Name: 인간 비강 상피 오가노이드의 문화와 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: 학습하세요 인간 비강 상피 오가노이드 배양 및 이미징 방법을 통해 낭포성 섬유증 연구에서 CFTR 활성과 루멘 크기의 상관관계를 분석하는 기술을 익히세요.

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우리는이 프로토콜을 개발하기 위해 HNE 브러시 생검을 기증 한 모든 참가자의 기여에 감사드립니다. 연구 자원 봉사자 모집 및 샘플 수집을 조정해 주신 Latona Kersh와 Children's Research Unit 직원에게 감사드립니다. 릴리 덩, 조나단 베일리, 그리고 우리 실험실의 전 연수생이었던 스티븐 맥케이에게 기술 지원에 감사드립니다. 우리는 Zhong Liu와 Rui Zhao에게 기술적 인 도움을 주셔서 감사합니다. UAB의 CF 연구 센터 책임자 인 Steven M. Rowe는 리더십과 자원을 제공하며,이 없이는 이러한 작업이 불가능합니다. 또한 Biotek의 Sarah Guadiana에게 계측기 훈련 지원을 해준 Sarah Guadiana, UAB 고해상도 이미징 시설에서 공초점 현미경 검사 지원을 해준 Robert Grabski, UAB Histology Core에서 조직학적 지원을 해준 Dezhi Wang에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 (NIH)의 지원을 받았습니다. 그랜트 K23HL143167 (JSG에), 낭포성 섬유증 재단 (CFF) 그랜트 GUIMBE18A0-Q (JSG에), 그레고리 플레밍 제임스 낭포성 섬유증 센터 [NIH 그랜트 R35HL135816 및 DK072482 및 버밍엄 앨라배마 CFF 대학 (UAB) 연구 개발 프로그램 (Rowe19RO)], UAB 임상 및 번역 과학 센터 (NIH 그랜트 UL1TR001417).

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<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492(2018).</li>
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<li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+nasal+epithelial+multicellular+spheroids%3A+polar+cyst-like+model+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues.</a> Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).</li>
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JSG는 유사한 모델을 설명하는 노스 캐롤라이나 대학의 특허 출원 20170242033에 발명가로 등록되어 있습니다. UNC의 라이센스 기술이 로열티를 생산할 때, 발명가는 수익의 몫을 받는다. 그렇지 않으면 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다. 기금 제공자는 연구의 설계, 데이터 수집, 분석 또는 해석, 원고 작성 또는 결과 발표 결정에 아무런 역할을하지 못했습니다.

이 원고는 HNE 브러시 생검에서 유래 된기도 상피 오가노이드의 포괄적 인 라이브 및 고정 이미징을위한 상세한 방법론을 제공합니다. 그것은 개체에서 CFTR 활성을 결정할 수있는 기능적 분석을 설명합니다. HNE는 다양한 용도를 위한 최소 침습성 일차 조직을 제공합니다. 여기에 제공된 확장 기술은 오가노이드를 포함한 기도 질환을 모델링하는 데 사용될 수 있습니다. 오가노이드는 정밀한 치료 접근법과 시간에 따른 유전자 또는 mRNA 기반 치료법의 안정성을 모니터링하고, 정밀 시험 설계를 위해, 그리고 결정적이지 않은 진단(39)을 해결하는 데 도움을 주기 위해 사용될 수 있다. 현재 연구는 CF에 관한 것이지만,이 모델들은 상피 기능에 영향을 미치는 다른 질병에 대한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.
생검 후 HNE의 초기 확장은 필수적입니다. 세포학 브러쉬가 다른 생검 도구(14)보다 더 큰 초...

