Name: 포토 리소그래피 정의 파릴 렌-C에 대한 세포 패터닝 : 그런가 2 기판 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 배우세요 포토리소그래피를 이용한 SiO₂ 기판의 parylene-C 세포 패터닝 방법을. 이 기술은 생물학적 오염 없이 세포 행동을 연구할 수 있는 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공합니다.

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이 작품은 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 임상 박사 교제 (ECAT)에 의해 지원되었다.

1. 그런가 2 파릴 렌 패턴의 제작 : 프로세스 흐름 (그림 1 참조) <ol><li> 디자인 읽을 수있는 레이아웃 편집기 소프트웨어 패키지 / CIF (Caltech의 중간 형태) 또는 GDS-II (그래픽 데이터베이스 시스템 II) 파일을 작성을 사용하여 파릴 렌-C 구성을 원하는. CIF와 GDS-II는 집적 회로 작품 레이아웃에 대한 업계 표준 파일 형식입니다. </li><li> 위원회의 포토 마스크가 적절한 마이크로 전자 공학 시설에 제조 또는 시설이 존재하는 경우 사내합니다. </li><li> 200 nm의 그런가 2 층 (작은 자리 분광 반사 계와 두께를 확인) 생산하는 40 분 동안 950 ° C에서 대기 가로로 (H 2 1.88 SLM 및 O 2 1.25 SLM)에서 실리콘 웨이퍼를 산화. </li><li> 실란 접착 촉진제 프라임 산화 ​​된 웨이퍼. 이제 구체적으로 파릴 렌을 입금하도록 설계된 진공 증착 시스템을 사용하여 이량 체의 1.298 ㎚ / MG의 속도로 22 ° C에서 파​​릴 렌-C을 예금. (100)nm 두께의 파릴 렌-C 코팅은 아래의 모든 예제를 사용 하였다. </li><li> 적합한 포토 레지스트 코팅 시스템을 사용 파릴 렌 코팅 웨이퍼상의 다음 예금 헥사 메틸 디 실라 잔 (HMDS) 접착 촉진제. </li><li> 지금 적용하면서 30 초 동안 4000 rpm에서 웨이퍼를 스핀 긍정적 상기와 같은 포토 레지스트 코팅 시스템을 사용하여, (1 μM의 이론적 인 두께로 인해 발생하는) 포토 레지스트. </li><li> 소프트 90 ℃에서 60 초 동안 웨이퍼를 구워 </li><li> 마스크 얼 라이너로 웨이퍼와 premanufactured 포토 마스크를 모두 넣습니다. </li><li> 원하는 파릴 렌-C 구성의 UV 부정적인 표현으로 포토 레지스트 코팅 된 웨이퍼를 노출합니다. </li><li> 110 ℃에서 60 초 동안 노출 된 웨이퍼를 구워 </li><li> 모든 적절한 현상액으로 현상하여 웨이퍼로부터 포토 레지스트를 노광 제거한다. </li><li> 보호되지 않은 파릴 렌을 에칭. 산소 플라즈마 에칭은 50 mTorr의 챔버 압력에서 시스템 (49 SCCM의 O 2, 13.56 MHz에서 100 W RF 전력, 및를 사용기본 그런가 2를 공개하는 100 ㎚ / 분)의 에칭 속도. </li><li> 적절한 다이 싱 톱 (스핀들 속도 30,000 RPM, 이송 속도 7mm / 초)를 사용하여 웨이퍼를 주사위. </li><li> 탈 H 2 O의 칩을 씻어 질소로 건조한다. </li><li> 상점 칩 (무기한) 먼지가없는 상자에 필요한 때까지. </li></ol> 2. 칩 청소 및 활성화 : 프로토콜 <ol><li> 10 초 동안 아세톤으로 세척하여 칩에서 잔류 포토 레지스트를 제거합니다. </li><li> 탈 증류수 H 2 O 3 배에 씻어. </li><li> 신선한 피라니아 폰산 (5:3 30 % 과산화수소의 비율과 98 % 황산)을 구성한다. 주의 : 큰 관심과 함께 피라 산을 준비합니다. 또한, 매우 강력한 산화제이다 강산성이고, 황산과 과산화수소 수를 혼합하는 발열 반응이다. 산 흄 후드에서이 단계를 수행합니다. 2 분의 피라 산을 혼합 한 후 통과하지만 20 분 이내에 사용할 수 있습니다. </li><li> PI에 침수 깨끗하고 에칭 칩10 분 동안 ranha 산. </li><li> 린스 칩 탈 H 2 O의 3 배 및 멸균 배양 접시에 전송합니다. </li><li> 이제 셀 패터닝 칩을 활성화합니다. 예를 들어, 6 - 웰 플레이트에 웰 당 두 개의 칩을 추가하고 완벽하게 모든 칩을 몰입 할 수 있도록 다음 소 태아 혈청 2 ㎖를 추가합니다. 층류 조직 배양 후드에서 무균 조건 하에서이, 이후의 모든 세포 배양 단계를 수행한다. </li><li> 37 ℃에서 3-12 시간에 대한 혈청 칩을 품어 참고 : 단계 2.4-2.7가 순차적으로 단계 사이의 지연없이 수행해야합니다. 피라니아 처리가 세포 패터닝 인해 그런가 2 지역에서 감소 된 세포의 반발에 손상 후 혈청 활성화는 ≥ 24 시간 지연됩니다. 구체적인 세포 접착 단백질을 함유 대체 활성화 용액 소 태아 혈청 대신에 사용될 수있다. 이러한 솔루션은 두 개의 대비되는 기판 (예를 들면 대표적인 결과를 참조)의 세포 접착 특성을 변화. </li&gt; </ol> 3. 온 - 칩 도금 세포주 : 프로토콜 <ol><li> 정품 인증 솔루션에서 칩을 제거하고 행크의 균형 소금 용액에 10 초에 한 번 세척한다. </li><li> 물론 문화에 칩을 넣고 평소 성장 미디어에서 정지로 선택 세포 유형을 도금. 최적의 셀 도금 밀도는 세포의 종류와 온 - 칩 파릴 렌-C의 기하학적 인 패턴에 모두 의존한다. 5 × 104 세포 / ml의 밀도는 분별 출발점이다. </li><li> 이미징은 세포 패터닝하지만 살아있는 세포 행동은 쉽게 적절한 릴레이 렌즈와 해부 현미경과 디지털 카메라를 사용하여 평가 될 수있다에 대한 기본 동기에 맞게 조정됩니다. </li></ol>

