저간섭성 홀로토마그래피를 통한 장내 오가노이드의 무표지, 고해상도 3D 이미징 및 머신러닝 분석

우리는 개발 중 및 약물에 대한 반응으로 살아있는 오가노이드의 생물물리학적 변화를 모니터링할 때 실시간으로 라벨이 없는 이미징 방법을 확립하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 생물 의학 연구를 위한 AI 기반 돌연변이 및 정량적 질감 선택으로 지원되는 살아있는 오가노이드에서 이미징 및 비침습적 약물 테스트의 간소화된 규모를 용이하게 합니다. 우리는 질병 모델링 및 정밀 의학에서 고해상도, 비침습적 오가노이드 연구를 위한 무표지 3D 이미징과 연간 분석을 추가로 통합하기 위해 플롯합니다.

시작하려면 세포외 기질을 포함하는 48웰 플레이트의 각 웰에서 사용한 배지를 흡인합니다. 각 웰에 200마이크로리터의 세포 회수 용액을 첨가하고 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다. 피펫을 사용하여 오가노이드 현탁액을 부드럽게 수집하여 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

튜브를 150g에서 3분 동안 원심분리한 다음 상청액을 조심스럽게 제거합니다. 펠릿을 기계적으로 분리하기 위해 200마이크로리터의 배양 배지에 재현탁하고 P200 피펫을 사용하여 현탁액을 위아래로 20-30회 피펫팅한 후 3분 동안 원심분리합니다. 원심분리 및 상청액 제거 후, 배지 및 신선한 세포외 기질(ECM)을 펠릿에 1:4 비율로 첨가하고 부드럽게 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.

돔당 15마이크로리터의 혼합물을 48웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다. ECM의 중합을 허용하기 위해 플레이트를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터에 1시간 동안 거꾸로 놓습니다. 중합 후 각 웰에 200마이크로리터의 신선한 배양 배지를 추가하고 빈 외부 웰을 PBS로 채웁니다.

이미징을 위해 샘플을 준비하려면 15마이크로리터의 오가노이드 ECM 돔을 1.5번 커버슬립 바닥 이미징 접시에 분배하고 실온에서 1분 동안 배양합니다. 접시를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터에 거꾸로 넣어 1시간 동안 넣습니다. 그런 다음 오가노이드가 완전히 잠길 수 있을 만큼 충분한 배양 배지를 부드럽게 추가합니다.

계대 후 5일, 이미징 직전에 PBS로 샘플을 2-3회 세척합니다. 다음으로 이미징을 위해 환경 컨트롤러를 켭니다. 챔버 컨트롤러 장치는 자동으로 온도를 섭씨 37도, 이산화탄소를 5%로 설정합니다. 도어 버튼을 눌러 문을 엽니다.

물을 추가하여 챔버 내부에 얇은 층을 형성합니다. 이미징 접시를 용기 홀더에 넣고 이미징 챔버에 삽입한 다음 핀을 사용하여 고정하여 움직이지 않도록 합니다. 외부 빛의 간섭을 방지하기 위해 문을 닫으십시오.

이제 TomoStudio X 소프트웨어를 실행하고 로그인합니다. 시작을 클릭하여 기본 창을 연 다음 왼쪽 위 모서리에 있는 프로젝트 추가를 클릭하고 실험을 할당합니다. 적절한 굴절률 사용을 위해 올바른 매체 유형이 선택되었는지 확인합니다.

패널에서 원하는 웰을 클릭한 다음 상단의 생성을 클릭하여 웰을 시편으로 등록합니다. 그런 다음 오른쪽 상단 모서리에 있는 ROI 설정을 클릭하여 접시의 관심 영역을 정의합니다. 설정이 완료되면 오른쪽 하단 모서리에 있는 실험 실행을 클릭하여 이미지 획득 창을 엽니다.

모서리에 있는 Load Vessel을 클릭하여 밝은 필드 이미지를 표시합니다. Z 및 Z 버튼을 사용하여 Z 위치를 조정하여 이미지에 초점을 맞춥니다. 단일 이미징 탭에서 ROI 크기를 조정합니다.

160마이크로미터 x 160마이크로미터의 시야에서 오가노이드를 캡처하고 최대 140마이크로미터 깊이의 스택을 획득합니다. 타임랩스 이미징 탭으로 이동하여 장기 이미징을 설정하고 원하는 기간과 간격 시간을 설정합니다. 스캔 아이콘을 클릭하여 현재 ROI 위치를 캡처합니다.

BF 버튼을 클릭하여 명시야 이미징의 강도 및 노출 값을 조정합니다. 미리보기 패널에서 ROI 상자를 이동하여 ROI를 선택합니다. 원하는 ROI를 선택한 후 하단의 포인트 추가를 클릭하면 이미징 포인트 목록이 생성됩니다.