기술 소개 Ex vivo 배양 기반 분석은 정밀 의학 및 질병 병리 생리학 연구에 점점 더 많이 활용되는 도구입니다. 일차 인간 비강 상피 (HNE) 세포 배양은 낭포성 섬유증의 수많은 연구에 사용되어 왔으며 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , 여러 장기에서 상피 세포 기능에 영향을 미치는 상염색체 열성 질환. HNE 배양은 전향적으로 얻을 수 있는 기도 상피의 재생 가능한 공급원을 제공하고 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절기(CFTR) 활성을 시험하기 위해 전기생리학적 및 생화학적 특성을 되풀이합니다. HNE 세포는 일반적인 바이러스성 호흡기 면봉과 유사한 최소한의 부작용(14)으로 샘플링될 수 있다. HNE 브러쉬 생검으로부터 유래된 낭포성 섬유증 연구에 대한 모델을 기술하는 연구 작업은 최근11,13에 발표되었다. 일차 HNE2,3 및 장 조직15,16,17,18,19를 사용하는 다른 모델과 유사하지만, CF 연구에 사용하고 다른 기도 질환의 연구를 돕기 위해 이 모델의 분화 및 영상화에 대한 상세한 특성화가 여기에 기술되어 있다 13 . 오가노이드 모델은 불멸화된 세포주처럼 무제한이 아니지만, 조건부 재프로그래밍(조사되고 불활성화된 피더 섬유아세포 및 Rho-kinase 억제제 사용)에 의해 보다 줄기 세포 유사 상태20,21,22,23으로 확장될 수 있다. 이 방법을 사용하여 HNE 브러쉬 생검을 처리하면 완전히 분화 할 수있는 능력을 유지하면서 더 높은 처리량으로 여러 응용 분야에서 사용할 수있는 많은 수의 상피 세포가 생성됩니다. 이 프로토콜이 피더 세포를 사용하여 개발되었지만, 피더 세포 기술(14,24)을 피하고자 하는 조사자들에 의해 다른 방법론들이 사용될 수 있다.
폐 생물학에 대한 기술의 중요성 중요한 연구는 상피 세포의 세포막에 규칙적이고 기능하는 CFTR이 없으면 폐, 췌장, 간, 장 또는 기타 조직에서 어떻게 기능 장애를 초래하는지 이해하는 데 전념했습니다. 기능 장애가있는 상피 이온 수송, 특히 염화물과 중탄산염의 상피 이온 수송은 상피 라이닝 유체의 부피가 감소하고 점액 분비물의 변화를 일으켜 점액 정체 및 폐색으로 이어집니다. 원발성 섬모 운동 이상증과 같은 다른 기도 질환에서, 변경된 섬모 운동은 점액 클리어런스를 손상시키고 점액 정체 및 폐색(25)을 초래한다. 따라서, 현재의 HNE 오가노이드 모델은 조사자의 실험 설계 및 자원에 따라 다양한 응용을 위해 개발되고 있다. 여기에는 살아있는 세포 얼룩을 이용한 살아있는 세포 이미징이 포함됩니다. 형태학을 특성화하기 위한 고정 및 단면화; 항체로 면역 형광 염색 및 발광 내 구조를 파괴하는 것을 피하기 위해 전체 마운트 공초점 이미징; 및 섬모 비트 빈도 및 점액 수송의 정량적 측정을 위한 밝은 장 이미징 및 마이크로 광학 간섭 단층 촬영(13). 다른 조사자로의 확장을 용이하게 하기 위해, 상업적으로 이용가능한 시약 및 공급물을 배양에 사용하였다. 일반적인 현미경 기술과 더 전문화 된 장비를 사용하는 기능적 분석이 개발되었습니다. 전반적으로, 본 모델은 기준선에서 또는 치료제에 반응하여 CFTR 활성을 평가하도록 설계된 반면, 이 프로토콜에 기술된 기술은 상피 세포 기능, 특히 상피 세포 유체 수송을 수반하는 다른 질환에 적용될 수 있다.
다른 방법론과의 비교 최근에 이 오가노이드 모델의 유용성은 환자의 오가노이드의 시험관내 CFTR 조절제 반응을 그들의 임상 반응(11)과 상관관계에 의해 개발되었다. 특히, 본 모델이 동일한 환자에서 CFTR 기능을 평가하기 위한 현재의 황금 표준인 단락 전류 반응을 병렬화했다는 것도 입증되었다. 단락 전류는 전자가 이온 수송(26)을 통해 CFTR 기능을 측정하기 때문에 팽윤 분석과 다르다. 대조적으로, 이 분석은 유체 수송을 통한 더 많은 다운스트림 효과를 측정하여, CFTR 27,28,29,30,31,32의 전체 기능에 대한 추가 정보를 제공한다. 단락 전류 측정은 CFTR 염화물 채널 활성 1,33을 결정하기 위한 일반적이고 신뢰할 수 있는 방법임이 계속되고 있다. 이러한 전기생리학적 분석은 전문화되고 값비싼 장비가 필요하며, 오가노이드 분석법보다 각 실험 복제에 대해 몇 배 더 많은 세포를 필요로 하며, 쉽게 자동화할 수 없으며, 더 높은 처리량 애플리케이션을 위해 확장이 불가능하다. 장 상피로부터 유래된 또 다른 오가노이드 모델은 보다 우수한 복제 능력과 같은 추가적인 이점 15,16,17,18을 갖지만, 기도 조직으로부터 유래되거나 보편적으로 이용가능하지 않다. HNE 칫솔질은 진정 작용이 필요없고 최소한의 위험으로 저렴한 세포학 브러시로 얻을 수 있습니다. 양치질을 얻는 것은 임상의가 필요하지 않으며 훈련 된 연구 코디네이터 및 다른 연구 직원(14)에 의해 수행 될 수있다. HNE 오가노이드 모델은 일차 세포 배양 능력을 가진 모든 실험실에서 배양할 수 있으며, 일부 용도는 표준 현미경 기술로 수행할 수 있습니다. 전체적으로 이러한 장점은 일부 실험실에서 사용할 수없는 기도 상피 기능을 평가하기위한 기술에 대한 추가 액세스를 제공합니다. 또한, HNE 오가노이드는 장내 오가노이드가 할 수 없는 원발성 섬모 운동이상증25 또는 바이러스 감염과 같이 기도에 영향을 미치는 다른 질병 상태를 연구하는데 이용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>비강 브러시</td><td>의료 포장 CYB1</td><td>CYB-1</td><td>길이: 8인치, 너비 약 7mm</td></tr><tr><td>대형 오리피스 피펫 팁</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-707-141</td><td>대구경 피펫 팁</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>A1110501세포 박리 용액</td></tr><tr><td>0.05% 트립신 -EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>트립신 대두 억제제</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td>작업 솔루션: 1XDPBS</td></tr><tr><td>Matrigel 매트릭스</td><td>Corning</td><td>356255</td><td>세포외 매트릭스(EM)</td></tr><tr><td>&마이크로에서 1mg/mL;-Slide Angiogenesis</td><td>Ibidi</td><td>81506</td><td>15-well slide</td></tr><tr><td>24-Well Transwell</td><td>Corning</td><td>7200154</td><td>Culture insert</td></tr><tr><td>Chambered Coverglass</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>155409</td><td>8웰 유리 바닥 챔버 슬라이드</td></tr><tr><td>Cell-Tak 세포 및 조직 접착제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>354240</td><td>세포 접착제</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>50980487</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37605</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope)</td><td>Nikon</td><td></td><td>Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope</td></tr><tr><td>Nikon A1R-HD25</td><td>Nikon</td><td></td><td>Confocal microscope</td></tr><tr><td>NIS