Name: 순차모세혈관 보조 어셈블리를 통한 미생물 및 미생물 입자의 패터닝 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 배우세요 미세유체 채널에서 모세관력을 이용해 세균과 콜로이드 입자를 사용자 정의 패턴으로 배열하는 방법을. 장기 생리학 및 상호작용을 고처리량으로 모니터링할 수 있습니다.

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저자는 SNSF PRIMA 보조금 179834 (E.S.), ETH 연구 보조금 ETH-15 17-1 (R. S.), 수생 미생물 심바이오시스 (보조금 GBMF9197) (R. S.)에 대한 고든과 베티 무어 재단 조사관 상을 인정합니다. 저자는 박테리아의 SEM 화상 진찰및 통찰력 있는 토론을 위한 박사 미겔 엔젤 페르난데스-로드리게스 (그라나다 대학, 스페인) 감사합니다. 저자들은 젠 응우옌 박사(캐나다 브리티시 컬럼비아 대학), 로라 알바레즈 박사(스위스 ETH 취리히), 카메론 보곤(ETH 취리히, 스위스), 파비오 그릴로 박사에게 감사의 인사를 전합니다.

1. 실리콘 마스터 준비
참고: 콜로이드 및 미생물 패터닝을 위한 템플릿을 형성하는 마이크로 패브릭 트랩을 포함하는 PDMS 템플릿은 가이슬러 등에서 도입한 방법에 따라 제작되었다. 17. 실리콘 마스터는 클린룸에서 기존의 리소그래피에 의해 제조되었다. 장비의 절차 및 재료 표에 대한 다음 단계를 참조하십시오.
<ol><li>CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어를 사용하여 기능을 디자인합니다.</li>
	<li>UV 다이렉트 레이저 라이터로 디자인된 기능을 노출하여 긍정적인 포토레지스트 레이어로 크롬 글래스 마스크를 준비합니다.<ol>
<li>1:4 포토레지스트대 물 비율을 1:4로 사용하여 스핀 개발자와 함께 크롬 유리 마스크를 개발합니다.</li>
		<li>50 s에 대 한 크롬 etchant에 마스크를 담그다.</li>
		<li>플라즈마 처리 는 600 W에서 3 분 동안 10cm 실리콘 웨이퍼를 처리합니다.</li>
		<li>증기-예틸드실리자네층을 예치하고 110°C에서 굽아 포토레지스트쪽으로 접착을 개선한다.</li>
		<li>포토레지스트 레이어를 4,500× g 로 2분 동안 증정합니다.</li>
		<li>2s용 마스크 정렬기로 크롬 글래스 마스크를 통해 UV에 기능을 노출하고 마스크에 대한 개발자와 함께 개발합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실리콘 마스터의 제조를 완료하려면 깊은 반응이온 교환을 통해 웨이퍼를 식히고 에칭 시간(<2분)을 조정하여 원하는 깊이(profilometer로 측정)를 달성합니다.</li>
</ol>2. 마이크로 채널 금형 준비
<ol><li>CAD 소프트웨어로 채널을 설계하고 슬라이서 소프트웨어로 슬라이스하여 설계된 모델을 3D 프린터의 지침으로 변환하여 슬라이스 거리를 0.05mm로 설정합니다.</li>
	<li>~1h의 3D 프린터로 채널을 인쇄합니다.</li>
	<li>전용 경화 및 세탁기로 금형을 세척하고 후처리하십시오.<ol>
<li>순수한 이소프로필 알코올(IPA)으로 채워진 용기에 금형을 넣고 액체를 소용돌이치십시오 (20 분 동안 세척). IPA로 채워진 용기를 기기에서 꺼내십시오.</li>
		<li>세척된 금형이 IPA 용기에서 제거되면 세척 및 경화기에 다시 넣고 35°C에서 15분 동안 포스트큐어를 처리합니다. 참고: 재료 테이블 은 금형 준비 프로토콜에 사용되는 3D 프린터와 경화 및 세탁기를 보고합니다. 3D 모델은 3D 프린터의 독자적인 슬라이서 소프트웨어로 슬라이스되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>12 시간 동안 UV 오븐에 인쇄를 놓고 12 시간 동안 80 °C의 오븐에 놓습니다. 참고: 이 단계는 모든 폴리머가 경화되고 모든 경화되지 않은 폴리머가 PDMS가 경화되는 것을 방지하기 때문에 인쇄물에서 제거되도록 합니다.</li>
	<li>트리클로로(1H, 1H, 2H, 2H-퍼플루오로옥틸)의 증기 증착을 통해 금형을 실란화한다.<ol>
<li>3D 몰드을 진공 건조기에 넣고 100% 농축 트리클로로(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 실레인 파이펫과 함께 금형에 가깝게 배치된 알루미늄 호일에 파이펫을 넣습니다.</li>
		<li>건조기에서 진공을 만들어 증기를 생성하고 40분 동안 둡니다.</li>
