순차모세혈관 보조 어셈블리를 통한 미생물 및 미생물 입자의 패터닝

이 방법은 미세유체 채널 내에서 미생물의 사용자 정의 패턴을 생산할 수 있습니다. 일단 패턴화되면, 미생물은 그들의 장기 생리학 및 높은 처리량과의 상호작용을 평가하기 위해 모니터링될 수 있다. 모세관력의 사용은 패터닝을 위한 비특이적 경로를 가능하게 하며, 이는 다양한 종류의 재료에 걸쳐 적용될 수 있다.

예를 들어, 콜로이드 입자 및 박테리아. 또한, 그것은 관심있는 재료의 공간 배열의 절묘한 제어와 큰 배열을 생성 할 수 있습니다. 현재까지 우리는 콜로이드 입자와 미생물 세포에 대한 방법을 테스트하고 적용했습니다.

결과적으로 재료 공학 및 약물 스크리닝과 같은 정량적 단일 세포 분석이 필요한 분야에서 응용 프로그램을 찾을 수 있습니다. 시작하여, 엘라스토머를 그의 가교제와 혼합함으로써 PDMS 혼합물을 제조한다. 그런 다음 혼합물을 격렬하게 저어 기포가 형성되고 PDMS 혼합물이 불투명하게 보일 때까지 두 성분을 균일하게 혼합하십시오.

이제 모든 기포가 제거되고 혼합물이 다시 투명하게 보일 때까지 진공 데시케이터에서 혼합물을 탈기하십시오. 마이크로유체 칩의 400 마이크로미터 두께의 템플릿 플로어를 얻기 위해, 혼합물 3 그램을 실리콘 마스터 상에 붓고 스핀 코터 상에 실리콘 마스터를 놓고 5초 동안 21배 G에서, 10초 동안 54배 G에서 스핀 코트를 한다. 앞서 설명한 바와 같이 포획된 기포를 제거하기 위해 다시 가스를 제거한다.

20 그램의 PDMS 혼합물을 3D 인쇄 된 몰드에 부어 미세 유체 칩의 지붕 역할을하는 마이크로 채널을 만들고 앞서 설명한 것처럼 30 분 동안 탈기하십시오. 실리콘 웨이퍼와 3D 프린트된 몰드를 섭씨 70도에서 적어도 두 시간 동안 구워낸 다음, 3D 프린트된 몰드의 윤곽선을 따라 PDMS를 절단하고 벗겨냅니다. 마이크로 채널 주위에 블레이드로 PDMS를 자르고 미세 유체 채널의 입구 및 출구 역할을하는 구멍을 펀치하십시오.

이제 PDMS를 잘라 실리콘 마스터에서 떼어내고 PDMS 층을 템플릿 위에 결합될 미세유체 채널과 동일한 치수의 작은 조각으로 자릅니다. 템플릿과 마이크로 채널을 1 % 세제 용액을 사용하여 5 분 동안 부드럽게 문지르고 탈 이온수로 헹구십시오. 다음으로, 템플릿과 마이크로 채널을 이소프로판올로 헹구고 탈이온수로 헹구십시오.

이제 템플릿과 마이크로 채널을 실온에서 한 바에서 압축 공기로 한 분 동안 건조시킵니다. 템플릿과 마이크로채널을 플라즈마 클리너에 놓고 접합면을 위로 향하게 합니다. 플라즈마 클리너를 켠 후 플라즈마는 템플릿과 마이크로 채널을 40 초 동안 처리 한 다음 플라즈마 클리너에서 꺼내어 템플릿 상단의 마이크로 채널을 즉시 결합합니다.

PDMS 소수성 회복을 보장하기 위해 미세 유체 칩을 섭씨 70도의 오븐에 5 일 동안 보관하십시오. 실험 당일, 실험 몇 시간 전에 박스 인큐베이터를 섭씨 37도에 놓은 다음 현미경 스테이지에 주사기 펌프와 가열 된 유리 플레이트를 설치하여 박스 인큐베이터와 동일한 온도를 설정하십시오. 실험 90분 전, 미세유동 칩을 100% 에탄올로 채워진 용기에 넣고 10분 이상 100% 에탄올로 채널을 플러시한 다음, 미세유동 칩을 진공 데시케이터에 넣고 30분 이상 탈기한다.

이제 에탄올을 증류수로 교환하고 칩을 적어도 30 분 동안 진공 처리하십시오. 미세유체 칩을 섭씨 70도의 오븐에 넣고 10분 동안 채널에 남아 있는 액체의 흔적을 제거하였다. MOPS 배지 1 밀리리터를 원심분리 바이알에 피펫팅하고 0.132 몰 인산칼륨 10 마이크로리터를 첨가한다.