Elements-Basic Research</td><td>Nikon</td><td></td><td>수동 이미징 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Histogel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>일회용 베이스 몰드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41-740</td><td></td></tr><tr><td>Lionheart FX</td><td>BioTek</td><td>BTLFX</td><td>자동 이미지 시스템</td></tr><tr><td>Lionheart 커버</td><td>BioTek</td><td>BT1450009</td><td>환경 제어 뚜껑</td></tr><tr><td>습도 챔버</td><td>BioTek</td><td>BT1450006</td><td>스테이지 인서트(환경 챔버)</td></tr><tr><td>CO2</sub용 가스 컨트롤러> 및 O2</td><td>BioTek</td><td>BT1210013</td><td>가스 컨트롤러</td></tr><tr><td>마이크로플레이트/슬라이드 스테이지 인서트</td><td>BioTek</td><td>BT1450527</td><td>슬라이드 홀더</td></tr><tr><td>Gen5 이미징 프라임 소프트웨어</td><td>BioTek</td><td>BTGEN5IPRIM</td><td>자동 이미징 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>4x 위상차 대물렌즈</td><td>BioTek</td><td>BT1320515</td><td></td></tr><tr><td>10x 위상차 대물렌즈</td><td>BioTek</td><td></td><td></td>BT1320516</tr><tr><td>LED 큐브</td><td>BioTek</td><td>BT1225007</td><td></td></tr><tr><td>필터 큐브 (DAPI)</td><td>BioTek</td><td>BT1225100</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>CFTRinh-172</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S7139</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Expansion Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>F12 영양소 혼합물</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11765</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; 16140-071</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; 15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>콜레라 독소</td><td>시그마</td><td>&nbsp; C8052</td><td></td></tr><tr><td>표피 성장 인자(EGF)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; </td><td></td>PHG0314</tr><tr><td>하이드로코르티손(HC)</td><td>시그마</td><td>&nbsp; H0888</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마</td><td>&nbsp; I9278</td><td></td></tr><tr><td>아데닌</td><td>시그마</td><td>&nbsp; A2786</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>스템젠트</td><td>&nbsp; 04-0012-02</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceftazidime</td><td>Alfa Aesar</td><td>&nbsp; J66460-03</td><td></td></tr><tr><td>토브라마이신</td><td>알파 아이사르</td><td>&nbsp; J67340</td><td></td></tr><tr><td>Vancomycin</td><td>알파 Aesar</td><td>&nbsp; J67251</td><td></td></tr><tr><td>암포테리신 B</td><td>시그마</td><td>&nbsp; A2942</td><td></td></tr><tr><td>Differentiation Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 (1:1)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; 11330-32</td><td></td></tr><tr><td>Ultroser-G</td><td>폴</td><td>&nbsp; 15950-017</td><td></td></tr><tr><td>태아 클론 II</td><td>하이클론</td><td>&nbsp; SH30066.03</td><td></td></tr><tr><td>소 뇌 추출물</td><td>Lonza</td><td>&nbsp; CC-4098</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마</td><td>&nbsp; 9278</td><td></td></tr><tr><td>하이드로 코르티손</td><td>시그마</td><td>&nbsp; H-0888</td><td></td></tr><tr><td>트리요오드티로닌</td><td>시그마</td><td>&nbsp; T-6397</td><td></td></tr><tr><td>트랜스페린</td><td>시그마</td><td>&nbsp; T-0665</td><td></td></tr><tr><td>에탄올아민</td><td>시그마</td><td>&nbsp; E-0135</td><td></td></tr><tr><td>에피네프린</td><td>시그마</td><td>E-4250</td><td></td></tr><tr><td>O-포스포릴에탄올아민</td><td>시그마</td><td>P-0503</td><td></td></tr><tr><td>레티노산</td><td>시그마</td><td>R-2625</td><td></td></tr><tr><td><강력한>일차 항체</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인간 CFTR 항체</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1660</td><td>희석: 100x</td></tr><tr><td>ZO-1 항체</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA3-39100-A647</td><td>희석: 1000x</td></tr><tr><td>Anti-MUC5B 항체</td><td>Sigma</td><td>HPA008246</td><td>희석: 100x</td></tr><tr><td>항아세틸화 튜불린</td><td>Sigma</td><td>T7451</td><td>희석: 100x</td></tr><tr><td>Anti-beta IV Tubulin 항체</td><td>Abcam</td><td>Ab11315</td><td>희석: 100x</td></tr><tr><td>2차 항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>희석: 2000x</td></tr><tr><td>당나귀 anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A21207</td><td>희석: 2000x</td></tr></tbody></table>

