Name: 3차원 오가노이드 및 스페로이드 모델의 염색 및 고해상도 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 배우세요 3D 오가노이드 및 스페로이드의 고해상도 염색 및 이미징 프로토콜을 통해 세포 수준 분석을 수행하는 방법을. 전체 마운트 면역염색과 파라핀 매립 기법을 활용하여 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작업은 St Baldrick의 Robert J. Arceci Innovation Award #604303의 지원을 받았습니다.

<ol><li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1-13 (2019).</li>
<li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li>
<li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+multicellular+spheroids+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society%2C+Interface%22%5BJournal%5D)">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 14 (127), (2017).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li>
<li>Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pancreatic+ductal+organoids+and+whole-mount+immunostaining+of+intact+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 82(2019).</li>
<li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li>
<li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+and+assessment+of+human+primary+prostate+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Handling and assessment of human primary prostate organoid culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59051(2019).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li>
<li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+versus+confocal+microscopy%3A+in+quest+of+a+suitable+tool+to+assess+drug+and+nanomedicine+penetration+into+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy versus confocal microscopy: in quest of a suitable tool to assess drug and nanomedicine penetration into multicellular tumor spheroids.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 195-203 (2019).</li>
<li>Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, J. H., Beachley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+embedding%2Fsectioning+for+parallel+analysis+of+3D+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microarray embedding/sectioning for parallel analysis of 3D cell spheroids.</a> Scientific Reports. 9, 16287(2019).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

세포 배양은 조직 및 장기 발달, 기능, 재생 및 파괴, 질병과 관련된 기본적인 생물학적 메커니즘을 밝히는 데 없어서는 안될 도구입니다. 단층 2D 세포 배양이 우세했지만, 최근 연구는 특히 유전자 발현 및 세포 행동에 영향을 미치는 추가적인 공간 조직 및 세포-세포 접촉으로 인해 생체 내 세포 반응을 더 잘 반영하는 3D 구조를 생성하는 배양으로 전환되어 더 많은예측 데이터를 제공할 수 있습니다7. 그럼에도 불구하고 세포 및 세포 수준에서 복잡한 3D 구조의 상세한 현미경 시각화 및 평가를 위한 사용자 친화적인 염색 및 이미징 기술의 필요성을 포함하여 많은 과제가 남아 있습니다. 이러한 맥락에서 100μm에서 수 밀리미터 크기의 고정 시험관 내 3D 세포 배양 모델의 염색 및 세포 및 세포 내 분해능 이미징을 수행하기 위해 상세하고 강력하며 보완적인 프로토콜이 제공되었습니다.