		<li>데시케이터에서 금형을 제거하고 PDMS를 붓기 전에 순수 에탄올로 헹구십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 미세 유체 칩의 제조
<ol><li>제고제(재료표)와 엘라스토머를 혼합하여 PDMS 혼합물을 준비합니다. 혼합물을 격렬하게 저어서 기포가 형성되고 PDMS 혼합물이 불투명해 보일 때까지 두 성분을 균일하게 혼합합니다. 참고: 교차 링커의 양은 엘라스토머의 무게에 의해 10%여야 합니다.</li>
	<li>갇힌 기포를 제거하기 위해 진공 건조기에서 엘라스토머와 교차 연결제의 혼합물을 탈가스. 혼합에 사용되는 용기에 건조기내의 혼합물을 전달(단계 3.1). 모든 거품이 제거되고 혼합물이 다시 투명해 보일 때까지 탈기 공정을 계속합니다. 참고: 탈수에 일반적으로 필요한 시간은 30분입니다.</li>
	<li>실리콘 마스터에 혼합물 3 g을 부어 미세 유체 칩의 "바닥"역할을하는 템플릿을 생성합니다. 참고: PDMS 층의 두께는 실리콘 마스터에 부어진 혼합물의 양을 변경하여 조정할 수 있습니다.<ol>
<li>400 μm 두께의 템플릿을 얻으려면 실리콘 마스터에 PDMS 3 g을 붓고, 실리콘 마스터를 스핀 코트에 넣고, 스핀 코트는 21 × g 에서 5 s 및 54 × g 에 대해 10 s로, 그리고 3.2 단계에서 설명된 대로 다시 드가하여 갇힌 기포를 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D 프린팅 금형에 PDMS 혼합물 20g을 부어 마이크로채널을 만들고, 이는 미세 유체 칩의 "지붕"역할을 하고, 30분 동안 3.2단계에서 설명된 바와 같이 분해한다.</li>
	<li>실리콘 웨이퍼와 3D 인쇄 금형을 70°C에서 2시간 이상 굽습니다.</li>
	<li>3D 인쇄 금형에서 PDMS 층을 껍질을 벗기고, 마이크로 채널 주위에 블레이드로 PDMS를 자르고, 미세 유체 채널의 입구와 출구역할을 하는 구멍을 펀치합니다.</li>
	<li>실리콘 마스터에서 PDMS를 껍질을 벗기고 템플릿 위에 결합될 미세 유체 채널의 동일한 치수로 PDMS 층을 작은 조각으로 자른다.</li>
	<li>1% 세제 용액( 재료 표 참조)을 사용하여 템플릿과 마이크로채널을 부드럽게 문지른 다음 탈이온화된 물로 헹구십시오. 다음으로 템플릿과 마이크로 채널을 이소프로파놀로 헹구고 탈이온화된 물로 헹구습니다. 1 bar에서 압축 공기로 1 분 동안 실온에서 템플릿과 마이크로 채널을 건조시십시오.</li>
	<li>서피스가 접합된 플라즈마 클리너에 템플릿과 마이크로채널을 배치합니다. 플라즈마 클리너를 켜고 플라즈마는 템플릿과 40 초마이크로 채널을 처리합니다. 플라즈마 클리너에서 꺼내서 템플릿 위에 있는 마이크로 채널을 즉시 결합하여 서로 접촉하십시오.</li>
	<li>PDMS 소수성 회복을 보장하고 최적의 범위 내에서 후퇴 접촉 각을 가지고, 사이 30 과 60 ° 10,11 을 보장하기 위해 5 일 동안 70 °C에서 오븐에 미세 유체 칩을 저장합니다.</li>
</ol>4. 세균 패터닝
<ol><li>실험 하루 전에, 대장균 의 인구를 성장 (균주 MG1655 prpsM-GFP). 냉동 육수로부터 직접 배양을 접종하고 37°C에서 셰이커 인큐베이터에서 리소제니 국물(LB) 배지에서 20시간 동안 하룻밤 동안 자랍니다. prpsM-GFP 플라스미드를 유지하기 위해 세포를 위해 50 μg/mL의 카나마이신을 추가합니다.</li>
	<li>실험 당일, 실험 전에 상자 인큐베이터(도 2A)를 실험 전에 몇 시간 전에 균일하고 안정적인 온도를 가지도록 설정하여 실험을 시작한다. 주사기 펌프를 설정하고 현미경 단계(그림 2B,C)에 가열된 유리 플레이트를 설정하여 박스 인큐베이터와 동일한 온도로 온도를 설정합니다. 참고: 현미경(그림 2E)을 포함한 전체 시스템이 밀폐되어 있는 박스 인큐베이터는 채널이 매체로 플러시될 때 전체 실험에서 균일하고 일정한 온도를 유지하도록 합니다.</li>
	<li>실험 90분 전에 100% 에탄올(EtOH)으로 채워진 용기에 미세유체 칩을 넣고 100% EtOH로 채널을 10분 이상 세척합니다. 미세 유체 칩을 진공 건조기와 데가스에 적어도 30분 간 배치합니다. EtOH를 증류수로 교환하고 칩을 최소 30분 동안 진공 처리합니다. 마이크로 유체 칩을 70°C에서 10분 동안 오븐에 넣어 채널에 남아 있는 액체의 흔적을 제거합니다. 참고: 이 단계는 배양 매체로 플러시 채널의 거품 형성을 방지하기 위해 필요합니다. 이 거품 방지 프로토콜은 Wang et al.18에서 채택되었습니다.</li>