<ol><li>Zhi, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Gold+Surface+Approach+for+Fabrication+and+Interrogation+of+Glycoarrays%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">A Versatile Gold Surface Approach for Fabrication and Interrogation of Glycoarrays.</a> ChemBioChem. 9, 1568-1575 (2009).</li>
<li>Michelini, E., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staying+alive%3A+new+perspectives+on+cell+immobilization+for+biosensing+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Staying alive: new perspectives on cell immobilization for biosensing purposes.</a> Anal. Bioanal. Chem. 402 (5), 1785-1797 (2012).</li>
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<li>Bacakova, L., Filova, E., Parizek, M., Ruml, T., Svorcik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+cell+adhesion%2C+proliferation+and+differentiation+on+materials+designed+for+body+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Modulation of cell adhesion, proliferation and differentiation on materials designed for body implants.</a> Biotechnol. Adv. 29 (6), 739-767 (2011).</li>
<li>Bacakova, L., Svorcik, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBacakova%2C+L+%22Cell+colonization+control+by+physical+and+chemical+modification+of+materials.+In%3A+Cell+growth+process%3A+new+research%22">Cell colonization control by physical and chemical modification of materials. In: Cell growth process: new research</a>. Kimura, D. , Nova Science Publishers Inc. New York. 5-56 (2008).</li>
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<li>Maher, M., Pine, J., Wright, J., Tai, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurochip%3A+a+new+multielectrode+device+for+stimulating+and+recording+from+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The neurochip: a new multielectrode device for stimulating and recording from cultured neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 87 (1), 45-56 (1999).</li>
<li>Martinoia, S., Bove, M., Tedesco, M., Margesin, B., Grattarola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+micro-+fluidic+system+for+patterning+populations+of+neurons+on+silicon+micro-+machined+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple micro- fluidic system for patterning populations of neurons on silicon micro- machined substrates.</a> J. Neurosci. Methods. 87 (1), 35-44 (1999).</li>
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<li>Michel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+molecular+assembly+patterning%3A+a+new+approach+to+micro-+and+nanochemical+patterning+of+surfaces+for+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Selective molecular assembly patterning: a new approach to micro- and nanochemical patterning of surfaces for biological applications.</a> Langmuir. 18 (8), 3281-3287 (2002).</li>
<li>Rajalingam, B., Selvarasah, S., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+static+and+dynamic+patterned+cocultures+using+microfabricated+parylene-C+stencils%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of static and dynamic patterned cocultures using microfabricated parylene-C stencils.</a> Lab Chip. 7, 1272-1279 (2007).</li>
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<li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., MacLeod, N. K., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+growth+of+neurons+and+glia+using+microfabricated+patterns+of+parylene-C+on+a+SiO2+background%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Guided growth of neurons and glia using microfabricated patterns of parylene-C on a SiO2 background.</a> Biomaterials. 30, 2048-2058 (2009).</li>
<li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+parylene-C+photooxidation+on+serum-assisted+glial+and+neuronal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Effects of parylene-C photooxidation on serum-assisted glial and neuronal patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 94, 47-58 (2010).</li>
<li>Delivopoulos, E., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+adhesion+and+growth+of+long+term+glial+and+neuronal+cultures+on+parylene-C%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Controlled adhesion and growth of long term glial and neuronal cultures on parylene-C.</a> PLoS One. 6 (9), (2011).</li>
<li>Hughes, M. A., Bunting, A., Cameron, K., Murray, A. F., Shipston, M. J. Modulating patterned adhesion and repulsion of HEK 293 cells on micro-engineered parylene-C/SiO2 substrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHughes%2C+MA+%22J.+Biomed.+Mat.+Res.+Mater.+A%22">J. Biomed. Mat. Res. Mater. A</a>. 101 (2), 349-357 (2013).</li>
<li>Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+human+hNT+neurons+patterned+on+parylene-C%2Fsilicon+dioxide+substrates%3A+Combining+an+accessible+cell+line+and+robust+patterning+technology+for+the+study+of+the+pathological+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