인간 비강 상피 오가노이드의 문화와 이미징

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

낭포성 섬유증 (CF) 환자에 대한 개별화 된 치료는 기준선 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절기 (CFTR) 활성 및 소분자 화합물로부터의 복원을 이해하기 위해 시험관 내 질병 모델로 달성 될 수 있습니다. 우리 그룹은 최근 일차 인간 비강 상피 세포 (HNE)에서 직접 파생 된 잘 분화 된 오가노이드 모델을 수립하는 데 중점을 두었습니다. 절편된 오가노이드의 조직학, 전체 탑재 면역형광 염색 및 이미징(공초점 현미경, 면역형광 현미경 및 밝은 필드 사용)은 기능적 분석에 대비하여 오가노이드를 특성화하고 상피 분화를 확인하는 데 필수적입니다. 또한, HNE 오가노이드는 CFTR 활성과 상관 관계가 있는 다양한 크기의 루멘을 생성하며, CF와 비-CF 오가노이드를 구별합니다. 이 원고에서는 HNE 오가노이드를 배양하기위한 방법론이 자세히 설명되어 있으며, 기준선 루멘 면적 측정 (현미경을 사용하는 모든 실험실에서 사용할 수있는 오가노이드에서 CFTR 활성 측정 방법)을 포함한 이미징 양식을 사용한 분화 평가뿐만 아니라 기능 분석에 대한 개발 된 자동화 된 접근법 (더 전문화 된 장비가 필요함)에 중점을 둡니다.