	<li>파이펫 1 mL 3-(N-morpholino)프로파네설포닉산(MOPS) 배지(1x)를 원심분리기 바이알에 넣고 0.132M 칼륨 인산염(K2HPO4)의 10 μL을 추가한다. 37°C 인큐베이터및 알리쿼트 100 μL에서 하룻밤 문화를 원심분리기 바이알으로 꺼내 2분 × g에서 원심분리기로 한다. 원심분리기 바이알에서 상체를 부드럽게 피펫하고, 0.015% v/v의 Tween 20 및 0.01% v/v의 칼륨 인산염으로 신선한 MOPS 배지 1mL로 펠릿을 재차 질한다. 참고: 세균현탁액의 전형적인 농도는 0.015-0.15vol%의 범위에 있으며, 이는 확장 및 이동식 축적 영역의 형성을 보장하고 기판에 입자의 축적을 방지합니다. 하룻밤 매체를 신선한 매체로 교체하면 템플릿에 박테리아 필름을 방출할 위험이 최소화됩니다. 신선한 배지에서 탄소 공급원이 부족하면 템플릿 패터닝 중에 세포가 현탁액에서 자라는 것을 방지할 수 있습니다. 서스펜션에서 Tween 20의 0.015% v/v의 농도는 30~60°의 최적의 범위 내에 속하는 PDMS 템플릿의 후퇴액체의 접촉 각에 필요하다.</li>
	<li>세균 현탁액을 1mL 주사기에 적재하고 주사기를 미세유체 튜브를 통해 칩에 연결합니다.<ol>
<li>주사기와 튜브 사이의 연결을 확보하려면 외지0.6mm의 바늘을 튜브에 직접 삽입하십시오. 채널 을 가로 질러 입구 부근에 남아있는 서스펜션을 분산하지 않도록하기 위해, 입구로 사용되는 구멍이 아닌 패터닝 과정에서 콘센트로 사용되는 구멍을 통해 신선한 매체를 플러시한다(도 3A-III).</li>
		<li>주사기 펌프에 주사기를 장착하고 서스펜션이 트랩으로 템플릿 영역을 덮을 때까지 채널의 상류 부분에 위치한 입구를 통해 미세 유체 칩에 서스펜션을 주입합니다. 참고: 액체 주입 과정에서 공기는 채널의 하류 끝에 있는 콘센트를 통해 빠져나갈 수 있습니다.</li>
		<li>주사기 펌프를 0.07-0.2 μL/min의 유속으로 철회하도록 주사기 펌프를 설정하여, 이는 기술된 기하학에서 80-100 μm/min의 반월상 연골 후퇴 속도에 해당한다.</li>
		<li>현미경 소프트웨어를 통해 패터닝 프로세스를 모니터링합니다. 참고: 여기서, 10배배율은 템플릿에서 후퇴하는 반월상연골을 모니터링하는 데 사용되었고, 20배배배율은 개별 박테리아의 증착을 미세가공된 함정으로 모니터링하는 데 사용되었다.</li>
	</ol></li>
	<li>템플릿이 세포(그림 3A-II)로 패턴화되면, 금출 유량을 증가하여 미세 유체 채널을 신속하게 비우고 이전에 30분 이상 탈유하고 30°C에서 예동된 신선한 LB로 플러시합니다.</li>
	<li>주사기 펌프를 2 μL/min의 유량으로 설정하여 채널을 부드럽게 플러시합니다. 채널이 채워지면 특정 실험 요구에 따라 유량(15 μL/min)을 증가시킵니다.</li>
	<li>원하는 배율 및 시간 간격으로 박테리아가 자라는 이미지를 획득합니다.</li>
</ol>5. 콜로이드 패터닝
<ol><li>0.015% v/v 트위엔 20수성 용액의 파이펫 900 μL을 원심분리기 바이알과 파이펫 100 μL로 원래 콜로이드 서스펜션의 들어올림. 1분 동안 13,500 × g 의 서스펜션원심분리. 상체를 부드럽게 제거하고 수성 트위엔 20 (0.015 % v / v) 용액으로 교체하십시오. 이 프로세스를 세 번 반복하여 공급업체의 용매를 재고 정지에서 완전히 교체할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>콜로이드 서스펜션을 1mL 주사기에 적재하고 주사기를 미세유체 튜브를 통해 칩에 연결합니다. 채널의 상류 부분에 있는 중앙 섹션 내에 있는 입구를 통해 미세 유체 칩에 서스펜션을 주입하고 템플릿이 적용될 때까지 서스펜션을 점진적으로 밀어 넣습니다.</li>
	<li>0.07-0.2 μL/min의 유속으로 콜로이드 서스펜션을 철회하고, 반월상 연골 후퇴 속도에 해당하는 1-2 μm/min, 현미경 소프트웨어를 통해 패터닝 공정을 이미지화한다. 10배 배율을 사용하여 템플릿의 후퇴 하는 반월 상 연골을 모니터링하고 20 배율로 개별 입자의 증착을 미세 가공 된 트랩으로 관찰하십시오. 반월 상 연골이 템플릿의 끝에 도달하면 유량을 늘려 채널을 빠르게 비웁시다. 참고: 여러 입자로 구성된 콜로이드 어레이는 5.1단계에서 5.3단계부터 5.3단계의 패터닝 공정을 연속하여 실행하여 생성될 수 있다. 채널은 원하는 콜로이드 어레이의 컴포지션에 따라 각 반복에 새 콜로이드 서스펜션이 로드됩니다. 각 패터닝 단계는 콜로이드 어레이에 하나의 입자를 추가하고 트랩이 원하는 입자의 시퀀스로 채워질 때까지 순차적으로 실행할 수 있습니다. 결과 콜로이드 어레이의 조성물은 트랩을 채우는 데 사용되는 콜로이드 서스펜션의 시퀀스에 의해서만 주어집니다(도 3B).</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