이 절차는 다양한 크기와 유형의 체외 3D 세포 배양 모델을 처리하기 위한 두 가지 전략을 제시합니다. 하나(3D 전체 마운트 해석) 또는 다른 하나(2D 단면 해석) 중 하나는 사용된 모델과 조사된 문제에 따라 달라집니다. 컨포칼 현미경을 통한 3D 전체 마운트 분석을 통해 3D 구조의 전체 크기에 관계없이 최대 200μm의 깊이장을 가진 세포를 시각화할 수 있는 반면, 2D 절단은 모든 크기의 샘플에 적용할 수 있지만 시각화는 2D 차원으로 유지됩니다. 다음은 문제 해결 및 기술 고려 사항에 대한 몇 가지 제안 사항입니다.
작업 흐름 중 3D 구조의 손실은 가장 일반적인 단점입니다. 팁과 튜브에 접착력을 유지할 수 있기 때문에 팁과 튜브를 PBS-BSA 0.1% 용액으로 사전 코팅하는 것이 중요합니다. 또한 시약 변경 사이에 3D 구조물이 침전되도록 하고 모든 피펫팅을 매우 신중하게 수행하는 것이 중요합니다. 절차에서 언급했듯이 모든 단계에서 3D 구조 침강이 너무 길면 RT에서 5분 동안 50× g 으로 세포를 부드럽게 회전시킬 수 있습니다. 연구의 목적에 따라 원심분리가 3D 구조의 모양을 손상시킬 수 있으므로 이러한 방사 단계의 장점/단점을 고려해야 합니다. 또한, 낭포 성 유기체는 붕괴되는 경향이 있기 때문에 고정 단계에서 이러한 형태를 보존하는 데주의를 기울여야합니다. 크기가 400μm 미만인 구조물을 고정하면 구조적 변화를 방지해야 합니다.
최적의 면역표지를 위해서는 3D 매트릭스에서 오가노이드를 회수하는 것이 중요한 단계입니다. 3D 매트릭스는 매트릭스에 대한 비특이적 결합으로 인해 적절한 항체 침투를 방해하거나 높은 배경 염색을 유발할 수 있습니다. ECM 제거는 오가노이드의 외부 세그먼트의 형태를 변경하고 (특히 연구 된 3D 구조에서 확장되는 작은 세포 돌출부의 경우) 분석을 부분적으로 방해 할 수 있습니다. 이러한 3D 구조의 경우 매트릭스는 절차 전반에 걸쳐 유지 될 수 있습니다. 그러나, 배양 조건은 용액 및 항체의 불충분한 침투를 방지하고 과도한배경 소음을 감소시키기 위한 연속적인 세척 단계를 피하기 위해 최소량의 매트릭스에서 세포를 성장시키도록 신중하게 조정되어야 한다6,8.
3D 전체 마운트 염색 섹션의 이 프로토콜에 설명된 광학 투명화 단계는 투명하지 않은 50-80μm 대신 최대 150-200μm 깊이의 3D 구조 이미징에 적합합니다. 종종 몇 주가 필요하고 독성 제거제를 사용하는 다른 청산 방법론과 비교하여 이전에 발표된 빠르고 안전한 청산 단계가 이 프로토콜 4,9에서 사용되었습니다. 또한, 이러한 투명화 단계는 가역적이며, 새로운 항체는 해상도또는 밝기의 손실 없이 초기 염색에 첨가될 수 있다4. 그럼에도 불구하고, 연구된 3D 세포 배양 모델에 따라, 150-200 μm의 깊이는 유익한 방식으로 3D 구조를 이미지화하기에 충분하지 않을 수 있으며, 이 투명화 프로토콜은 큰 루멘을 갖는 구형, 단층 오가노이드의 일반적인 형태에 변화를 일으킬 수있다4. 사용자는 실험을 신중하게 설계하고 필요한 경우 투과화/차단 단계(항체 및 용액의 침투를 허용하기 위해), 투명화 단계(200μm보다 더 깊이 침투하려면 표본을 완전히 제거해야 함) 및 이미지 획득의 타이밍을 최적화해야 합니다. 핵심 시설에서 사용할 수 있는 가장 널리 사용되는 두 가지 기술은 라이트 시트와 컨포칼 현미경입니다. 사용자는 3D 구조의 크기와 생물학적 질문10에 따라 기술을 신중하게 선택해야합니다. 그러나, 공초점 현미경과 비교하여, 이러한 심층 구조에 대해 얻어진 광학 시트 현미경 해상도는 세포 내 해상도를 얻기 위해 차선책으로 남아 있습니다.
여기에서는 단일 샘플의 파라핀 임베딩에 전념하는 상세하고 강력한 프로세스가보고되었습니다. 흥미롭게도 Gabriel 등은 최근 증가된 처리량으로 파라핀에 3D 세포 배양을 내장하는 프로토콜을 개발했습니다. 그들은 폴리디메틸실록산(PDMS) 주형을 사용하여 96개의 3D 구조를 하나의 블록에 마이크로어레이 패턴으로 가두어 더 많은 그룹, 시점, 치료 조건 및 복제물11을 포괄하는 3D 종양 모델에 대한 연구에 새로운 관점을 제공했습니다. 그러나 이 방법은 특히 PDMS 금형을 만드는 데 사용되는 프리몰드의 제작을 위해 광범위한 기술과 기계가 필요합니다.
요약하면, 이 백서에서는 3D 셀룰러 모델의 아키텍처 및 셀룰러 구성에 대한 정확하고 정량적인 정보를 획득할 수 있는 두 가지 서로 다른 보완적이고 적응 가능한 접근 방식을 설명합니다. 두 매개 변수 모두 종양 내 세포 이질성 및 치료에 대한 내성에서의 역할과 같은 생물학적 과정을 연구하는 데 중요합니다.