피라니아 산이 칩 침지뿐만 아니라 식사이 잔류 유기 물질을 제거 할뿐만 아니라, 기판 표면을 에칭한다. 이 소 태아 혈청 효과적인 활성화를 가능하게하는 열쇠입니다. 그렇게하지 ​​않으면 세포 패터닝을 방지하고 뿌리깊은 온 - 칩 세포 행동을 변경합니다. 피라니아 산으로 세척 한 후, 칩을 살균 할 필요가 없다. 실제로 자외선 노출에 의한 살균은 용량 의존적 13 셀 패턴을 훼손하기 위해 표시되었습니다. 케어는 포토 리소그래피 공정 후 모두 잔류 포토 레지스트를 씻어주의해야합니다. 지속 포토 레지스트 parylene-C/SiO 2 형상에 의해 결정 패턴을 무시 원치 않는 사이토 접착 층의 역할을 수행 할 수 있습니다. 특정 시약과 함께 위에서 설명 된 포토 리소그래피 공정을 사용하면 아세톤 효과적이다. 그러나, 포토 레지스트의 다른 유형은 다른 용매를 필요로 할 수있다. 의 다른 작풍의 영향과 성공을 평가하기 위해NT 제조 단계,이 대조 기판의 접촉각이 측정 될 수있다.도 2는 칩 활성화 프로세스 중에 발생하는 변화를 나타낸다. 그것은 혈청에있는 특정 접착제 반발 단백질 구성 요소가 궁극적으로 각각의 사이토 접착 또는 사이토 - 반발 특성을 발휘하는 파릴 렌 무늬의 칩을 사용하는 것이, 그러나, 가능성이 높습니다. 우리가 성공적으로 두껍고 얇은 두 파릴 렌 층을 사용하여 패터닝 한 비록 모든 대표 결과, 100 ㎚의 파릴 렌 두께 칩을 사용했다. 중요한 것은,이 포토 리소그래피, 에칭 기술은 여기에서 설명보다 파릴 구성 훨씬 더 입체적으로 제어 할 수 있습니다. 예를 들어, 포토 마스크의 조합을 이용하여, 그 혼합 두께 파릴 영역을 만드는 것이 가능하다. 이 세포 접착 / repul 단순히 지시 된 지역을 넘어 정의 된 세 가지 차원 지형 세포 배양을 만드는 방법을 엽니 다시온 잠재적 구조에 미세 유체 채널을 통합하는 수단을 제공. 도시 된 바와 같이, 그러나,이 패터닝 플랫폼은 보편적으로 세포 유형에 걸쳐 유효하지 않다. 때이 플랫폼에서 배양 다른 세포주, 그들의 다양한 세포 접착 분자 프로파일, 놀라지 다르게 동작합니다. 우리는 아직이 셀 패터닝 플랫폼을 뒷받침 혈청의 주요 구성 요소, 또는 무료 세포 막 수용체를 확인하지 못했습니다. 미래에 그렇게하면 그 유틸리티와 특이도를 확대 할 것을 약속드립니다. 예를 들어, &#39;비 패터닝&#39;세포주는 전적으로 필요한 접착 분자를 표현하도록 수정 등의 패터닝을 촉진 할 수있다.