여기에 설명된 미세유체 플랫폼은 콜로이드 및 박테리아와 같은 마이크로 크기의 물체를 PDMS 기판에 규정된 공간 배열로 패터닝할 수 있게 합니다. 미세 유체학이 제공하는 환경 조건과 sCAPA 기술로 부여된 미세 메트릭 정밀도로 세포를 패턴화하는 능력은 미래의 생리학 및 생태 연구를 위한 매우 유망한 플랫폼입니다.
이 작품에 제시된 실험에서 실리콘 마스터는 재료표에 보고된 포토레지스트를 사용하여 실현되었다. 그러나 PDMS 성형으로 설명되고 사용할 수 있는 크기 범위에서 피처를 생성하는 데 적합한 모든 포토레지스트를 사용할 수 있습니다. 마이크로채널 금형을 준비하는 데 사용되는 3D 프린팅 수지도 마찬가지입니다. 설명된 치수의 특징을 생성할 수 있고 PDMS 성형과 호환가능한 모든 수지도 사용될 수 있다.
이 프로토콜에서, 미세 유체 칩을 70°C에서 5일 동안 저장하면 Tween 20이 세균 또는 ...

단일 미생물의 공간 패터닝, 특히 미세 유체 장치와 같은 환경 조건을 완전히 제어 할 수있는 실험 분야 내에서 광범위한 맥락에서 매우 바람직합니다. 예를 들어, 미생물을 정규 배열로 배열하면 많은 수의 개별 세포와 그들의 성장, 생리학, 환경 자극에 대한 반응의 유전자 발현 및 약물 감수성에 대한 연구의 정확한 이미징을 허용할 것입니다. 또한 세포 통신(예를 들어, 쿼럼 센싱), 교차 공급(예를 들어, 조류 세균 공생증) 또는 길항성(예를 들어, 알로파증)으로 연구에 특히 관심이 있는 세포 상호 작용을 연구할 수 있으며, 서로 에 비해 세포의 공간 국산화를 완전히 제어할 수 있습니다. 세포 생리학 및 진화 연구1, 세포 세포 상호 작용 연구2, 표현형 분화 스크리닝3, 환경 모니터링4 및 약물 스크리닝5 는 이러한 정량적 단일 세포 분석을 달성 할 수있는 기술로부터 크게 혜택을 누릴 수있는 분야 중 하나입니다.
단일 세포를 분리하고 처리하기 위한 몇 가지 전략이 최근 몇 년 동안 제안되었으며, 홀로그램 광학 트랩6 및 이질표면 기능화 방법7,8,9,10 ~ 단일 세포 chemostats11 및 액적 미세 유체12. 이러한 방법은 기술적으로 매우 까다롭거나 세포 생리학에 영향을 미치며 장기간 연구할 수 있는 미생물을 패턴화하는 고처리량 플랫폼을 제공하지 못하여 단일 세포 해상도, 완전한 광학 액세스 및 환경 조건에 대한 제어를 보장합니다. 이 논문의 목표는 모세관 보조 어셈블리를 통해 PDMS 표면의 소정의 공간 배열로 미세 메트릭 정밀도로 박테리아를 패턴화하는 플랫폼을 설명하는 것입니다. 이 플랫폼은 미생물의 정밀하고 유연한 공간 패터닝을 허용하고 미세유체 특성 덕분에 환경 조건에 대한 완전한 광학 액세스 및 제어기능을 가능하게 합니다.
이 플랫폼의 이면에 있는 기술은 최근 몇 년 동안 개발된 조립 기술으로, 미세유체 플랫폼에 통합된 sCAPA13,14,15(순차 모세혈관 지원 입자 조립)입니다. 증발하는 액체 액적의 반월 상연은, 미세유체 채널 내부의 패턴 폴리디메틸실록산(PDMS) 기판을 후퇴시키면서, 액체에 매달린 개별 콜로이드 입자를 기판에 미세하게 변형된 미세메트릭 우물(도 1A)으로 트랩하는 모세관력을 발휘한다. 일시 중단된 입자는 먼저 대류 전류에 의해 공기-액체 인터페이스로 이송된 다음 모세관에 의해 트랩에 배치됩니다. 움직이는 반월상 연골에 의해 가해지는 모세관력은 입자 상호 작용에 관여하는 힘에 비해 더 큰 규모로 작용합니다.
따라서, 어셈블리 메커니즘은 입자의 재료, 치수 및 표면 특성에 의해 영향을 받지 않는다. 입자 농도, 반월상 연골의 속도, 온도 및 서스펜션의 표면 장력과 같은 파라미터는 패터닝 공정의 수율에 영향을 미치는 유일한 파라미터입니다. 독자는 13,14,15에서 패터닝 공정에 앞서 언급한 매개 변수의 영향에 대한 자세한 설명을 찾을 수 있습니다. 원래 sCAPA 기술13,14,15에서, 콜로이드 패터닝 공정은 개방형 시스템에서 수행되었고 템플릿을 가로질러 서스펜션을 구동하기 위해 고정밀 압전 단계가 필요했습니다. 이 플랫폼은 다른 전략을 악용하고 제어 된 환경에서 일반적으로 미세 유체에 사용되는 표준 장비로 패터닝을 수행 할 수 있으므로 샘플을 오염시킬 위험을 최소화합니다.
이 미세 유체 플랫폼은 먼저 콜로이드 입자에 최적화되어 불활성 입자의 정기적 인 배열을 만든 다음 박테리아에 성공적으로 적용되었습니다. 두 미세 유체 플랫폼은 이 백서에 설명되어 있습니다(그림 1B, C). 프로토콜에 기재된 대부분의 준비 단계 및 실험 장비는 두 응용 프로그램에 대해 공통적입니다(그림 2). 콜로이드 패터닝을 보고하여 이 기술을 사용하여 동일한 표면에서 여러 순차 적 기탁을 수행하여 복잡하고 다중 물질적인 패턴을 만들 수 있음을 입증합니다. 특히, 트랩의 형상 및 충진 시퀀스에 의해서만 지시된 특정 형상 및 컴포지션을 가진 콜로이드 어레이를 형성하기 위해 각 단계에 대해 트랩당 하나의 단일 입자가 증착되었다. 세균 패턴에 관해서는, 단일 기탁이 설명되어 트랩 당 하나의 박테리아가 증착됩니다. 일단 세포가 표면에 패턴화되면, 미세 유체 채널은 세균 성장을 촉진하기 위해 매체로 플러시된다, 어떤 단일 세포 연구의 예비 단계.