지난 수십 년 동안 줄기 세포 생물학 및 체외 3D 배양 기술의 발전은 생물학 및 의학 분야의 혁명을 예고했습니다. 3D의 복잡성이 높은 세포 모델은 세포가 성장하고 주변 세포 외 프레임워크와 상호 작용할 수 있도록 하여 구조, 세포 조직 및 상호 작용 또는 확산 특성을 포함하여 살아있는 조직의 측면을 밀접하게 요약하기 때문에 매우 인기가 있습니다. 따라서 3D 세포 배양 모델은 시험관 내에서 발달 중이거나 병든 조직에서 세포의 행동에 대한 고유한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 오가노이드와 스페로이드는 모두 수 마이크로미터에서 밀리미터에 이르는 다세포 3D 구조이며 가장 두드러진 체외 3D 구조입니다. 둘 다 (i) 동물(기저막 추출물, 콜라겐), 식물(알지네이트/아가로오스)에서 유래하거나 화학물질로부터 합성된 하이드로겔, 또는 (ii) 세포 증식 및 성장을 촉진하기 위해 공극을 포함하는 불활성 매트릭스를 포함하는 지지 스캐폴드 내에서 배양될 수 있다.
오가노이드와 스페로이드는 또한 지지 스캐폴드의 존재 없이 세포에 의존하여 클러스터로 자체 조립함으로써 개발할 수 있습니다. 이는 세포 부착, 표면 장력 및 중력(예: 행잉 드롭 기술) 또는 용기의 일정한 원형 회전(예: 스피너 배양)을 억제하기 위한 비접착성 재료의 사용과 같은 다양한 기술에 의존합니다. 모든 경우에 이러한 기술은 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호 작용을 촉진하여 기존 단층세포 배양의 한계를 극복합니다1. "오가노이드"와 "스페로이드"라는 용어는 과거에 같은 의미로 사용되었지만 이 두 3D 세포 배양 모델 간에는 중요한 차이점이 있습니다. 오가노이드는 만능 줄기 세포 또는 조직 특이적 줄기 세포에서 유래한 시험관 내 3D 세포 클러스터로, 세포가 자발적으로 전구체 및 분화된 세포 유형으로 자기 조직화되고 관심 기관의 적어도 일부 기능을 요약합니다2. 스페로이드는 비부착 조건에서 형성된 광범위한 다세포 3D 구조로 구성되며 불멸화 세포주 또는 일차 세포와 같은 매우다양한 세포 유형에서 발생할 수 있습니다3. 따라서 고유 줄기 세포 기원에 내재된 오가노이드는 스페로이드보다 자기 조립, 생존력 및 안정성에 대한 성향이 더 높습니다.
그럼에도 불구하고 본질적으로이 두 모델은 여러 세포로 구성된 3D 구조이며이를 연구하기 위해 개발 된 기술은 매우 유사합니다. 예를 들어, 단일 세포 분해능 수준의 강력한 이미징 접근 방식은 오가노이드와 스페로이드 모두의 세포 복잡성을 조사하는 데 필요합니다. 여기에서는 이 그룹의 전문성과 오가노이드4 분야의 리더들의 전문성을 요약하여 100μm에서 수 밀리미터에 이르는 오가노이드 및 스페로이드의 세포 및 세포하 구성과 공간 조직에 대한 2차원(2D) 및 3D 전체마운트 염색, 이미징 및 분석을 수행하는 자세한 절차를 설명합니다. 실제로, 이 절차는 매우 다양한 크기와 유형의 시험관 내 3D 세포 배양 모델을 분석하기 위해 두 가지 서로 다른 보완적인 유형의 염색 및 이미징 획득을 제시합니다. 하나(3D 전체 마운트 해석) 또는 다른 하나(2D 단면 해석)의 사용은 연구된 모델과 찾는 답변에 따라 달라집니다. 예를 들어, 컨포칼 현미경을 통한 3D 전체 마운트 분석은 3D 구조의 전체 크기에 관계없이 최대 200μm 깊이의 3D 배양에서 세포를 시각화하는 데 적용할 수 있는 반면, 2D 단면 분석은 2D 수준이지만 모든 크기의 샘플에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 절차는 다양한 배아 배아 층에서 유래 한 다양한 유기체 4,5 및 인간 및 쥐 세포에서 파생 된 스페로이드에 성공적으로 적용되었습니다. 절차의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 주요 단계, 이들 간의 관계, 결정적인 단계 및 예상 타이밍이 표시됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig01.jpg"> 그림 1: 절차의 개략도 개요. 체외 3D 세포 배양 모델을 수집하고 고정한 다음 3D 전체 마운트 염색(옵션 a)을 위해 준비하거나 2D 절단 및 염색(옵션 b)을 위해 파라핀에 포매합니다. 3D 전체 마운트 염색 실험의 경우, 고정 단계 후에 고정된 3D 구조가 면역표지됩니다. 선택적 광학 클리어링 단계를 수행하여 이미지 처리 중 광 산란을 줄임으로써 광학 현미경의 이미징 품질과 깊이를 개선할 수 있습니다. 이미지는 도립 컨포칼 현미경 또는 컨포칼 고함량 시스템에서 캡처되고 적절한 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 파라핀 임베딩의 경우 3D 구조를 직접 처리하거나(400μm ≥ 대형 구조물의 경우 옵션 b.1) 탈수 및 파라핀 매립을 위해 겔(b.2, 400μm≤ 소형 구조)에 포함합니다. 그런 다음 파라핀 블록을 절단하고 염색합니다 (조직 학적 또는 면역 화학적 염색). 2D 단면의 이미지는 디지털 슬라이드 스캐너 또는 정립 현미경에서 획득하고 빠른 디지털 정량 분석을 사용하여 이미지 분석 플랫폼에서 분석합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopsy 패드 Q Path blue</td><td>VWR</td><td>720-2254</td><td></td></tr><tr><td>카세트 macrostar III Blc couv. Char. x1500</td><td>VWR</td><td>720-2233</td><td></td></tr><tr><td>카세트 마이크로트윈 화이트</td><td>VWR</td><td>720-2183</td><td></td></tr><tr><td>케미컬 후드</td><td>Erlab</td><td>FI82 5585-06</td><td></td></tr><tr><td>필터 팁 1000 &micro; L</td><td>스타 랩 팁원</td><td>S1122-1730</td><td></td></tr><tr><td>세밀한 펜치</td><td>피라미드 혁신</td><td>R35002-E</td><td></td></tr><tr><td>PTFE가 늘어선 평평한 바닥 유리 튜브 2 mL</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>11784259</td><td>우수&nbsp; 환경&nbsp; &nbsp; &nbsp; 샘플,&nbsp; &nbsp; &nbsp; 의약품 및 진단 시약. PTFE는 최고의 제품 안전을 위해 설계되었습니다. PTFE는 샘플 또는 제품을 향하는 완전히 불활성인 내부 씰과 표면을 제공합니다.</td></tr><tr><td>유리 바닥 접시 접시 35mm</td><td>Ibedi</td><td>2018003</td><td></td></tr><tr><td>수평 교반</td><td>N-BIOTEK</td><td>NB-205</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터는 65°도로 예열되었습니다. C</td><td>Memmert 인큐베이터</td><td>LAB129</td><td></td></tr><tr><td>Inox 금형 15x15</td><td>VWR</td><td>720-1918</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 Matsunami TOMO-11 / 90</td><td>Roche 진단</td><td>8082286001</td><td>이 슬라이드는 섹션의 더 나은 접착력을 위해 사용됩니다</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Microm Microtech France</td><td>HM340E</td><td></td></tr><tr><td>파노라마 스캔 II</td><td>3dhistech</td><td>2397612</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 임베딩 장비</td><td>Leica</td><td>EG1150C</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 피펫 파스퇴르 2 mL</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td></td></tr><tr><td>Q Path flacon 150mL 케이프 블랑 x250</td><td>VWR</td><td>216-1308</td><td>환경에 좋음&nbsp; &nbsp; &nbsp; 샘플,&nbsp; &nbsp; &nbsp; 의약품 및 진단 시약. 