스퀴지 기반의 조립 방법과 생체막 마이크로 어레이의 형성

이 절차의 전반적인 목표는 간단한 준비 방법을 사용하여 바이오 멤브레인 마이크로어레이를 만드는 것입니다. 이는 먼저 실리카 비드를 지질 이중층 멤브레인으로 코팅함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 지질 코팅된 비드를 실리콘 마이크로웰(microwell) 기질에 증착하는 것입니다.

세 번째 단계는 폴리메틸 수복산 스퀴지를 사용하여 마이크로 웰에 없는 비드를 제거하는 것입니다. 마지막 단계는 형광 현미경으로 지질로 코팅된 비드 어레이를 이미지화하는 것입니다. 궁극적으로 이 방법은 어레이 이미징 접근 방식을 사용하여 독소 지질 상호 작용에 대한 결합 상수를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

이 방법은 세포에서 유래한 구형으로 지지된 지질 이중층 및 천연 막 입자의 배열을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 마이크로웰 제작과는 별개로 이 기술이 공간적으로 정의된 생체 멤브레인 어레이를 생성하기 위해 기질 또는 지질 멤브레인의 화학적 변형을 필요로 하지 않는다는 것입니다. 이 기술의 응용 분야는 나노 미터법 금속 구멍 어레이를 기반으로 표면 플라즈마 및 공명을 사용하여 지질 단백질 상호 작용의 표지 없는 검출로 확장될 수 있습니다.

이 방법은 지질 단백질 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 세포 초점 접착, 마이크로 웰 어레이 및 스퀴지 제제에 대한 연구와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 동영상은 소포 준비부터 시작합니다. 먼저 작은 유리 바이알 혼합물에서 소포에 대한 구성 성분 지질.

총 반 밀리그램의 지질이 이 용액에 들어 있습니다.진공 상태에서 혼합물을 6시간 동안 건조시킵니다. 다음으로 0.1몰의 염화나트륨 용액을 만들고 건조된 지질에 반 밀리리터를 첨가합니다. 혼합물을 실온에서 밤새 배양합니다.

다음날, 혼합물을 와류로 만들어 소포를 현탁시킵니다. 그런 다음 혼합물을 욕조에서 20 분 동안 초음파 처리하고 실온에서 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후 100 나노 미터 폴리 카보네이트 멤브레인 필터를 통해 현탁액을 압출합니다.

압출 필터를 통해 현탁액을 총 17회 통과시킵니다. 그런 다음 압출된 소포를 섭씨 4도의 유리 바이알에 보관합니다. 먼저 700나노미터 직경의 이산화규소 비드를 사용합니다.

0.1 몰 염화나트륨에 150억 개의 구슬을 현탁액으로 만듭니다. 현탁액을 볼텍스한 다음 1700Gs에서 20분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. resus로 세척을 반복하여 구슬을 다른 1ml의 소금 용액에 매달아 놓고 20분 동안 더 회전시킵니다.

그런 다음 이 과정을 세 번째로 반복하여 구형 지지 지질 이중층 또는 SSB를 형성합니다. 25마이크로리터의 이산화규소 비드 현탁액을 이전 섹션의 200마이크로리터의 소포 현탁액과 혼합합니다. 혼합물을 와류로 만들고 불을 붙인 다음 한 시간 후 실온에서 배양하고 혼합물을 1700Gs에서 20 분 동안 원심 분리합니다.

상등액을 버리십시오. 펠릿은 비드에 열 DPPE가있는 파열 된 소포에 분홍색입니다. PH 7.4에서 225마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다.

스핀 및 Resus 현탁액 단계를 두 번 반복하여 파열되지 않은 소포를 제거하고 SSB 생성을 완료합니다. 마이크로 웰 어레이의 웨이퍼를 각각 4-6개의 어레이가 있는 직사각형 조각으로 나눕니다. 다음으로, 이전 섹션의 SSLB 현탁액인 와류를 각 마이크로 웰 어레이에 10마이크로리터를 전달합니다.