<table><tbody><tr><td>Alcatel AMS 200SE I-Speeder</td><td>Alcatel Micro Machining System</td><td></td><td>깊은 반응성 이온 교환 시스템</td></tr><tr><td>Alconox</td><td></td><td></td><td>세제</td></tr><tr><td>AZ400K 현상액</td><td>MicroChemicals</td><td>AZ400K</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 mL 주사기 (Luer-Lock)</td><td>BD</td><td>300912</td><td>신선한 Lysogeny 국물을 미세유체 채널로 플러시하는 데 사용됩니다.</td></tr> 박스 <tr><td>인큐베이터</td><td>수명 </td><td>채널의 균일하고 일정한 온도를 보장하기 위해 사용되는</td>이미징 서비스 <td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>하룻밤 동안 매질한 배지를 최소한의 새 배지로 교체하는 데 사용</td></tr><tr><td>원심분리기 바이알</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>CETONI Base 120</td><td>CETONI GmbH</td><td></td><td>주사기 펌프</td></tr><tr><td>직경 0.98 &micro의 형광 PS 입자; m (red)</td><td>microParticles GmbH</td><td>PS-FluoRed-Fi267</td><td></td></tr><tr><td>직경 1.08 &micro의 형광 PS 입자; m (녹색)</td> <td>microParticles GmbH</td><td>PS-FluoGreen-Fi182</td><td></td></tr><tr><td>직경 2.07 &micro의 형광 PS 입자; m (녹색)</td> <td>microParticles GmbH</td><td>PS-FluoGreen-Fi183</td><td></td></tr><tr><td>직경 2.08 &micro의 형광 PS 입자; m (red)</td> <td>microParticles GmbH</td><td>PS-FluoRed-Fi180</td><td></td></tr><tr><td>Gigabatch 310 M</td><td>PVA TePla</td><td></td><td>플라즈마 처리에 사용 10cm 실리콘 웨이퍼</td></tr><tr><td>H401-T-CONTROLLER</td> 가열 <td>유리판</td><td></td> H601-NIKON-TS2R-GLASS <td></td></tr><tr><td></td><td>Okolab</td><td></td><td>가열 유리판</td></tr><tr><td>하이델베르크 DWL 2000</td><td>하이델베르크 기기</td><td></td><td>UV 직접 레이저 작가</td></tr><tr><td>인슐린 주사기, U 100, 루어</td><td>Codan Medical ApS</td><td>CODA621640</td><td>1 mL 주사기는 패터닝 공정 중 액체 현탁액을 회수하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>Klayout</td><td>Opensource</td><td></td>는 <td>실리콘 마스터</td></tr><tr><td>LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>244610</td><td>미세유체 채널 Masterflex로 플러시된 용원 국물</td></tr><tr><td> 전송 튜빙</td><td>Masterflex</td><td>HV-06419-05</td><td>0.020'' ID, 0.06'' OD</td></tr><tr><td>MOPS(10x)</td><td>Teknova</td><td>M2101</td>은 <td>milliQ 물로 10배 희석되어</td></tr> 금형 OPTIspin SB20 ATM 그룹을 <tr><td>설계하는 데 사용되는</td>야간 매체<td></td><td></td> Nikon Eclipse Ti2 Nikon Instruments 현미경 openSCAD Opensource <td></td></tr> 를 대체하는 데 사용됩니다.<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>51-0002-01-00</td><td>스핀 현상액</td></tr><tr><td>플라즈마 챔버 Zepto</td><td>Diener 전자</td><td>ZEPTO-1</td>은 <td>템플릿과 마이크로 채널을 플라즈마 처리하여 결합하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>포지티브 포토 레지스트 AZ1505</td><td>MicroChemicals</td><td>AZ1505</td><td></td></tr><tr><td>인산 칼륨 이염기</td><td>성 시그마 Aldrich</td><td>P3786</td>이 <td>MOPS 1x</td></tr><tr><td>Prusa 경화 및 세탁기 CW1S</td><td>Prusa</td><td></td><td>에 추가되었습니다.모든 폴리머가 경화되고 경화되지 않은 폴리머가 금형에서 제거되도록 하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>3D 프린팅용 UV 감광성 405nm 액체 수지</td></tr><tr><td>Prusa SL1 3d 프린터</td><td>Prusa는</td><td></td><td>금형 인쇄에 사용</td></tr><tr><td>Scale</td><td>VWR-CH</td><td>611-2605</td><td>PDMS 혼합물 무게에 사용</td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼(10cm)</td><td>Silicon Materials Inc.</td><td></td><td>N/포스 < 100> 1-10 & 오메가; cm</td></tr><tr><td>S&uuml; ss MA6 Mask aligner</td><td>SUSS MicroTec Group</td><td></td><td>은 크롬 유리 마스크와 기판을 정렬하고 기판</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>실리콘 엘라스토머 키트를</td></tr> 노출시키는 데 사용됩니다. 경화제 <tr><td>Techni Etch Cr01</td><td>Technic</td><td></td><td>chromium etchant</td></tr><tr><td>Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 실란</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931</td><td>3D 프린팅 금형을 실리아화하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P1379</td>는 <td>패터닝 과정에서 최적의 후퇴 접촉각을 보장하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>Veeco Dektak 6 M</td><td>Veeco</td><td></td><td>프로파일 로미터</td></tr><tr><td>VTC-100 진공 스핀 코터</td><td>MTI 공사</td><td></td><td>진공 스핀 코터</td></tr></tbody></table>