HNEs 확장은 번성하는 오가노이드 배양에 필수적입니다. 성공적인 샘플 수집의 HNE는 약 10 일 동안 70 % 이상의 합류로 확장되어야합니다. 성공한 샘플과 실패한 샘플의 예는 각각 그림 1A 및 그림 1B에 나와 있습니다. 조사된 3T3 세포와 공동 배양한 후 14일까지 70% 합류에 도달할 수 없는 경우 세포를 폐기해야 한다. 오염된 모든 세포는 추가적인 항미생물제로 신속하게 구출할 수 없는 경우 즉시 폐기되어야 한다.
오가노이드의 성장을 15-웰 슬라이드 및 배양 인서트에서 비교하였다. 배양 인서트는 광학적으로 최적화된 슬라이드보다 더 두껍고 목표에서 더 멀리 떨어져 이미지와 해상도에 영향을 미칩니다. 그럼에도 불구하고, 도 2에 도시된 바와 같이, 이들 두 배양 방법에서 형태학에 ...

상세한 프로토콜이 인간 비강 상피 세포로부터의 시험관내 오가노이드 모델을 기술하기 위해 여기에 제시된다. 이 프로토콜에는 표준 실험실 장비가 필요한 측정 옵션이 있으며 특수 장비 및 소프트웨어에 대한 추가 가능성이 있습니다.

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

낭포성 섬유증 환자에 대한 개별화된 요법은 기준선에서 CFTR 활성을 이해하기 위해 시험관내 질환 모델에 의해 달성될 수 있다. 인간 비강 상피 오가노이드 또는 HNE 오가노이드는 CFTR 활성과 상관 관계가 있는 다양한 크기의 루멘을 생성하여 CF와 비-CF 오가노이드를 구별합니다. 여기에서는 이러한 HNE 오가노이드를 배양하고 이미징하는 방법론을 자세히 설명했습니다.기능장애성 상피 이온 수송, 특히 염화물 및 중탄산염의 상피 이온 수송은 상피 라이닝 유체의 부피 감소를 초래한다. 이것은 또한 점액 분비물에 영향을 미치며 점액 분비물과 폐색으로 이어집니다. 따라서 HNE 모델은 조사자의 실험 설계 및 자원에 따라 다양한 응용 분야를 위해 개발되었습니다.기준선에서 또는 치료제에 대한 반응으로 CFTR 활성을 평가하는 것 외에도,이 기술은 상피 세포 기능, 특히 상피 세포 유체 수송을 포함하는 다른 질병에도 적용될 수 있습니다. 이러한 방법은 주로 낭포성 섬유증 연구에 사용하기 위해 개발되었습니다. 원발성 섬모 운동 이상증과 같은기도 상피를 평가하는 다른 연구에서도 이러한 방법이 도움이 될 수 있습니다.이러한 기술은 세부 사항과 정밀도에주의를 기울여야합니다. 그들은 또한 세포의 초기 확장이 적절한지 확인하기 위해주의 깊은 관찰이 필요합니다. 매일 모든 문화를 모니터링하면 성공할 가능성이 더 큽니다.시작하려면 비강 브러시 생검을 15 밀리리터 원뿔형 튜브의 8 밀리터의 RPMI 배지로 해리시켜 세포학 브러시를 1 밀리리터의 대형 보어 피펫 팁을 통해 여러 번 통과시킵니다. 세포를 섭씨 네 도에서 5분 동안 500배 g에서 원심분리한다. 상청액을 버리고, 이어서 세포 펠릿을 세 밀리리터의 세포 분리 용액에 재현탁시킨다.소화시키기 위해 실온에서 16분 동안 인큐베이션한다. 다섯 밀리리터의 팽창 배지를 사용하여 세포를 두 번 세척하십시오. 그런 다음, 이들을 T75 플라스크에 첨가하고, 조사, 불활성화 및 50 내지 60% 합류성 3T3 섬유아세포로 미리 시딩한다.세포를 공동 배양하고 7 내지 14일 동안 팽창 배지에서 팽창시키도록 허용한다. 낭포성 섬유증 환자로부터 유래된 세포에 항생제를 도입한 경우, 배지는 배양 초기 사흘 후에 항생제가 없는 확장 배지로 교체되어야 하며, 80%가 합류할 때까지 이틀에 한 번씩 배지를 계속 바꿀 수 있다. 세포를 1x DPBS로 세척하십시오.이어서, 1.5 밀리리터의 0.05%트립신