폴리프로필렌(PP)은 단단합니다. 견고하고 훌륭합니다&nbsp; 스트레스&nbsp; 균열&nbsp; 과&nbsp; 영향&nbsp; 저항력이 있고 a&nbsp; 좋은 기름과 알콜 장벽 및 내화학성. PE 라인 캡은 응력 균열에 강하며 다음을 제공합니다&nbsp; 우수한&nbsp; 밀봉&nbsp; 형질.&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로피펫터 세트&nbsp; (200쪽, 1000쪽)</td><td>Thermo Scientific</td><td>11877351 (20-200) 11887351(p1000)</td><td></td></tr><tr><td>OPERA PHENIX</td><td>PerkinElmer</td><td>HH14000000</td><td></td></tr><tr><td>SP5 도립 컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>조직 카세트</td><td>VWR</td><td>720-0228</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiomager 현미경</td><td>Leica</td><td>SIP 60549</td><td></td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>사이토블록(키트)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10066588</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>시그마-알드리치</td><td>57648266</td><td>주의: 독성 및 인화성. 증기는 자극을 유발할 수 있습니다. 흄 후드에서 조작하십시오. 피부와의 직접적인 접촉을 피하십시오. 고무 장갑, 보호 눈 고글을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>에오신 수성 1%</td><td>시그마-알드리치</td><td>HT110316</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 96%</td><td>VWR</td><td>83804.360</td><td>주의: 눈에 심한 자극을 일으킵니다. 가연성 액체 및 증기. 호흡기 자극을 일으킵니다. 흄 후드에서 조작하십시오. 보호용 눈 고글을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>에탄올 100%</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td>주의: 눈에 심한 자극을 일으킵니다. 가연성 액체 및 증기. 호흡기 자극을 일으킵니다. 흄 후드에서 조작하십시오. 보호용 눈 고글을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>포르말린 4%</td><td>Microm Microtech France</td><td>F/40877-36</td><td>주의: 포르말린에는 위험한 포름알데히드가 포함되어 있습니다. 흄 후드에서 조작하십시오. 피부와의 직접적인 접촉을 피하십시오. 고무 장갑과 보호 안경을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>프룩토스</td><td>시그마-알드리치</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>아가미 헤마톡실린 타입 II</td><td>마이크로미터 마이크로테크 프랑스</td><td>F/CP813</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5516</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>주의: 유전적 결함을 일으킬 것으로 의심됩니다.&nbsp; 피부와의 직접적인 접촉을 피하십시오. 고무 장갑과 보호 안경을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>일반 당나귀 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td>10mL</td></tr><tr><td>파라핀 왁스 tek III</td><td>Sakura</td><td>4511</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수(PBS) 1 X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Buffered Saline(TBS) 10X</td><td>Microtech France</td><td>F/00801</td><td>100mL</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td>주의: Triton X&shy; 100은 위험합니다. 피부와 눈과의 접촉을 피하십시오.</td></tr><tr><td>자일렌</td><td>시그마-알드리치</td><td>534056</td><td>주의: 자일렌은 독성이 있으며 가연성입니다. 증기는 자극을 유발할 수 있습니다. 흄 후드에서 조작하십시오. 피부와의 직접적인 접촉을 피하십시오. 고무 장갑, 보호 눈 고글을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>clearing solution</td><td>글리세롤-과당 세정 용액은 60%(vol/w) 글리세롤 및 2.5M 과당입니다. 이 용액 10mL를 준비하려면 글리세롤 6mL와 과당 4.5g을 혼합합니다. dH2O로 10mL까지 복용하십시오. 밤새 자석 교반기를 사용하십시오. 굴절률 = 실온에서 1.4688 (RT : 19&ndash; 23 > C). 4 &deg에 저장하십시오; C는 최대 1 개월 동안 어둠 속에서 진행됩니다.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS-BSA 0,1% 용액</td><td>0,1%(vol/wt) PBS-BSA 0,1% 용액을 준비하려면 PBS-1X 50mL에 BSA 500mg을 용해(4°C에 보관; C에서 최대 2주). 그리고 이 용액 1mL를 PBS-1X 9mL에 희석한다. 이 용액은 팁과 원심분리 튜브를 사전 코팅하는 데 사용할 수 있습니다.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>투과작용 차단 용액(PB 용액)</td><td>PBSDT 차단 용액은 0.1% &ndash; 1% Tritonx-100(단백질 국소화막/핵에 따라 다름), 1% DMSO, 1% BSA 및 1% 당나귀 혈청(또는 2차 항체가 형성된 동물)이 보충된 PBS-1X입니다. 이 용액은 4°C에 저장할 수 있습니다. C는 최대 1개월 동안 사용할 수 있습니다.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PB:PBS-1X &nbsp;( 1:10) 용액</td><td>PB:PBS-1X &nbsp;( 1:10) 용액은 10배 희석된 PB 용액입니다. 이 용액 10mL를 준비하려면 PBS-1X 9mL에 PB 용액 1mL를 희석합니다.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halo 소프트웨어</td><td>Indicalabs</td><td>NM 87114</td><td></td></tr><tr><td>Harmony 소프트웨어</td><td>PerkinElmer</td><td>HH17000010</td><td></td></tr></tbody></table>