이제 획득을 클릭하여 이미징을 시작하고 원시 이미지 데이터를 수집합니다. 데스크탑 아이콘을 클릭하여 HTX 처리 서버를 시작합니다. 원시 이미지 파일을 HTX 처리 서버로 끌어다 놓습니다.

프로세스를 클릭하여 원시 이미지 파일에서 TCF 파일을 생성합니다. 데스크탑 아이콘을 클릭하여 TomoAnalysis 뷰어를 시작합니다. 처리된 TCF 파일을 뷰어 창으로 끌어다 놓아 로드합니다.

파일 축소판을 두 번 클릭하여 ROI 단층 촬영을 엽니다. 확대/축소, 이동 및 스크롤 컨트롤을 사용하여 X, Y, Z 평면을 탐색하여 2D 뷰를 검사합니다. 왼쪽의 MIP 렌더링 뷰 아이콘을 클릭하여 3D 렌더링 모드로 전환합니다.

이미지를 회전, 확대/축소 및 이동하여 3D 보기를 탐색합니다. 기계 학습 기반 이미지 분할의 경우 TCF 이미지 파일을 HDF5 형식으로 내보내 데이터가 ilastik과 호환되는 다차원 형식인지 확인합니다. ilastik을 열고 새 프로젝트로 이동합니다.

선택 픽셀 분류 아래에서 세그멘테이션 워크플로 섹션을 선택하고 프로젝트를 지정된 폴더에 저장합니다. HGF5 파일을 로드하려면 입력 데이터 탭으로 이동하여 새 파일 추가를 클릭하고 적절한 H5 데이터 세트를 선택한 다음 올바른 이미지 채널 할당을 확인합니다. 이제 기능 선택 탭으로 이동하여 색상, 강도, 가장자리 및 질감과 같은 기능을 선택하여 분할을 최적화합니다.

훈련 탭에서 다른 색상의 브러시 스트로크를 사용하여 오가노이드 및 비오가노이드 영역에 레이블을 지정합니다. 라이브 업데이트 를 클릭하여 세분화 결과를 미리 보고 필요한 경우 조정합니다. 완료되면 예측 내보내기 탭으로 이동합니다.

레이블이 지정된 예측을 내보낼 소스로 단순 세분화를 선택하고 모두 내보내기를 클릭합니다. 분석 요구 사항에 따라 내보내기 형식을 H5 또는 TIFF로 설정합니다. 정량 분석을 위해 보충 코딩 파일 2를 엽니다.

스크립트 내에서 마스크 파일 및 해당 TCF 파일에 대한 적절한 폴더 경로를 지정합니다. 코드를 실행하여 정량적 분석을 시작합니다. 이 코드는 각 데이터 세트에 대한 오가노이드 부피, 단백질 밀도 및 총 단백질 함량을 계산합니다.

이 그림은 소장 오가노이드의 전반적인 형태를 시각화하는 데 사용되는 고해상도, 3차원 굴절률 재구성을 보여줍니다. 렌더링된 재구성은 세 가지 광학 단면 깊이 모두에 걸쳐 비히클 처리된 오가노이드와 시스플라틴으로 처리된 오가노이드 사이의 뚜렷한 구조적 차이를 보여줍니다. 시스플라틴 처리된 오가노이드는 처리 후 10분에 비히클 처리된 오가노이드에 비해 상당히 더 높은 부피, 더 낮은 단백질 밀도 및 더 높은 총 단백질 함량을 보였으며, 이는 초기 구조적 팽창 및 단백질 구성의 변화를 나타냅니다.

24시간 동안의 타임랩스 이미징은 비히클 처리된 오가노이드가 구조적 무결성을 유지하는 반면, 시스플라틴 처리된 오가노이드는 선행 붕괴 및 세포 해리 증가를 포함한 점진적인 구조적 저하를 경험하여 시간 의존적 세포독성 손상을 시사하는 것으로 나타났습니다. 정량적 추적은 비히클 처리된 오가노이드가 시간이 지남에 따라 부피와 단백질 함량이 증가한 반면, 시스플라틴 처리된 오가노이드는 두 매개변수 모두에서 시간 의존적 감소를 보였으며, 이는 시스플라틴이 성장을 억제하고 세포 분해를 유도했음을 나타냅니다. 단백질 밀도는 비히클 처리 오가노이드에서 안정적으로 유지되었지만 24시간 동안 시스플라틴 처리 오가노이드에서 점진적으로 감소하여 각질 제거로 인한 세포 구조의 파괴 및 세포외 공간 증가를 시사합니다.