순차모세혈관 보조 어셈블리를 통한 미생물 및 미생물 입자의 패터닝

Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly

정의된 공간 배열로 미생물의 통제된 패터닝은 미생물 생리학 및 상호 작용의 연구를 포함하여 생물학 응용의 넓은 범위에 대한 독특한 가능성을 제공합니다. 가장 간단한 수준에서, 미생물의 정확한 공간 패터닝은 개별 세포의 많은 수의 믿을 수 있고 장기적인 화상 진찰을 가능하게 하고 거리 의존적인 미생물 상호 작용을 정량적으로 공부하는 기능을 변환할 것입니다. 보다 유일하게, 미세유체 기술이 제공하는 바와 같이 정확한 공간 패터닝과 환경 조건에 대한 완전한 제어를 결합하면 미생물 생태학의 단일 세포 연구를 위한 강력하고 다재다능한 플랫폼을 제공할 것입니다. 
이 논문은 미생물 채널 내에서 다재다능하고 사용자 정의한 미생물 패턴을 생성하는 미세 유체 플랫폼을 제공하여 장기적이고 높은 처리량 모니터링을 위한 완벽한 광학 액세스를 제공합니다. 이 새로운 미세 유체 기술은 모세혈관 보조 입자 조립을 기반으로 하며 미세 유체 채널 내부의 증발 현탁액의 제어된 모션으로 발생하는 모세관력을 악용하여 폴리디메틸실록산(PDMS) 기판에 미세매단된 트랩 배열에 개별 미세 크기의 물체를 증착합니다. 순차 적 기탁은 트랩의 형상및 충진 시퀀스에 의해서만 지시되는 단일 또는 다중 유형의 마이크로 크기의 객체의 원하는 공간 레이아웃을 생성합니다. 
플랫폼은 다양한 치수와 재료의 콜로이드 입자를 사용하여 보정되었습니다 : 그것은 다양한 콜로이드 패턴을 생성하고 갇힌 입자의 표면 기능화를 수행하는 강력한 도구로 입증되었습니다. 더욱이, 플랫폼은 모델 박테리아로 대장균 세포를 사용하여 미생물 세포에서 시험되었다. 수천 개의 개별 세포가 표면에 패턴화되었고 시간이 지남에 따라 성장을 모니터링했습니다. 이 플랫폼에서 단일 세포 증착 및 미세 유체 기술의 결합을 통해 미생물의 기하학적 패턴화와 환경 조건의 정밀한 제어를 모두 허용합니다. 그것은 이렇게 단 하나 세균의 생리학 및 예비 실험에 의해 도시된 세균 성 상호 작용의 생태로 창을 엽니다.

모세혈관 보조 어셈블리를 이도하여 콜로이드 입자와 박테리아를 PDMS 템플릿에 미세하게 제작된 트랩으로 패턴화하는 미세유체 플랫폼이 개발되었습니다. 두 개의 서로 다른 채널 지오메트리는 모세관 보조 어셈블리를 통해 콜로이드와 박테리아의 패터를 최적화하도록 설계되었습니다. 첫 번째 채널 지오메트리(그림 1B)는 물리적 장벽이 없는 3개의 23mm 길이의 평행 섹션으로 구성됩니다. 측면의 두 섹션은 폭 5mm, 높이 1mm이며 중앙 부분은 폭 7mm, 높이는 500 μm입니다. 이 디자인은 후퇴 볼록 모양의 반월 상연으로 잘 정의 된 움직이는 물방울을 유지하는 데 도움이됩니다. 이 플랫폼의 작동 원리는 Pioli 등 al.11에 의해 자세히 설명됩니다. 실험이 박테리아 배양의 경우와 같이 측면 채널을 채우는 것이 필요한 경우 공기 주머니가 일반적으로 형성됩니다. 이러한 이유로 채널이 매체로 플러시될 때 충진 프로세스를 간소화하는 두 번째...

우리는 미세 유체 플랫폼에서 모세혈관 보조 어셈블리를 사용하여 박테리아 및 콜로이드와 같은 액체에 매달려있는 미세 크기의 물체를 폴리디메틸실록산 기판에 규정 된 배열로 패턴화하는 기술을 제시합니다.

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, ...