합성 물질에 대한 세포 부착 및 패턴을 지시 메커니즘을 이해하는 것은 이러한 조직 공학, 약물 발견 및 바이오 센서 1-3의 제조와 같은 어플리케이션에 중요합니다. 많은 기술을 사용할 수 및 진화, 세포 접착에 영향을 미치는 수많은 생물 화학적 및 물리적 인자의​​ 각 복용 장점. 여기서는 처음에 마이크로 제조 목적을 위해 개발 프로세스를 이용하는 휴대 패터닝 기술을 설명한다. 따라서,이 플랫폼은 패터닝 플랫폼으로, 같은 다자간 환경 등의 마이크로 전자 기술의 다운 스트림 통합을 가능하게하기 위해 잘 배치됩니다. 세포막과 인접한 물질 사이의 인터페이스는 양방향하고 복잡하다. 생체 내에서, 세포 외 기질 단백질의 구조와 강도 및 세포 부착 수용체와의 상호 작용을 통해 세포 행동에 따라 영향을 제공한다. V에 마찬가지로 세포물리 화학적 영향도 접착력을 조절하는 동안 나이트로 단백질 4의 흡수 층을 통해 합성 기판과 상호 작용합니다. 예를 들어, 중합체 표면은 아세트산 또는 수산화 5로 처리함으로써 이온, 자외선 조사, 또는 에칭에 의해 (친수성) 기타 &quot;습윤성&quot;렌더링 할 수있다. 세포 패터닝 설립 방법은 이들과 다른 세포 부착 매개체의 활용. 예를 들면 6 인쇄, 잉크젯, 미세 접촉 7 스탬핑, 물리적 고정 8, 미세 유체 9, 실시간 조작 (10), 및 선택적 분자 조립 패턴 (SMAP) 11 (가) 있습니다. 각각의 특정 장점과 제한 사항이 있습니다. 우리의 작업의 핵심 드라이버는, 그러나, 미세 전자 기계 시스템 (MEMS)과 세포 패턴을 통합하는 것입니다. MEMS는 전기로 구동되는 매우 작은 기계 장치를 참조하십시오. 이 나노 상응 nanoelectromech과 중복anical 시스템. 이 개념은 반도체 전략이 마이크로에서 자리를 차지할 제조를 사용하는 경우에만 실제되었다. 반도체 전자에 대해 독자적으로 개발 한 미세 가공 기술은 실수로 예를 들면, 세포의 전기 생리학 등의 다른 용도로 유용한 것으로 밝혀졌다. 핵심 목표는 하류 (바이오 MEMS 디바이스의 형성) 고 충실도 셀 패터닝 공정과 같은 마이크로 전자 기술을 결합하는 것이다. 여러 기존과 달리 안정적이고 실용적인 세포 패터닝 기술은이 아이디어와 호환되지 않습니다. 예를 들어, 임베디드 마이크로 일렉트로닉스 나 바이오 센서의 정확한 정렬은 그들의 효능에 기초하지만, 이러한 마이크로 콘택트 스탬핑 기술을 사용하여 달성하기 매우 어렵다. 이 문제를 회피하기 위해, 우리는 포토 리소그래피 인쇄 파릴 렌-C를 사용하는 그런가 2 기반 패턴 플랫폼에 노력하고 있습니다. 포토 리소그래피에서 기하학적 기능의 이전을 포함한다UV 조명을 통해 기판에 마스크. 마스크는 적절한 컴퓨터 지원 설계 프로그램을 이용하여 디자인된다. 유리판 위에, 불투명 크롬의 얇은 층을 원하는 형상 패턴 (1-2 ㎜의 피쳐 해상도가 가능하다)를 나타낸다. 패터닝되는 기판은 포토 레지스트의 박층 (UV 구분 중합체)로 피복된다. 코팅 된 중합체는 다음과 정렬 마스크에 밀착된다. UV 소스는 보호되지 않은 구역이 조사되도록 도포하고 뒤 따라서, 마스크 패턴의 파릴 렌-C 표현을 떠나, 다음 현상 공정에 가용성 및 탈착되어있다. 이 프로세스는 반도체 장치의 개발시에 유래. 이와 같이, 실리콘 웨이퍼를 기판으로서 자주 사용된다. 그런가 2 파릴 렌-C의 포토 리소그래피 증착 따라서 정기적으로 마이크로 전자 클린 룸 시설에서 발생하는 간단하고 신뢰할 수있는 과정입니다. 파릴 렌은이 동안여러 가지 바람직한 생체 공학 특성 (화학적으로 비활성, 비 생분해 성), 셀 패턴에서의 직접 사용을 제한하는 요인은 극도의 소수성에 부분적으로 기인은 본질적으로 가난한 세포 접착이다. 그럼에도 불구하고, 파릴 렌-C는 이전에 껍질 멀리 휴대 템플릿 (12, 13) 예를 들어, 세포 패터닝 간접적으로 사용되어왔다. 이 방법은별로 해상도에 의해 제한하고 여러 단계가 필요합니다. 여기에 설명 된 프로세스는 그 대신 파릴 렌-C 영역 바인딩 소수성 혈청 단백질의 감소의 결합을 통해 세포 접착되어 있도록, 혈청 인큐베이션 산 에칭 공정을 이용한다. 최종 결과는 생물학적 활성화 한 후, 각각의 사이토 접착 또는 사이토 - 반발 특성을 나타내 그래서 효과적인 세포 패터닝 플랫폼을 나타내며, 두 개의 서로 다른 기판으로 구성된 구조입니다. 중요한 생물학적 AG를 도입 할 필요가 없다(그들이 태아 혈청 또는 다른 활성 용액을 사용하여 활성화된다 그러자) 행군 클린 설비로 패터닝 된 기판을 사용하기 이전에 무기한으로 저장 될 수있다. 제조 프로세스가 너무 밀접하게 마이크로 전자 제조에 사용되는 거울로이 parylene-C/SiO 2 패터닝 플랫폼 따라서 MEMS 구성 요소와 연합을위한 좋은 후보입니다.

<table><tbody><tr><td>레이아웃 편집기 소프트웨어 패키지</td><td>WieWeb</td><td></td>의 CleWin 5.0 <td>CIF 또는 GDS-II 파일을 읽고 쓸 수 있습니다. 포토 마스크 제조를 위한 파릴렌 디자인을 만드는 데 사용됩니다. </td></tr><tr><td>http://www.wieweb.com/ns6/index.html 맞춤형 포토 마스크</td><td>Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland</td><td></td><td>시설의 사내 제작 또는 커미션. www.compugraphics-photomasks.com</td></tr><tr><td>3 실리콘 웨이퍼</td><td>Siltronix, Archamps, 프랑스</td><td></td><td>http://www.siltronix.com</td></tr><tr><td>대기 수평로</td><td>Sandvik</td><td></td><td>실리콘 웨이퍼 산화용. http://www.mrlind.com</td></tr><tr><td>소형 반점 분광 반사계</td><td>나노메트릭</td><td></td>은 <td>이산화규소 층의 깊이를 측정합니다. www.nanometrics.com/</td></tr> <tr><td>실란 접착 촉진제</td><td>Merck Chemicals</td><td>1076730050</td><td>파릴렌 증착을 촉진하기 위해 웨이퍼에 사전 적용됩니다. www.merck-chemicals.de/</td></tr> <tr><td>Parylene-C</td><td>Ultra Electronics</td><td></td><td>www.ultra-cems.com</td></tr><tr><td>SCS Labcoter 2 증착 장치, 모델 PDS2010</td><td>SCS 장비, Surrye, 영국</td><td>모델 PDS2010</td><td>www.scscoatings.com/</td></tr> <tr><td>헥사메틸디실라잔(HMDS) 접착 프로모터</td><td>SpiChem</td><td></td><td>www.2spi.com</td></tr><tr><td>웨이퍼에 포토레지스트를 분배하기 위한 자동 추적 시스템; 3 in 포토레지스트 트랙</td><td>SVG (silicon Valley Group)</td><td></td><td>웨이퍼에 포토레지스트를 디스펜싱하기 위한 자동 추적 시스템. 프라임 오븐은 웨이퍼를 굽고 접착 촉진제인 HMDS를 분배합니다. 콤비네이션 스피너는 포토레지스트를 분배합니다. 프리베이크 오븐은 레지스트를 경화시킵니다.</td></tr><tr><td>포토레지스트</td><td>Rohm & Haas</td><td>SPR350-1.2 포지티브 포토레지</td>스트 <td>www.rohmhaas.com/</td></tr> <tr><td>MA/BA8 포토 마스크 얼라인너</td><td>Suss Microtech</td><td></td><td>www.suss.com</td></tr><tr><td>Microchem MF-26A 현상액</td><td>Microchem</td><td></td><td>포토레지스트의 노출된 영역을 제거합니다. www.microchem.com</td></tr><tr><td>JLS RIE80 플라즈마 에칭 시스템</td><td>JLS Designs</td><td></td><td>파릴렌의 노출된 영역을 제거합니다. www.jlsdesigns.co.uk</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>DISCO DAD 680 웨이퍼 다이싱 톱</td><td>DISCO Corporation, Japan</td><td></td><td>www.disco.co.jp</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td>잔류 포토레지스트를 씻어냅니다.</td></tr><tr><td>30% 과산화수소</td><td>시그마-알드리치</td><td>H1009</td><td>www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>98% 황산</td><td>시그마-알드리치</td><td>435589</td><td>www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>10437</td><td>표준 칩 활성화.&nbsp; www.invitrogen.com</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution,</td><td>Gibco-Invitrogen</td>, <td>14170</td><td>www.invitrogen.com</td></tr></tbody></table>