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

인간 자원 봉사자의 표면 부스러기 생검을 통해 얻은 비강 상피 세포, 조직 배양 인서트로 확장 및 전송됩니다. 포화 상태에 도달하면, 세포는 섬모와 비 섬모 세포의 문화를 산출, 공기 액체 계면에서 재배되고 있습니다. 차별화 된 비강 상피 세포 배양은 호흡기 점막을 공부 가능한 실험 모델을 제공합니다.

에어 리퀴드 인터페이스에서 인간의 비강 상피 세포의 배양

이 간행물은 어린이의 코 상피 점막을 성공적으로 샘플링 및 배양하고 이러한 세포를 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 방법을 보여줍니다.

어린이에서 차 비강 상피 세포를 배양 및 유도 다 능성 줄기 세포로 재 프로그램

우리는 제노푸스 laevis 배아로부터 분리된 깊은 자궁 근세포세포로부터 점도 상피 오르가노이드를 개발하는 간단한 프로토콜을 기술합니다. 다능성 선조는 상피 잔잔 세포 전구체를 재생하고 오르가노이드 표면의 세포 전이의 개시 및 진행을 실시간으로 추적할 수 있도록 합니다.

제노푸스 배아 세포에서 점동 상피 오르가노이드: 생성, 배양 및 고해상도 라이브 이미징

이 프로토콜은 비강 상피 세포 수집, 확장 및 기관형 기도 상피 세포 모델로의 분화와 라이브 셀 이미징 및 맞춤형 스크립트를 통한 섬모 박동 빈도의 정량화를 설명합니다.

섬모 박동 빈도의 정량화를 위한 1차 인간 비강 상피 세포 모델의 수집, 확장 및 분화

이 프로토콜은 원발성 폐 조직으로부터 인간 폐 오가노이드를 유도하고, 폐 오가노이드를 확장시키고, 근위 분화를 유도하여 인간 기도 상피를 충실하게 표현 복사하는 3D 및 2D 기도 오가노이드를 생성하는 방법을 제시한다.

성숙한 기도 오가노이드를 생성하기 위해 인간 폐 오가노이드 및 근위 분화 확립

이 논문은mm2당 수백 개의 마이크로컨테이너를 사용하는 새로운 유형의 배양 기질에 대한 제조 프로토콜을 제시하며, 이 배양에서 오가노이드는 고해상도 현미경을 사용하여 배양 및 관찰할 수 있습니다. 세포 파종 및 면역 염색 프로토콜도 자세히 설명되어 있습니다.

오가노이드의 배양 및 3D 이미징을 위한 고처리량 플랫폼

이 프로토콜은 차등 원심분리를 통해 원발성 정상 및 종양 유방 조직에서 상피 오가노이드를 생성하는 접근 방식에 대해 논의합니다. 또한 3차원 배양 및 포매된 오가노이드의 면역형광 이미징에 대한 지침이 포함되어 있습니다.

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비강 상피는 모든 호흡기 병원체가 만나는 주요 장벽 부위입니다. 여기에서는 생리학적으로 관련된 시스템에서 인간 코로나바이러스-숙주 상호 작용을 특성화하기 위해 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양으로 성장한 일차 비강 상피 세포를 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.

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인간 비강 상피 오가노이드의 문화와 이미징

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