3차원 오가노이드 및 스페로이드 모델의 염색 및 고해상도 이미징

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

오가노이드 및 스페로이드와 같은 체외 3차원(3D) 세포 배양 모델은 개발 및 질병 모델링, 약물 발견, 재생 의학을 포함한 많은 응용 분야에 유용한 도구입니다. 이러한 모델을 완전히 활용하려면 세포 및 세포 수준에서 연구하는 것이 중요합니다. 그러나 이러한 체외 3D 세포 배양 모델의 특성을 분석하는 것은 기술적으로 어려울 수 있으며 효과적인 분석을 수행하려면 특정 전문 지식이 필요합니다. 여기에서 이 백서는 100μm에서 수 밀리미터 범위의 고정된 체외 3D 세포 배양 모델의 염색 및 세포내 분해능 이미징을 수행하기 위한 상세하고 강력하며 보완적인 프로토콜을 제공합니다. 이러한 프로토콜은 기원 세포, 형태 및 배양 조건이 다른 다양한 유기체 및 스페로이드에 적용할 수 있습니다. 3D 구조 수집에서 이미지 분석에 이르기까지 이러한 프로토콜은 4-5일 이내에 완료할 수 있습니다. 간단히 말해서, 3D 구조를 수집 및 고정한 다음 파라핀 임베딩 및 조직학/면역조직화학 염색을 통해 처리하거나 직접 면역 표지를 하고 공초점 현미경으로 광학 투명화 및 3D 재구성(깊이 200μm)을 위해 준비할 수 있습니다.

이 프로토콜은 2D 및 3D 전체 마운트 염색뿐만 아니라 3D 세포 배양 모델의 이미징 및 정량 분석에 대한 중요한 단계에 대한 개요를 제공합니다 (그림 3 및 그림 4). 스페로이드에서 다양한 숙주 종 또는 조직의 오가노이드에 이르기까지 광범위한 3D 세포 배양 모델에 적용할 수 있으며 세포 및 아세포 수준에서의 구조, 세포 조직 및 상호 작용에 대한 정확하고 정량적인 정보를 획득할 수 있습니다 (그림 3 및 그림 4). 실험실은 필요에 따라 2D 조직학적 및 면역조직화학적 기술과 항체 농도를 최적화해야 할 수 있습니다.
두 방법 모두 귀중한 생물학적 정보를 제공합니다. 3D 전체 장착 염색 및 컨포칼 현미경은 최대 200μm의 깊이로 세포 구성 및 공간 위치에 대한 시각적 정보를 제공합니다(그림 3B). 그러나 2D 절단은 더 큰 샘플에서 분해능을 손상시키는 광산란으로 인해 현장에서 관찰하기 어려울 수 있는 3D 구조의 전체 섹션에서 상세한 세포 형태학적 특성을 드러내는 데 더 큰 3D 구조에 편리합니다. 또한 두 기술 모두 정량적 데이터를 제공 할 수 있습니다. 실제로, 얻어진 분해능은 세포 수의 정량화 및 상이한 세포 아형에서 다양한 세포 마커의 존재의 검출을위한 세포 및 세포 내 분할 알고리즘의 적용을 허용한다 (그림 3F 및 그림 4). 요약하면, 여기에 설명된 이미징 기술은 재현 가능하고 간단하며 보완적이며 세포 이질성을 연구하는 데 유용한 도구를 나타냅니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig03.jpg"> 그림 3: 3D 및 2D 광학 섹션의 3D 전체 장착, 이미징 및 분석에 대한 대표적인 결과. (A) 일주일 동안 배양하고 Hoechst(파란색), Olig2(노란색) 및 액틴(빨간색)으로 라벨링한 인간 (h) 고급 신경교종 스페로이드의 컨포칼 이미지(20x 물 대물렌즈). 획득한 모든 이미지에 대해 양성 대조군(상단)을 사용하여 현미경 설정을 설정한 다음 동일한 설정을 사용하여 음성 대조군을 이미징하여 1차 항체가 없는 상태에서 형광 부족을 제어했습니다(하단). (B) 일주일 동안 배양된 (h) 고급 신경교종 스페로이드에서 수행된 Ki67 염색의 직교 3D 전체 장착 표현(글리세롤-과당 투명화; 20x 물 대물렌즈, 공초점). (C) 일주일 동안 배양하고 Hoechst(파란색), Olig2(노란색) 및 팔로이딘-488(녹색)로 표지한 (h) 고급 신경교종 스페로이드의 컨포칼 이미지(글리세롤-과당 투명화, 20x 물 대물렌즈). (D) 일주일 동안 배양하고 각각 Hoechst(파란색), Actin(빨간색) 및 Ki67(녹색)로 표지한 인간(h) 횡문근육종(상단) 및 마우스(m) 신경 볏 세포(하단) 스페로이드의 컨포칼 이미지(글리세롤-과당 제거, 20x 건조 대물렌즈). (E) 일주일 동안 배양하고 Hoechst(파란색) 및 Ki67(녹색)로 표지한 (h) 고급 신경교종 스페로이드의 컨포칼 이미지(글리세롤-과당 투명화, 40x 물 대물렌즈)(왼쪽 상단). Hoechst 채널의 분할 이미지와 녹색 채널의 Ki67 양성(+) 핵 영역은 고함량 분석 소프트웨어를 사용하여 생성되었습니다( 보충 그림 1 및 재료 표 참조)(하단). 주어진 출력은 분할된 67D 구조당 Ki3+ 핵의 백분율입니다(오른쪽 상단). 