포토 리소그래피 정의 파릴 렌-c에 대한 세포 패터닝 : 그런가<sub&gt; 2</sub&gt; 기판

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

셀 패터닝 플랫폼은 미리 정의 된 체외 신경 네트워크의 건설 및 세포 생리학의 특정 중앙 측면의 탐사 등 다양한 연구 목표를 지원합니다. 쉽게 다중 전극 배열 (MEAs의)와 세포 패턴을 결합하는 기술과 실리콘 기반의 &#39;칩 연구소&#39;가, 미세 호환 프로토콜이 필요합니다. 우리는 그런가 2 웨이퍼 폴리머 파릴 렌-C의 증착을 활용하는 방법을 설명합니다. 포토 리소그래피는 미크론 수준의 해상도 파릴 렌-C의 정확하고 신뢰할 수있는 패터닝을 가능하게합니다. 소 태아 혈청 (또는 다른 특정 활성 용액) 배양 된 세포에 부착하거나, 각각 파릴 렌 또는 SiO2로 영역에 의해 격퇴 된 기판 결과 침지 의하여 0098. 이 기술은 기본 쥐의 해마 세포, HEK 293 세포주, 인간의 신경 세포와 같은 teratocarcinoma 등의 세포 유형 (의 넓은 범위의 패터닝을 허용했다세포주, 일차 뮤린 소뇌 과립 세포 및 일차 인간 신경 교종 - 유래 줄기 세포와 같은). 그러나, 흥미롭게도, 플랫폼은 보편적 아니며 셀 고유 부착 분자의 중요성을 반영. 이 세포의 패터닝 공정은 믿을 수있는, 비용 대비 효과가 있으며, 중요한 것은 마이크로 전자 기술의 통합을위한 방법을 포장, 표준 미세에 (칩 제조) 프로토콜을 통합 할 수 있습니다.