이 방법은 미세유체 채널 내에서 미생물의 사용자 정의 패턴을 생산할 수 있습니다. 일단 패턴화되면, 미생물은 그들의 장기 생리학 및 높은 처리량과의 상호작용을 평가하기 위해 모니터링될 수 있다. 모세관력의 사용은 패터닝을 위한 비특이적 경로를 가능하게 하며, 이는 다양한 종류의 재료에 걸쳐 적용될 수 있다.예를 들어, 콜로이드 입자 및 박테리아. 또한, 그것은 관심있는 재료의 공간 배열의 절묘한 제어와 큰 배열을 생성 할 수 있습니다. 현재까지 우리는 콜로이드 입자와 미생물 세포에 대한 방법을 테스트하고 적용했습니다.결과적으로 재료 공학 및 약물 스크리닝과 같은 정량적 단일 세포 분석이 필요한 분야에서 응용 프로그램을 찾을 수 있습니다. 시작하여, 엘라스토머를 그의 가교제와 혼합함으로써 PDMS 혼합물을 제조한다. 그런 다음 혼합물을 격렬하게 저어 기포가 형성되고 PDMS 혼합물이 불투명하게 보일 때까지 두 성분을 균일하게 혼합하십시오.이제 모든 기포가 제거되고 혼합물이 다시 투명하게 보일 때까지 진공 데시케이터에서 혼합물을 탈기하십시오. 마이크로유체 칩의 400 마이크로미터 두께의 템플릿 플로어를 얻기 위해, 혼합물 3 그램을 실리콘 마스터 상에 붓고 스핀 코터 상에 실리콘 마스터를 놓고 5초 동안 21배 G에서, 10초 동안 54배 G에서 스핀 코트를 한다. 앞서 설명한 바와 같이 포획된 기포를 제거하기 위해 다시 가스를 제거한다.20 그램의 PDMS 혼합물을 3D 인쇄 된 몰드에 부어 미세 유체 칩의 지붕 역할을하는 마이크로 채널을 만들고 앞서 설명한 것처럼 30 분 동안 탈기하십시오. 실리콘 웨이퍼와 3D 프린트된 몰드를 섭씨 70도에서 적어도 두 시간 동안 구워낸 다음, 3D 프린트된 몰드의 윤곽선을 따라 PDMS를 절단하고 벗겨냅니다. 마이크로 채널 주위에 블레이드로 PDMS를 자르고 미세 유체 채널의 입구 및 출구 역할을하는 구멍을 펀치하십시오.이제 PDMS를 잘라 실리콘 마스터에서 떼어내고 PDMS 층을 템플릿 위에 결합될 미세유체 채널과 동일한 치수의 작은 조각으로 자릅니다. 템플릿과 마이크로 채널을 1 % 세제 용액을 사용하여 5 분 동안 부드럽게 문지르고 탈 이온수로 헹구십시오. 다음으로, 템플릿과 마이크로 채널을 이소프로판올로 헹구고 탈이온수로 헹구십시오.이제 템플릿과 마이크로 채널을 실온에서 한 바에서 압축 공기로 한 분 동안 건조시킵니다. 템플릿과 마이크로채널을 플라즈마 클리너에 놓고 접합면을 위로 향하게 합니다. 플라즈마 클리너를 켠 후 플라즈마는 템플릿과 마이크로 채널을 40 초 동안 처리 한 다음 플라즈마 클리너에서 꺼내어 템플릿 상단의 마이크로 채널을 즉시 결합합니다.PDMS 소수성 회복을 보장하기 위해 미세 유체 칩을 섭씨 70도의 오븐에 5 일 동안 보관하십시오. 실험 당일, 실험 몇 시간 전에 박스 인큐베이터를 섭씨 37도에 놓은 다음 현미경 스테이지에 주사기 펌프와 가열 된 유리 플레이트를 설치하여 박스 인큐베이터와 동일한 온도를 설정하십시오. 실험 90분 전, 미세유동 칩을 100% 에탄올로 채워진 용기에 넣고 10분 이상 100% 에탄올로 채널을 플러시한 다음, 미세유동 칩을 진공 데시케이터에 넣고 30분 이상 탈기한다.이제 에탄올을 증류수로 교환하고 칩을 적어도 30 분 동안 진공 처리하십시오. 미세유체 칩을 섭씨 70도의 오븐에 넣고 10분 동안 채널에 남아 있는 액체의 흔적을 제거하였다. MOPS 배지 1 밀리리터를 원심분리 바이알에 피펫팅하고 0.132 몰 인산칼륨 10 마이크로리터를 첨가한다.100 마이크로리터의 분취량을 원심분리 바이알에 넣고 2분 동안 2, 300배 G에서 배양물을 원심분리한다. 펠렛을 0.015%의 트윈 20 및 0.01%의 인산칼륨과 함께 1밀리리터의 신선한 MOPS 배지에 재현탁시키기 위해 상청액을 부드럽게 폐기하고 박테리아 현탁액을 1밀리리터 주사기에 로딩한다. 주사기와 튜브 연결을 고정하려면 바늘을 튜브에 직접 삽입하십시오.이제 주사기를 시린지 펌프에 장착하고 서스펜션이 트랩으로 템플릿 영역을 덮을 때까지 채널의 상류 부분에 위치한 입구를 통해 현탁액을 미세 유체 칩에 주입하십시오. 주사기 펌프를 분당 0.07 ~ 0.2 마이크로 리터의 유량으로 설정하여 박테리아 현탁액을 회수하고 현미경 소프트웨어를 통해 패터닝 과정을 모니터링하십시오. 일단 템플릿이 세포로 패턴화되면, 인출 유속을 증가시켜 미세유체 채널을 빠르게 비우고 이전에 적어도 30분 동안 탈기하고 섭씨 30도에서 예열된 신선한 LB로 플러시합니다.이제 주사기 펌프를 분당 두 마이크로 리터의 유속으로 설정하여 채널을 부드럽게 플러시하십시오. 채널이 채워지면 다시 유량을 증가시킵니다. 원하는 배율과 시간 간격으로 성장하는 박테리아의 이미지를 획득하십시오.0.015%Tween 20 수용액 900 마이크로리터를 원심분리 바이알에 넣은 다음 100 마이크로리터의 피펫을 피펫으로 하여 원래의 콜로이드 현탁액을 넣었다. 현탁액을 1분 동안 13, 500배 G에서 원심분리하고, 상청액을 수성 Tween 20 용액으로 부드럽게 교체한다. 콜로이드 현탁액을 하나의 밀리리터 주사기에 넣고 미세 유체 튜브를 통해 주사기를 칩에 연결하십시오.현탁액을 채널의 상류 부분의 중앙 섹션 내에 위치한 입구를 통해 미세유체 칩에 주입하고 템플릿이 덮일 때까지 현탁액을 점차적으로 밀어 넣습니다. 콜로이드 현탁액을 분당 0.07 내지 0.2 마이크로리터의 유속으로 인출하고 현미경 소프트웨어를 통해 패터닝 공정을 이미지화한다. 메니스커스가 템플릿의 끝에 빠르게 도달하면 유속을 높입니다.직선 채널 기하학은 분석된 5, 000개의 트랩 중 83%를 증착한 형광 에스케리치아 콜리 균주의 고정상 세포 패턴으로 이용되었다. 패턴화된 박테리아는 채널이 신선한 LB로 채워졌을 때로부터 1.5시간 이내에 상이한 시간에 성장을 재개하였다. 일단 성장이 재개되면, 단일 박테리아 세포는 표층이 형성되고 단일 세포 분해능이 손실 될 때까지 팽창하는 개별 콜로니를 형성하기 시작했습니다. 55, 000 트랩에 걸쳐 실시된 분석에 따르면 두 마이크로미터 직경의 입자와 하나의 마이크로미터 직경으로 만들어진 녹색 적색 이량체가 각각 분석된 트랩의 93%와 89%에서 형성되었다.그리고 녹색 - 적색 - 녹색 트리머는 함정의 52 %에서 형성되었습니다. 패턴화된 입자 사이의 거리는 반대 방향으로 두 개의 증착을 수행함으로써 정밀하게 제어될 수 있으며, 따라서 이러한 입자를 각 트랩의 반대쪽 말단에 포획한다. 패터닝 프로세스 중에 응축을 방지하기 위해 템플릿 전체에 걸쳐 균일한 온도를 보장하는 것이 중요합니다.이를 위해 우리는 템플릿 아래에 가열 된 유리 판을 놓고 상자 인큐베이터와 동일한 온도로 설정합니다. 이 방법은 정량적 단일 세포 분석을 수반하는 다양한 생물학적 연구에 사용될 수 있다. 독특한 장점은 동일한 실험 영역 내에서 큰 통계를 제공하는 수천 개의 셀을 패터닝할 수 있는 높은 처리량 특성입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Engineering

공학

출처: Pioli, R., et al., 순차적 모세관 보조 조립을 통한 미생물 및 미립자의 패턴화. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 무탄소 현탁액 및 제어된 흐름을 사용하여 미세유체 트랩에서 단일 형광 태그가 지정된 대장균(E. coli) 세포를 캡처한 다음 영양분을 첨가하여 미세 콜로니의 성장 및 형광 이미징을 유발하는 방법을 보여줍니다.