SSB가 나중에 정산될 때까지 한 시간 정도 기다립니다. PBS로 어레이 칩을 부드럽게 세척하고 침수된 칩 표면 위로 스퀴지 글라이드를 사용하여 어레이를 PBS에 5번 담그십시오. 이렇게 하면 마이크로 웰 내부가 아닌 SLP가 제거됩니다.

그런 다음 핀셋으로 각 어레이 칩을 잡고 PBS를 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 새 PBS 수조로 옮깁니다. 칩의 상단 표면은 젖은 상태로 유지되어야 합니다.

욕조에서 칩을 제거하고 W를 제거합니다. 실험실 와이프가있는 대부분의 PBS. 어레이를 수화 상태로 유지하기에 충분한 PBS를 남겨 둡니다.

이제 200마이크로리터의 BSA 용액을 어레이에 추가하여 비특이적 결합을 차단합니다. 어레이가 한 시간 동안 배양하도록 합니다. 나중에 가습 상자에서 마이크로 피펫으로 BSA를 제거하고 200 마이크로 리터의 콜레라 독소 용액을 첨가하십시오.

그런 다음 어레이를 가습 챔버로 되돌립니다. 한 시간 더 기다린 다음 PBS로 어레이를 세척하고 무릎 닦기로 여분의 PBS를 흡수합니다. 그런 다음 어레이 칩을 표준 현미경 슬라이드에 놓고 24 x 40mm 정사각형 커버 슬립을 어레이에 부착하고 이미징을 진행합니다.

이미지 분석은 이미지 J.Automated 입자 분석 기능을 사용하여 수행할 수 있습니다. 그런 다음 각 배열에 대해 개별 SSB의 평균 농도를 히스토그램으로 요약합니다. 설명된 방법을 사용한 후 어레이의 100미크론 제곱 영역은 936SSB를 표시합니다.

점유 데이터를 계산하고 일주일 동안 보관한 후 SSLB 형광 강도의 히스토그램을 생성했습니다. 동일한 어레이를 동일한 방식으로 재분석했으며 형광 강도 또는 어레이 점유율에는 변화가 없었습니다. 서로 다른 식별 마커를 가진 서로 다른 SSB의 순차적 증착도 설명된 방법을 사용하여 가능했습니다.

두 번째 SSB는 10분의 1에 예치되었습니다. 첫 번째 SSB가 증착된 농도. 실험을 위해 두 마커의 오버레이가 표시됩니다.

어레이는 다양한 농도의 GM 1을 가진 SSB로 만들어졌으며 고정된 농도의 콜레라 독소에 노출되었습니다. 평형 해리 상수를 결정하기 위해 역도 수행되었습니다. GM 1의 경우.

콜레라 독소 결합 어레이는 미엘린 입자로 만들어진 어레이와 같은 천연 바이오 멤브레인으로 만들 수도 있습니다. 친유성 플루오로 4 FM 1 43으로 표시됩니다. 지질 뗏목은 콜레스테롤과 GM 1과 같은 강글리오사이드가 풍부합니다.

따라서, Alexa 4 88 접합 콜레라 독소는 대조적으로 지질 뗏목 마이크로어레이에 강하게 결합하고, 형광 표지된 스트리핑된 아덴은 이들 어레이에 결합하지 않는다. 어레이는 250미크론 채널이 있는 미세유체 칩을 통해 미엘린과 지질 뗏목을 마이크로 웰에 전달하여 만들어졌습니다. 항희소돌기아교세포(anti oligodendrocyte) IgM으로 표지되었고 미엘린에서 발견되는 S 황화물이 표지되었지만, 지질 뗏목은 표지되지 않았습니다.

한 번은 지질 배터가 코팅된 비드가 준비됩니다. 이 기술은 천연 멤브레인 입자 어레이를 생성한 후 적절하게 수행되면 한 시간 내에 어레이를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 나노 홀 표면 플라즈마 및 공명과 같은 다른 방법은 생체 분자 상호 작용의 표지 없는 감지에 사용할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 지질 담즙층 코팅 비드와 천연 멤브레인 입자를 사용하여 바이오 멤브레인 어레이를 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.