파릴 렌-C와 SiO2로 패터닝의 포토 리소그래피 공정은도 1에 도시되어있다. 일단 제조, 소 태아 혈청에있는 칩의 활성화는 문화 패터닝되는 세포 유형의 넓은 범위를 가능하게한다. 우리 그룹은 성공적으로 기본 쥐의 해마 세포 14-16, HEK 293 세포 라인 (17), 인간의 신경 세포와 같은 teratocarcinoma (HNT) 셀 라인 (18), 차 쥐의 소뇌 과립 세포 및 인간의 기본 신경 교종 유래 줄기 세포와 같은 무늬입니다. 그림 3은 &#39;크로스 헤어&#39;확장자를 가진 원형의 노드로 구성된 파릴 패턴에 HEK 293 세포의 강력한 패턴을 보여줍니다. 이 예에서 칩의 활성화는 소 태아 혈청했다. 대조적으로,도 4는 대안적인 활성 용액을 사용하여 패터닝 플랫폼을 확대 할 가능성을 나타낸다. 소 혈청 알부민 (3 ㎎ / ㎖)의 용액을 사용하고<html> HBSS에 피브로넥틴 (1 ㎍ / ㎖) 이전 패턴의 교훈은 반전되었다. 도 5는 다른 세포 형 (고급 교종 유래 일차 인간 유래 줄기 같은 세포주)를 도시한다. 도 4b 및도 4c에 도시 된 바와 같이 여기에서,도 4a에 도시 된 패턴이 얇은 파릴 렌-C를 따라 세포 성장 프로세스를 촉진과 기본 패턴에 영향 세포 행동의 형상은, 추적한다. 설립 태아 혈청 활성화 프로토콜을 사용할 때 일부 세포 유형 패턴을하지 않습니다. 6 파릴 렌-C와 그런가 2 지역 사이에 뚜렷한 사이토 - 반발 또는 사이토 접착 차이와 합류하기 위해 성장 3T3 L1 세포를 나타낸다 그림. pload/50929/50929fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1. SiO2로상의 파릴 렌-C 패턴의 제작을위한 과정을 나타낸 도면을 흐른다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2.jpg" /> 그림 2. 칩 활성화 단계 동안 패턴 파릴 렌-C와 그런가 2 도메인에 대한 접촉각의 변화를 설명하는 흐름도. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3.jpg" /> 그림 3. 체외에서 사흘 parylene-C/SiO 2에서 배양 HEK 293 세포의 라이브 세포 이미징은. 칩은 소 태아 혈청에서 3 시간 동안 배양 세포가 된 후5 × 104 세포 / ml의 농도로 현탁액에 도금된다. 파릴 렌-C는 동안 세포 접착을 촉진 베어 그런가 2 세포를 격퇴한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4.jpg" /> 그림 4. parylene-C/SiO 2 293 세포 배양 HEK의 라이브 세포 이미징 체외에서 사흘 다른 합리화 활성화 솔루션에서 3 시간 동안 활성화 칩 :. A : 태아 혈청, B : 비트로 넥틴 HBSS (1 ㎍ / ㎖) C : 소 혈청 알부민 HBSS, D (3 ㎎ / ㎖) + 비트로 넥틴 (1 ㎍ / ㎖) : 소 혈청 알부민 (3 ㎎ / ㎖) + 피브로넥틴 (156; ㎍ / ㎖) HBSS에. 도금 세포를 5 × 104 세포 / ml의 밀도로 현탁했다. 칩의 다른 치료가 SiO2를 사용하여 이전 패턴의 교리, 지금 접착제 및 파릴 렌-C 반발의 반전의 결과가 얼마나합니다. 휴즈 등. 17에서 적응 파릴 렌-C 노드 직경 250 μm의는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5.jpg" /> 그림 5. . 기본 인간의 신경 교종 유래 줄기 세포와 같은 면역의 이미지 그런가 2 파릴 렌-C의 다양한 패턴에 성장 : 개략적 인 B와 C에 나타낸 망상 파릴 렌의 디자인을 설명 </strong&gt; B :.. 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)에 스테인드 (체외 4 일 이후에) 고정 된 세포의 형광 현미경 C :. 동일한 칩에 살아있는 세포의 빛 현미경 D : 다른 파릴 렌에 GFAP - 염색 된 세포를 설명 형광 이미지 . 디자인 E :. 반사율 노드의 이미지와는 D 군데 파릴 디자인 스포크 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6.jpg" /> 그림 6. 체외에서 네 일 후에 parylene-C/SiO 2에서 배양 3T3 L1 세포의 라이브 세포 이미징. w 후 태아 혈청에서 3 시간 동안 활성화 칩HICH 세포 현탁액 (1 × 104 세포 / ml)에 플레이 팅 하였다. 이 경우, 플랫폼은 세포가 파릴 렌-C와 그런가 2 지역에 동일하게 융합되고으로, 패턴을 사용하지 않습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 그런가 2 세포 패터닝 미세 호환 방법을 설명합니다. 미리 정의 된 파릴 렌-C 디자인은 포토 리소그래피의 SiO2 웨이퍼에 인쇄되어 있습니다. 혈청 (또는 다른 정품 인증 솔루션)와 함께 배양 한 다음 세포에 특이 적으로 부착 (과의 적합성에 따라 성장) 그런가 2 지역으로 격퇴하는 동안 기본 파릴 렌-C.