스케일 바 = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig04.jpg"> 그림 4: 2D 광학 단면의 이미징 및 분석에 대한 대표적인 결과. (A, D) 디지털 슬라이드 스캐너로 얻은 3D 세포 모델(한 달 동안 배양한 인간 횡문근육종 스페로이드)의 2D 단면 이미지로, 빠른 디지털 정량 분석을 위한 플랫폼에서 분석했습니다. (A) H&amp;E 염색 및 크기에 따른 세포 검출. 스케일 바 = 500 μm. (B) 히스토그램은 빠른 디지털 정량 분석(왼쪽: Halo) 또는 수동 계수(오른쪽: MC)를 위한 소프트웨어를 사용하여 검출된 100 μm2 및 &gt; 100 μm2 &lt; 세포의 백분율을 보여줍니다. (C) Ki67 염색 및 이들의 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 신호의 강도에 따른 세포의 검출. 음수 (파란색), 약한 양성 (노란색), 양성 (빨간색). 스케일 바 = 500 μm. (D) 히스토그램은 Ki67 음성, 약한 양성 및 양성 세포의 백분율을 보여줍니다. 약어 : H &amp; E = 헤 마톡 실린 및 에오신; MC = 수동 계산. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: 이미징 분석 소프트웨어의 단계 개요. 분석은 빌딩 블록의 연관성을 기반으로 합니다. 각 빌딩 블록은 기능 분할, 계산, 연관, 출력 정의에 해당하며 이미징되는 생물학적 샘플과 일치하도록 여러 알고리즘 및 변수 선택을 제공합니다. 이 소프트웨어는 쉽게 사용하고 수정할 수 있는 여러 RMS(Ready Made Solution) 분석 프로토콜을 제공합니다. 통합 이미지 분석 프로토콜을 저장하고, 다양한 데이터 세트에 적용하고, 사용자 간에 공유할 수 있습니다. 간단히 말해서, 분석 프로토콜은 순차적 인 객체 분할을 의미합니다 : 스페로이드, 핵 및 마지막으로 Ki67 포켓 (A488). 그런 다음 Ki67 포켓의 평균 강도를 계산하여 긍정적 인 이벤트를 추가로 구별합니다. 마지막으로, Ki67 포지티브 포켓을 포함하는 핵이 긍정적으로 선택됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl1_Harmony%20analysis_Revised.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: 정량 분석 소프트웨어의 절차 단계 개요. 1 단계. 스터디 탭을 사용하여 파일을 업로드합니다. 파일이 이미지 작업 섹션에서 열립니다. 2 단계. 주석 탭을 연 다음 레이어 액션을 클릭하여 도구 모음의 원 도구를 사용하여 구조 주위에 새 레이어를 디자인합니다. 원형이 아닌 구조의 경우 펜 도구를 대신 사용할 수 있습니다. 3 단계. 도구 모음을 사용하여 주석을 디자인하고 도구로 정량화를 시각화할 수 있습니다 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">. 4 단계. 분석 탭을 열고 샘플 분석 에 가장 적합한 조건을 선택합니다(여기에서 여러 번의 시도가 필요할 수 있음). 4.1 단계. 얼룩 선택 섹션을 사용하여 얼룩 상태를 설정합니다. 여러 얼룩이 있는 경우 이를 추가하고 이름을 바꿀 수 있으며 가상 색상을 수정할 수 있습니다. 국소화 검출은 핵 또는 세포질 염색으로 지정할 수 있습니다. 4.2 단계. 셀 감지 섹션을 사용하여 셀 감지 를 설정합니다. 이 섹션은 분석에 가장 중요합니다. 핵 대비 임계 값 섹션은 모든 핵의 검출을 가능하게합니다. 여러 모집단 크기가있는 경우주의를 기울여야하며 소프트웨어는 고유 한 큰 세포 대신 여러 세포를 감지 할 수 있습니다. 핵 크기 및 핵 분할 공격성 섹션을 사용하여 세포 크기 집단 범위를 정량화할 수 있습니다. 5 단계. 샘플 분석을 실행하는 방법에 대한 설명입니다. 그림에 표시된 단계를 따릅니다. 주석 레이어 섹션은 이 슬라이드에서만 설정을 실행합니다. 정량화는 도구를 사용하여 시각화할 수 있습니다 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg">. 적절한 정량화가 달성될 때까지 4.1-5단계를 반복합니다. 단계 6-6.1. 이 단계를 통해 소프트웨어를 사용하여 그림을 그릴 수 있습니다. 7 단계. 소프트웨어를 통해 얻은 정량화 그래픽을 저장할 수 있습니다. 8 단계. 데이터를 내보낼 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl2_Halo%20Images_revised.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서 자사는 100μm에서 수 밀리미터 범위의 고정 3차원 세포 배양 모델의 염색 및 세포내 분해능 이미징을 수행하기 위한 상세하고 강력하며 보완적인 프로토콜을 제공하여 형태, 세포 유형 구성 및 상호 작용을 시각화할 수 있습니다.