단일 세포 박테리아 성장의 미세유체 패터닝 및 형광 기반 추적

이 프로토콜은 그런가 2 세포 패터닝 미세 호환 방법을 설명합니다. 미리 정의 된 파릴 렌-C 디자인은 포토 리소그래피의 SiO2 웨이퍼에 인쇄되어 있습니다. 혈청 (또는 다른 정품 인증 솔루션)와 함께 배양 한 다음 세포에 특이 적으로 부착 (과의 적합성에 따라 성장) 그런가 2 지역으로 격퇴하는 동안 기본 파릴 렌-C.

포토 리소그래피 정의 파릴 렌-C에 대한 세포 패터닝 : 그런가<sub&gt; 2</sub&gt; 기판

지원되는 지질 이중층과 천연 막 입자는 세포막의 특성을 근사 할 수 있고 분석 다양한 전략에 통합 될 편리한 시스템이다. 여기에서 우리는 지원 지질 이중층 코팅 된 SiO2로 비즈, 인지질 막 소포 또는 천연 입자로 구성된 마이크로 어레이를 제조하는 방법을 보여준다.

스퀴지 기반의 조립 방법과 생체막 마이크로 어레이의 형성

여기에서는 모세관 기반 원심 미세유체 장치를 사용하여 크기 제어 가능한 단분산 W/O(Water-in-Oil) 미세방울에 대한 간단한 생산 방법을 보여줍니다. 이 방법은 소량의 시료만 필요하며 고수율 생산이 가능합니다. 우리는 이 방법이 신속한 생화학 및 세포 분석에 유용할 것으로 기대합니다.

단 분산 미세 방울의 크기가 제어 형성을위한 모세관 기반 원심 미세 유체 장치

우리는 폴리디메틸실록산(PDMS)에서 두 마이크로채널 사이에 나노유체 접합을 생성하기 위해 실리카 콜로이드 나노입자의 간단한 자기 조립 기술을 제안합니다. 이 기술을 사용하여 기공 크기가 ~45nm인 나노다공성 비드 멤브레인을 마이크로채널 내부에 구축하고 DNA 샘플의 동전기 사전 농축에 적용했습니다.

콜로이드 입자의 자기 조립 과정을 통해 PDMS 미세 유체 칩의 하위 50 Nm의 나노 유체 접합 만들기

이 논문은 내피 세포의 생리 학적 특성을 요점을 되풀이 미세 혈관을 설계하는 사출 성형 방법을 제공한다. 미세 유체 기반의 공정은 흐름, 세포 성분, 형상, 생화학 그라디언트로 테일러 조건과 특허 3 차원 혈관 네트워크를 생성합니다. 제조 공정 및 잠재적 응용 예들이 설명된다.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

미생물 군집의 개발은 환경 구조, 구성원의 풍부 성, 형질 및 상호 작용을 포함하는 여러 요소의 조합에 달려있다. 이 프로토콜은 틈새 크기 및 감금과 같은 핵심 요소가 근사 될 수있는 femtoliter 우물에 포함 된 수천 개의 공동체를 동시에 추적하기위한 합성, 미세 제작 환경을 설명합니다.

마이크로 웰 어레이 플랫폼 내 미생물 공동체 개발의 구성 및 추적

여기서 우리는 DNA 프로그래밍 된 접착력을 사용하여 단일 세포 해상도에서 마이크로 패턴 세포에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 벤치탑 포토리소그래피 플랫폼을 사용하여 유리 슬라이드에 DNA 올리고뉴클레오티드 패턴을 만든 다음 상업적으로 사용할 수 있는 보완적인 올리고뉴클레오티드로 세포막을 라벨로 표시합니다. 올리고스의 혼성화는 프로그램된 세포 접착을초래한다.

DNA를 사용하여 세포의 간단하고, 적당한, 모듈식 패터닝

물방울 분석은 분석 화학, 효소 진화 및 단일 세포 분석에 유용하지만 일반적으로 액적을 형성하기 위해 미세 유체학이 필요합니다. 여기서는 액적 저술을 수행하기 위한 미세유체없는 접근 방식인 입자 템플릿 유화제를 설명합니다.

입자 템플릿 유화제를 통해 미세 유체가 없는 물방울 분석을 가능하게 합니다.

우리는 소프트 하이드로젤 상의 세포외 매트릭스 단백질의 도트 어레이의 단일 감산 패터닝 단계를 사용한 마이크로접촉 프린팅을 기반으로 세포 견인력을 측정하는 표준 방법에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 세포 군집 모양을 제어하는 데 필수적인 섬 패턴을보다 간단하고 일관되게 제작할 수 있습니다.

마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성

이 프로토콜은 자기 아르키메데스 효과(Magnetic Archimedes effect)를 기반으로 하는 잉크가 없고, 라벨이 없고, 기판에 독립적이며, 처리량이 많은 세포 패터닝 방법을 설명합니다.

마그네틱-아르키메데스 전략을 사용한 세포 패터닝

배우세요 미세유체 채널에서 모세관력을 이용해 세균과 콜로이드 입자를 사용자 정의 패턴으로 배열하는 방법을. 장기 생리학 및 상호작용을 고처리량으로 모니터링할 수 있습니다.

순차모세혈관 보조 어셈블리를 통한 미생물 및 미생물 입자의 패터닝

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