포토 리소그래피 정의 파릴 렌-C에 대한 세포 패터닝 : 그런가<sub&gt; 2</sub&gt; 기판

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

본 절차의 전체적인 목표는 미리 정의된 파릴린(paraline) 하부 설계에 따라 이산화규소 표면에 세포를 패턴화하는 것입니다. 이는 먼저 원하는 패턴의 포토마스크를 제작함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 실리콘 웨이퍼를 산화시킨 후 파릴린으로 코팅하는 것입니다.마이크로전자 클린룸 시설에서 수행되는 후속 포토리소그래피 공정을 통해 파릴렌 코팅을 선택적으로 식각하여 원하는 디자인을 구현합니다. 마지막 단계는 먼저 피라냐 용액을 사용하여 칩을 활성화한 다음, 태아 송아지 혈청에서 3~12시간 동안 배양하는 것이며, 이후 세포 현탁액을 도포하여 배양할 수 있습니다. 최종적으로 세포 패턴 형성은 해부 현미경을 이용한 살아있는 세포 이미징 또는 고정 후 공초점 형광 현미경을 통해 평가할 수 있습니다.기존의 여러 세포 패턴화 플랫폼과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 생물학적 제제를 클린룸으로 가져올 필요가 없다는 점입니다. 또한, 패턴 칩은 먼저 파라산(par acid)으로 활성화한 후 혈청을 처리하기 전까지 무기한으로 보관할 수 있습니다. 원하는 파라린 C(paraline C) 구성을 설계하려면 CIF 또는 GDS II 파일을 읽고 쓸 수 있는 레이아웃 에디터 소프트웨어 패키지를 사용하십시오.포토마스크 제작을 적절한 마이크로전자 시설에 외주 주거나 자체적으로 제작하십시오. 시설이 갖춰져 있다면, 대기압 수평 전기로에서 silicon wafer를 950 °C로 40분 동안 산화시켜 200 nm 두께의 silicon dioxide 층을 형성하십시오. 그 후, 작은 영역의 두께를 측정하여 확인하십시오.분광 반사계. 웨이퍼를 진공 증착 시스템에 넣고 챔버 덮개 내부에 sine 접착 촉진제를 도포합니다. 펌프 다운 사이클 동안 sine 접착 촉진제가 산화된 웨이퍼를 코팅합니다. 파라라인을 가열로에 로드하고 진공 증착 시스템을 사용하여 상온에서 dimer 1mg당 1.3nm의 속도로 paraline C를 증착합니다.그 후 파릴렌(paraline)이 코팅된 웨이퍼에 HMDS 접착 촉진제를 도포합니다. 적절한 포토레지스트 코팅 시스템을 사용하여, 포지티브 포토레지스트를 도포하면서 웨이퍼를 4,000 RPM으로 30초 동안 스핀 코팅하여 1 µm 두께를 확보한 다음, 90 °C에서 60초 동안 소프트 베이크합니다. 이제 웨이퍼와 미리 제작된 포토마스크를 마스크 정렬기(mask aligner)에 삽입합니다.포토레지스트가 코팅된 웨이퍼를 UV 광선으로 노출시켜 원하는 패턴을 포토레지스트에 전사합니다. 그 후, 노출된 웨이퍼를 110 °C에서 60초 동안 베이크합니다. 그런 다음 적절한 현상액으로 현상하여 웨이퍼에서 모든 노출된 포토레지스트를 제거합니다. 산소 플라즈마 식각 시스템을 사용하여 보호되지 않은 파릴린을 제거함으로써 하단의 이산화규소를 드러나게 합니다.그 후 다이싱한 칩을 필요할 때까지 먼지가 없는 보관함에 넣어 보관하십시오. 본 절차에서는 아세톤으로 10초 동안 세척하여 칩에서 잔류 포토레지스트를 제거합니다. 그런 다음 탈이온 증류 H2O로 3회 헹구고, 산 흄후드에서 신선한 피라냐 용액을 제조한 후, 칩을 피라냐 용액에 10분 동안 침지시켜 세척 및 식각합니다.그런 다음 칩을 탈이온 H2O로 3회 헹구고, 층류 층 배양 후드 내의 멸균 배양 접시로 옮깁니다. 6-웰 플레이트의 각 웰에 칩을 2개씩 배치하여 세포 패턴 형성을 위해 칩을 활성화합니다. 다음으로, 모든 칩이 완전히 잠기도록 소태아 bovine serum 2mL를 첨가합니다.칩을 혈청에 넣고 37 °C에서 3~12시간 동안 배양합니다. 이제 활성화 용액에서 칩을 꺼냅니다. Hank's balanced salt solution으로 10초 동안 한 번 세척합니다.그 다음 칩을 배양 웰에 넣고 선택한 세포 유형을 일반 배양 배지가 포함된 현탁액 형태로 플레이팅합니다. 최적의 세포 플레이팅 밀도는 세포 유형과 칩 위 paraline C의 기하학적 패턴 모두에 따라 달라집니다. 5 × 10⁴ cells/mL의 밀도가 적절한 시작점입니다.이미징은 세포 패턴 형성의 근본적인 목적에 맞게 조정되지만, 적절한 릴레이 렌즈가 장착된 실체 현미경과 디지털 카메라를 사용하여 살아있는 세포의 거동을 쉽게 평가할 수 있습니다. 다음은 Paraline C 이산화규소 위에서 3일 동안 배양한 HEC 2 93 세포의 살아있는 세포 이미징 결과입니다. 체외(in vitro)에서 칩을 태아 소 혈청(fetal bovine serum)에서 3시간 동안 배양한 후, 5 × 10⁴ cells/mL 농도의 세포 현탁액을 접종하였습니다.Paraline C는 세포 부착을 촉진하는 반면, 순수 이산화규소는 세포를 밀어냅니다. 이 그림은 이산화규소 위의 다양한 Paraline C 패턴에서 배양된 일차 인간 신경교종 유래 줄기세포 유사 세포의 면역형광 이미지를 보여줍니다. 여기서 도식은 망상 Paraline 설계를, 형광 현미경 사진은 glial fibrillary acidic protein으로 염색된 고정 세포를, 광학 현미경 사진은 동일한 칩 위에서 살아있는 세포를 나타냅니다.여기 서로 다른 파라라인 디자인에서 GFAP로 염색된 세포를 보여주는 형광 이미지와 스포크 파라라인 디자인 노드의 반사 이미지가 있습니다. 그리고 이 그림은 파라라인 C silicon dioxide 상에서 배양된 3T3L1 세포의 살아있는 세포 이미징을 보여줍니다. in vitro에서 4일 후, 칩을 fetal bovine serum 내에서 3시간 동안 활성화시켰으며, 세포는 5 × 10⁴ cells/mL 농도의 현탁액 상태로 도말하였습니다.이 사례에서, 플랫폼은 Lene C 및 이산화규소 영역에서 세포가 동일하게 합류되어 패턴화되는 것을 가능하게 하지 않습니다. 이 프로토콜을 수행할 때, 피라냐 처리 직후에 혈청 활성화가 이루어져야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이를 수행하지 않을 경우 패턴화 과정이 제대로 이루어지지 않게 됩니다.피라냐 용액(piranha acid)을 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 점에 유의하십시오. 피라냐 용액은 반드시 화학 흄 후드 내에서 조제 및 사용해야 하며, 적절한 보호 안경, 실험복 및 장갑을 착용하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

비 오염 PEG 실란 monolayer은 reductive 잠재력을 응용 프로그램에 의해 유리에 개별적으로 주소 지정 ITO 전극에서 desorbed했다. 전기는 전극 패턴에 긴밀하게 대응하는 세포 형태와 공간 정의된 방식을 맡아 세포 부착에 허용되는 ITO의 microelectrodes에서 PEG - 실란 레이어의 스트립.