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

세포 및 세포 내 분해능에서 3D 체외 모델을 특성화하는 것은 완전한 활용을 위해 중요하지만 어려울 수 있습니다. 따라서 우리는 100 마이크로 미터에서 수 밀리미터에 이르는 고정 3D 시험관 내 모델의 염색 및 세포 내 해상도 이미징을위한 무료 프로토콜을 제공했습니다. 3D 구조는 방사형이므로 신중하게 조작해야 합니다.파이펫팅하기 전에 튜브 내에서 3D 구조물의 위치를 확인하여 흡인을 피하십시오. 오가노이드 또는 스페로이드와 같은 작은 구조의 임베딩을 위해 고전적인 기술을 적용했기 때문에 시각화된 지침은 처음 사용자가 작업을 보다 쉽게 수행하는 데 도움이 될 수 있습니다. 저와 함께 절차를 시연하는 것은 병리학 연구 플랫폼의 실험실 기술자 인 Laura Francols가 될 것입니다.3D 전체 마운트 염색을 위한 샘플을 준비하려면 BSA로 사전 코딩된 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 500마이크로리터 PBS 튜브에 1밀리리터 3D 구조 현탁액을 추가합니다. 3D 구조가 튜브의 바닥에 정착되면 PBS를 500 마이크로 리터의 투과화 차단 용액으로 조심스럽게 교체하여 분당 30-50 회전의 부드러운 수평 교반으로 실온에서 1 시간 배양합니다. 배양이 끝나면 3D 구조물이 다시 침전되도록 한 후 세척당 3분 동안 BSA가 보충된 0.1%PBS 1밀리리터에 3D 구조물을 2회 조심스럽게 세척합니다.마지막 세척 후 PBS에서 250마이크로리터의 1차 항체로 3D 구조물을 섭씨 4도에서 부드러운 수평 교반으로 2-3일 동안 라벨링합니다. 인큐베이션의 끝에, 샘플을 세척 당 0.1%PBS BSA의 1 밀리리터에서 5회 3분 및 2회 15분 세척으로 세척한다. 마지막 세척 후, 빛으로부터 보호되는 부드러운 수평 교반으로 섭씨 4도에서 24시간 동안 PBS에 250마이크로리터의 적절한 2차 항체로 3D 구조물을 라벨링합니다.다음날, 3D 구조물에 Hoechst 3342의 적절한 농도 250마이크로리터로 라벨을 붙여서 섭씨 4도에서 부드러운 수평 교반으로 2시간 배양합니다. 인큐베이션의 끝에, 3D 구조물을 3분 동안 5회 세척하고, 입증된 바와 같이 세척당 1 밀리리터의 PBS로 15분 동안 2회 세척한다. 마지막 세척 후 3D 구조물을 96웰 검정색 폴리스티렌 마이크로플레이트로 옮기고 기포를 피하면서 200마이크로리터의 투명화 용액을 구조물에 부드럽게 추가합니다.그런 다음 알루미늄 호일로 덮인 판을 섭씨 4도에서 최소 48 시간 동안 놓습니다. 대형 3D 세포 배양 모델을 내장하려면 BSA 코팅 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 3D 구조를 PTFE 라이닝 병 뚜껑이 있는 평평한 바닥 유리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 구조가 침전된 후 PBS를 70% 에탄올로 조심스럽게 교체하여 실온에서 30분 배양합니다.배양이 끝나면 70 % 에탄올을 1 밀리리터의 에오신 Y 용액으로 교체하십시오. 튜브를 튕기고 적어도 30 분 동안 구조물을 얼룩지게하십시오. 배양이 끝나면 세척 당 100 % 에탄올 1 밀리리터에서 3 회 연속 30 분 세척으로 구조물을 탈수시킵니다.마지막 탈수 후 화학 후드 아래에서 세척 당 1 밀리리터의 크실렌으로 3 회 연속 30 분 세척하여 3D 구조를 제거합니다. 마지막 크실렌 침지 후 자일렌에 적신 생검 패드 조각을 흰색 마이크로트윈 티슈 카세트의 한 구획에 넣고 BSA 코팅 2밀리리터 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 3D 구조를 패드로 옮깁니다. 3D 구조물을 다른 크실렌에 적신 생검 패드로 덮어 3D 구조물을 제자리에 고정하고 카세트를 닫습니다.모든 샘플이 옮겨지면 카세트를 섭씨 65도 파라핀 욕조에 30 분 동안 넣은 다음 카세트를 섭씨 65 도의 신선한 파라핀 욕조에 밤새 두십시오. 다음날 아침, 샘플 당 하나의 섭씨 65도 예열 된 임베딩 몰드에 액체 파라핀을 추가하고 하나의 파라핀 내장 샘플을 각 몰드에 넣습니다. 모든 3D 구조가 바닥으로 떨어질 때까지 금형을 부드럽게 저어주고 섭씨 65도의 예열된 미세 집게를 사용하여 각 금형의 중앙에 3D 구조를 배치합니다.파라핀이 얇은 고체 층을 형성하여 3D 구조를 제자리에 고정할 때까지 금형을 냉각합니다. 티슈 카세트를 놓고 금형 위에 뜨거운 파라핀을 추가합니다. 파라핀이 완전히 고형화되면 금형을 제거하십시오.소형 3D 세포 배양 모델을 내장하려면 세척당 1밀리리터의 TBS로 3D 구조를 3회 부드럽게 세척합니다. 마지막 세척 후 구조물을 건드리지 않고 가능한 한 많은 TBS를 제거하고 상업용 파라핀 임베딩 키트에서 시약 2 방울을 추가합니다. 두드려서 부드럽게 섞고 젤이 굳을 때까지 두드려서 시약 두 방울을 추가합니다.미세한 집게를 사용하여 키트에서 사전 조립된 카세트의 웰에서 겔을 옮기고 표시된 대로 흄 후드에서 30분 오름차순 에탄올 및 크실렌 배양으로 겔 내장 샘플을 탈수합니다. 마지막 크실렌 침지 후 카세트를 섭씨 65도의 파라핀 수조에 밤새 넣은 다음 미세한 집게를 사용하여 파라핀 내장 샘플을 섭씨 65도 예열된 액체 파라핀이 로드된 임베딩 몰드의 중앙으로 옮깁니다. 그런 다음 대형 3D 세포 배양 모델에 대해 입증된 대로 파라핀 층을 하나 더 사용하여 3D 구조를 고정합니다.3차원 전체 마운트 염색 및 컨포칼 현미경은 최대 200미크론 깊이의 필드까지 3D 배양 모델의 세포 구성 및 공간 위치에 대한 시각적 정보를 제공합니다. 이 프로토콜을 사용하여 3D 구조에 대해 얻을 수 있는 고분해능을 통해 세포 수의 정량화와 다양한 세포 하위 유형 내의 다양한 세포 마커 검출을 위한 세포 및 세포하 분할 알고리즘을 적용할 수 있습니다. 3D 전체 마운트 분석은 전체 구조에 관계없이 최대 200미크론 깊이의 시각화된 셀에 적용할 수 있습니다.반대로 2D 단면 분석은 모든 크기의 세포에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