100 마이크로리터의 분취량을 원심분리 바이알에 넣고 2분 동안 2, 300배 G에서 배양물을 원심분리한다. 펠렛을 0.015%의 트윈 20 및 0.01%의 인산칼륨과 함께 1밀리리터의 신선한 MOPS 배지에 재현탁시키기 위해 상청액을 부드럽게 폐기하고 박테리아 현탁액을 1밀리리터 주사기에 로딩한다. 주사기와 튜브 연결을 고정하려면 바늘을 튜브에 직접 삽입하십시오.

이제 주사기를 시린지 펌프에 장착하고 서스펜션이 트랩으로 템플릿 영역을 덮을 때까지 채널의 상류 부분에 위치한 입구를 통해 현탁액을 미세 유체 칩에 주입하십시오. 주사기 펌프를 분당 0.07 ~ 0.2 마이크로 리터의 유량으로 설정하여 박테리아 현탁액을 회수하고 현미경 소프트웨어를 통해 패터닝 과정을 모니터링하십시오. 일단 템플릿이 세포로 패턴화되면, 인출 유속을 증가시켜 미세유체 채널을 빠르게 비우고 이전에 적어도 30분 동안 탈기하고 섭씨 30도에서 예열된 신선한 LB로 플러시합니다.

이제 주사기 펌프를 분당 두 마이크로 리터의 유속으로 설정하여 채널을 부드럽게 플러시하십시오. 채널이 채워지면 다시 유량을 증가시킵니다. 원하는 배율과 시간 간격으로 성장하는 박테리아의 이미지를 획득하십시오.

0.015%Tween 20 수용액 900 마이크로리터를 원심분리 바이알에 넣은 다음 100 마이크로리터의 피펫을 피펫으로 하여 원래의 콜로이드 현탁액을 넣었다. 현탁액을 1분 동안 13, 500배 G에서 원심분리하고, 상청액을 수성 Tween 20 용액으로 부드럽게 교체한다. 콜로이드 현탁액을 하나의 밀리리터 주사기에 넣고 미세 유체 튜브를 통해 주사기를 칩에 연결하십시오.

현탁액을 채널의 상류 부분의 중앙 섹션 내에 위치한 입구를 통해 미세유체 칩에 주입하고 템플릿이 덮일 때까지 현탁액을 점차적으로 밀어 넣습니다. 콜로이드 현탁액을 분당 0.07 내지 0.2 마이크로리터의 유속으로 인출하고 현미경 소프트웨어를 통해 패터닝 공정을 이미지화한다. 메니스커스가 템플릿의 끝에 빠르게 도달하면 유속을 높입니다.

직선 채널 기하학은 분석된 5, 000개의 트랩 중 83%를 증착한 형광 에스케리치아 콜리 균주의 고정상 세포 패턴으로 이용되었다. 패턴화된 박테리아는 채널이 신선한 LB로 채워졌을 때로부터 1.5시간 이내에 상이한 시간에 성장을 재개하였다. 일단 성장이 재개되면, 단일 박테리아 세포는 표층이 형성되고 단일 세포 분해능이 손실 될 때까지 팽창하는 개별 콜로니를 형성하기 시작했습니다. 55, 000 트랩에 걸쳐 실시된 분석에 따르면 두 마이크로미터 직경의 입자와 하나의 마이크로미터 직경으로 만들어진 녹색 적색 이량체가 각각 분석된 트랩의 93%와 89%에서 형성되었다.

그리고 녹색 - 적색 - 녹색 트리머는 함정의 52 %에서 형성되었습니다. 패턴화된 입자 사이의 거리는 반대 방향으로 두 개의 증착을 수행함으로써 정밀하게 제어될 수 있으며, 따라서 이러한 입자를 각 트랩의 반대쪽 말단에 포획한다. 패터닝 프로세스 중에 응축을 방지하기 위해 템플릿 전체에 걸쳐 균일한 온도를 보장하는 것이 중요합니다.

이를 위해 우리는 템플릿 아래에 가열 된 유리 판을 놓고 상자 인큐베이터와 동일한 온도로 설정합니다. 이 방법은 정량적 단일 세포 분석을 수반하는 다양한 생물학적 연구에 사용될 수 있다. 독특한 장점은 동일한 실험 영역 내에서 큰 통계를 제공하는 수천 개의 셀을 패터닝할 수 있는 높은 처리량 특성입니다.