광학 투명 인듐 틴 산화물 전극에 Patterning 셀

골드에 긴 사슬 alkane thiols의 형성에서 자기 조립 monolayers은 (샘스) 단백질 패턴 및 셀 감금의 형성을위한 잘 정의된 기판을 제공합니다. 와 backfilling 다음 polydimethylsiloxane (PDMS) 스탬프를 사용하여 hexadecanethiol의 Microcontact 인쇄 글리콜 - 종료 alkane thiol 모노머는 스탬프 hexadecanethiol 지역에 단백질과 세포 adsorb 패턴을 생산하고 있습니다.

단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

여기 작은 분자와 단백질과 패턴 기판의 patterning 산화물 무료 실리콘과 게르마늄 반응 유기 monolayers과 입증 작용화에 대한 간단한 방법을 설명합니다. 접근 방식은 완전히, 화학 산화로부터 표면을 보호 기능 형태를 통해 정확한 컨트롤을 제공하며, 화학적으로 차별 패턴을 준비 액세스를 제공합니다.

소프트 리소그래피 작용화 및 Patterning 산화물없는 실리콘과 게르마늄

micropunching 리소그래피 방식이 생성하는 마이크로와 submicron 패턴 위, 측벽 및 폴리머 기판의 바닥 표면을 개발하고 있습니다. 그것은 patterning이 폴리머를 실시하고 측벽 패턴을 생성하는 장애물을 극복. 이 방법은 여러 기능의 신속한 제조가 가능하며 적극적인 화학 무료입니다.

마이크로 및 Submicron 패턴 폴리머 기판을 생성하기위한 리소그래피를 Micropunching

수성 2 단계 시스템은 세포 동시에 패턴 여러 사람들에게 사용되었습니다. 세포 패터닝을위한이 빠르고 쉬운 방법은 dextran과 폴리에틸렌 글리콜 및 두 개의 폴리머 솔루션 사이에 존재 계면 장력의 수성 솔루션의 위상 분리의 장점을 걸립니다.

수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴

이 보고서는 저압 진공을 사용하여 생물학 연구를 위한 세포와 기질로 미세유체 채널을 채우는 간단하고 수행하기 쉬운 기술을 설명합니다.

패터닝 단백질과 세포의 다목적 방법

여기서 우리는 pH 조절에 기반한 라벨없는 방법을 사용하여 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용을 연구하기위한 마이크로 유체 플랫폼의 맥락에서지지 된 지질 이중층을 제시합니다.

PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

우리는 미세 유체 플랫폼에서 모세혈관 보조 어셈블리를 사용하여 박테리아 및 콜로이드와 같은 액체에 매달려있는 미세 크기의 물체를 폴리디메틸실록산 기판에 규정 된 배열로 패턴화하는 기술을 제시합니다.

순차모세혈관 보조 어셈블리를 통한 미생물 및 미생물 입자의 패터닝

우리는 소프트 하이드로젤 상의 세포외 매트릭스 단백질의 도트 어레이의 단일 감산 패터닝 단계를 사용한 마이크로접촉 프린팅을 기반으로 세포 견인력을 측정하는 표준 방법에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 세포 군집 모양을 제어하는 데 필수적인 섬 패턴을보다 간단하고 일관되게 제작할 수 있습니다.

마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성

전통적으로, 세포 배양은 생체 내에서 세포의 자연 환경을 잘 모방하지 못하는 평면 기질에서 수행됩니다. 여기서 우리는 생리적으로 관련된 곡선 기하학과 미세 패턴화 된 세포 외 단백질을 가진 세포 배양 기질을 생산하는 방법을 설명하여 이러한 세포 외 단서의 세포 감지에 대한 체계적인 조사를 가능하게합니다.

삼차원 세포 배양 기질의 UV-광패터닝에 의한 다큐 세포 미세환경 생성

이 프로토콜은 실란 코팅된 나노다공성 표면에 순차적 디지털 패터닝 및 그라프팅을 통해 미끄러운 3차원 구조를 제작하기 위한 빛 유도 방법을 제시합니다. 이 접근 방식을 사용하면 미끄러운 영역의 공간적으로 제어된 형성이 가능해 패턴화된 액체 발수성과 계면 미끄러움의 정량적 분석이 가능하며 유체 조작 및 표면 공학에 적용됩니다.

실란 코팅 나노다공성 구조를 기반으로 한 미끄러운 표면을 위한 광유도 패터닝 및 그래프트

배우세요 포토리소그래피를 이용한 SiO₂ 기판의 parylene-C 세포 패터닝 방법을. 이 기술은 생물학적 오염 없이 세포 행동을 연구할 수 있는 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공합니다.

포토 리소그래피 정의 파릴 렌-C에 대한 세포 패터닝 : 그런가

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