staining-high-resolution-imaging-three-dimensional-organoid-spheroid

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

광학 일관성 단층 촬영 (10 월), 3 차원 영상 기술, 모니터링 하 고 다세포 종양 spheroids의 성장 활동 특성 사용 되었다. 접근, 및 내장 광 감쇠 대비에 따라 spheroids에서 레이블 없는 죽은 조직 검출 복을 사용 하 여 종양 spheroids의 정확한 체적 정량화 시연 했다.

경도 형태 및 생리 적인 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 3 차원 종양 Spheroids의 모니터링

여기, 우리 인간의 기본 전립선 organoid 처리 안내 다음 끝점 표현 형을 평가 하는 것이 좋습니다 프로토콜을 제시. 시드, 문화 유지 보수, 매트릭스 젤에서 복구 형태 론 적 정량화, 포함 및 단면, FFPE 단면, 전체 마운트 얼룩, 및 상업적인 분석의 응용 프로그램 설명 합니다.

처리 및 인간의 기본 전립선 Organoid 문화에 대 한 평가

장기의 전체 3D 구조 및 세포 함량뿐만 아니라 원래 조직과 의학적 유사성은 여기에 설명된 단세포 분해능 3D 이미징 프로토콜을 사용하여 포획될 수 있다. 이 프로토콜은 원기, 크기 및 모양이 다양한 광범위한 오르가노이드에 적용할 수 있습니다.

단세포 분해능 3차원 알래기 알코노이드

상세한 프로토콜이 인간 비강 상피 세포로부터의 시험관내 오가노이드 모델을 기술하기 위해 여기에 제시된다. 이 프로토콜에는 표준 실험실 장비가 필요한 측정 옵션이 있으며 특수 장비 및 소프트웨어에 대한 추가 가능성이 있습니다.

인간 비강 상피 오가노이드의 문화와 이미징

이 논문은mm2당 수백 개의 마이크로컨테이너를 사용하는 새로운 유형의 배양 기질에 대한 제조 프로토콜을 제시하며, 이 배양에서 오가노이드는 고해상도 현미경을 사용하여 배양 및 관찰할 수 있습니다. 세포 파종 및 면역 염색 프로토콜도 자세히 설명되어 있습니다.

오가노이드의 배양 및 3D 이미징을 위한 고처리량 플랫폼

본 연구는 다양한 현미경으로 전체 스페로이드 및 오가노이드를 배양, 냉동, 해동, 가공, 염색, 라벨링 및 검사하는 방법론을 설명하지만 다목적 장치 내의 하이드로겔에 그대로 유지됩니다.

배양, 냉동, 처리 및 전체 오가노이드 및 스페로이드의 이미징 상태를 하이드로겔에 있는 동안

이 연구는 스탬프 기반 시스템을 사용하여 아가로스 주형에 마이크로웰을 생성함으로써 3D 세포 구조를 생성하는 비용 효율적이고 효율적인 방법론을 제시합니다. 이 시스템은 균일한 스페로이드/오가노이드의 형성을 촉진하여 세포 상호 작용을 개선합니다. 이 접근 방식은 실험 변동성을 줄이고 약물 테스트 및 조직 공학의 응용 분야를 지원합니다.

Novel Stamp Device를 사용한 2차원 세포 배양에서 3차원 스페로이드/오가노이드 생성

이 프로토콜은 광학 투명화(optical clearing)와 면역 라벨링(immunolabeling)을 결합하여 전체 마운트 망막 오가노이드의 전체 볼륨 컨포칼 이미징을 제공합니다. 3D 구조를 보존하여 주요 신경 경로를 자세히 시각화할 수 있으며, 망막 성숙, 공간 조직, 질병 모델링 및 개인 맞춤형 의학에서의 잠재적 응용에 대한 연구를 개선합니다.

Whole-mount Retinal Organoid Visualization with Cellular Resolution

우리는 저간섭 홀로단층촬영을 사용하여 오가노이드의 고해상도, 무표지 및 3차원 이미징을 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 오가노이드 배양 준비, 이미징 획득 및 전산 이미지 분석을 자세히 설명하여 살아있는 오가노이드의 구조 역학 및 약물 반응을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

저간섭성 홀로토마그래피를 통한 장내 오가노이드의 무표지, 고해상도 3D 이미징 및 머신러닝 분석

Aplysia californica의 뉴런 성장 콘 운동성 및지도 고해상도 이미지를위한 최고의 아르 문화의 큰 성장 콘을 개발. 여기서 우리는 절개 및 Aplysia 가방 셀 뉴런의 도금뿐만 아니라 라이브 셀 이미징을위한 챔버를 설정을위한 프로토콜을 제시한다.

성장 콘스의 고해상도 이미징을위한 Aplysia에서의 연결을 셀 문화

배우세요 3D 오가노이드 및 스페로이드의 고해상도 염색 및 이미징 프로토콜을 통해 세포 수준 분석을 수행하는 방법을. 전체 마운트 면역염색과 파라핀 매립 기법을 활용하여 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다.

3차원 오가노이드 및 스페로이드 모델의 염색 및 고해상도 이미징

더 많은 동영상 탐색