los niveles de RESONANCIA magnética de FKBP12 como se ve en la figura cinco. Indicando que la expresión de proteínas es el resultado de un mecanismo molecular post transcripcional aún desconocido. La señalización de calcio mediada por el receptor de rianodina es una vía fundamental en muchos procesos fisiológicos y patológicos de animales vertebrados e invertebrados.Se sabe que las mutaciones en este gen causan muchas alteraciones fisiológicas que conducen a la enfermedad o la muerte cardíaca temprana. Sin embargo, el papel que desempeña este gen en el desarrollo temprano de Drosophila ha sido difícil de estudiar. Como componente de tránsito del embrión, el embrión rico en lípidos y el corion rico en quitina, dificultan los estudios de expresión proteica y embrionaria en el desarrollo temprano de Drosophila.El recubrimiento de diapositivas, la incrustación de embriones y las técnicas inmunohistoquímicas descritas en este artículo nos han permitido estudiar en detalle la distribución dinámica de la proteína receptora de rianodina y el ARNm. Compartimos estas técnicas y la esperanza de que permitan a otros estudiar otras proteínas durante las primeras etapas de desarrollo de Drosophila.

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