Name: elisa methods for detecting antigens
Uploaded: 2023-04-30T07:07:48.000Z
Duration: 14 min 22 s
Channel: JoVE

1. Indirect ELISA
Een indirecte ELISA is er een waarbij het primaire antigeenspecifieke antilichaam wordt herkend door een secundair geconjugeerd antilichaam. Het volgende protocol is een voorbeeld van een indirecte ELISA-methode, waarbij de serummonsters van met influenza A-virus (IAV) geïnfecteerde muizen worden getest op de aanwezigheid van IAV-specifiek IgG-antilichaam. Een sterk punt van dit voorbeeld is dat er verschillende secundaire antilichamen kunnen worden gebruikt die alle antilichaam-isotypen of specifieke isotypen herkennen (bijv. IgG).
Bekleding van antigeen op de microplaat
<ol>
	<li>Bekleed de putjes van een 96-putjes ELISA-plaat met gezuiverd antigeen door 50 μL gezuiverd antigeen (2 mg/mL gezuiverd A/PR/8 Influenza A-virus in 0,05M Tris-HCl buffer (pH 9,5)) in elk putje van de plaat te pipetten.</li>
	<li>Dek de plaat af met een kleefbare afdekking en incubeer deze een nacht bij 4°C om het antigeen aan de plaat te laten binden.</li>
	<li>Na het einde van de incubatie, verwijder de coatingoplossing door de plaat over een gootsteen te slaan.</li>
</ol>
Blokking
<ol start="4">
	<li>Blokkeer de resterende eiwitbindende plaatsen in de beklede putjes door 200 μL blokkeringsbuffer toe te voegen, hierbij wordt 5% ezelsserum in 1X PBS gebruikt, per putje. Alternatieve blokkeringsreagentia omvatten 5% magere droge melk of BSA in PBS of normaal serum van een dier waarin het secundaire antilichaam werd gegenereerd.</li>
	<li>Incubeer gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4°C.</li>
	<li>Na de incubatie, verwijder de blokkeringsbuffer door de plaat te slaan en was de plaat vervolgens met PBS bevattend 1% Tween-20.</li>
</ol>
Incubatie met het primaire antilichaam
<ol start="7">
	<li>Maak een seriële verdunning van het serummonster, dat het primaire antilichaam bevat, om een verdunningsbereik van 1 tot 204.800 te verkrijgen, met behulp van 1X PBS. Om dit te doen, verdun het serum eerst 1:12,5 en voer vervolgens een 4X-verdunning uit (verdunningsbereik - 1:12,5 tot 1:204.800).</li>
	<li>Voeg 100 μL van de sterieel verdunde serummonsters toe aan de putjes.</li>
	<li>Dek de plaat af met een kleefbare afdekking en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur.</li>
	<li>Na de incubatie, sla de plaat over een gootsteen en was de plaat met PBS bevattend 1% Tween-20.</li>
</ol>
Incubatie met het secundaire antilichaam
<ol start="11">
	<li>Voeg 100 μL van een enzymgeconjugeerd secundair antilichaam, paardenradensperoxidase, HRP-geconjugeerd ezelsanti-muis secundair in dit experiment, toe aan elk putje.</li>
	<li>Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Na de incubatie, sla de plaat over een gootsteen en was de plaat met PBS bevattend 1% Tween-20.</li>
</ol>
Detectie
<ol start="14">
	<li>Voeg 100 μL van de indicatorsubstraat (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)) met een concentratie van 1 mg/mL toe aan elk putje.</li>
	<li>Incubeer de plaat met het substraat gedurende 5-10 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Na 10 min, stop de enzymatische reactie door 100 μL 2N Zwavelzuur (H2SO4) toe te voegen. Binnen 30 min na het toevoegen van de stopoplossing, lees de plaat met een microplaatlezer bij 405 nm om de absorptie van de putjes te bepalen.</li>
</ol>
2. Sandwich ELISA
Bij deze ELISA-versie wordt het experimentele monster "gesandwiched" tussen een ongeconjugeerd vangantilichaam en een geconjugeerd detectieantilichaam, beide specifiek voor hetzelfde eiwit maar op verschillende epitopen. In het volgende voorbeeld van een sandwich ELISA, werd de concentratie van humaan TNFα bepaald in onbekend monster met behulp van een standaardcurve gegenereerd uit 2,5X seriële verdunning van een bekende standaard, recombinant humaan TNFα (startend bij een concentratie van 75 pg/mL).
Bekleding van vangantilichaam op de microplaat
<ol>
	<li>Bekleed de putjes van een 96-putjes ELISA-plaat met gezuiverd vangantilichaam door 100 μL vangantilichaam (1-10 μg/mL bereik) toe te voegen aan elk putje van de plaat.</li>
	<li>Dek de plaat af met een kleefbare plaatafdekking en incubeer deze een nacht bij 4°C.</li>
	<li>Na de incubatie, verwijder de coatingoplossing van de plaat door de plaat over een gootsteen te slaan.</li>
</ol>
Blokking
<ol start="4">
	<li>Blokkeer de resterende eiwitbindende plaatsen in de met antilichaam beklede putjes door 200 μL blokkeringsoplossing, 5% magere droge melk bevattend PBS, toe te voegen aan de putjes.</li>
	<li>Incubeer gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4°C.</li>
	<li>Na de incubatie, verwijder de blokkeringsbuffer door de plaat te slaan en was de plaat vervolgens met PBS bevattend 1% Tween-20.</li>
</ol>
Antigeen bevattende testmonsters toevoegen
<ol start="7">
	<li>Voeg 100 μL van het testmonster toe aan de putjes. Sluit de plaat af met een kleefbare afdekking.</li>
	<li>Incubeer ge

Zoals aangetoond, valt een reeks immunoassays (met lichte variatie in protocollen) binnen de ELISA-techniekfamilie. Het bepalen welke versie van ELISA moet worden gebruikt, hangt af van een aantal factoren, waaronder welk antigeen wordt gedetecteerd, het beschikbare monoklonale antilichaam voor een bepaald antigeen en de gewenste gevoeligheid van de test (5). Enkele sterke en zwakke punten van de verschillende ELISA's die hier worden beschreven, zijn:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ELISA</td>
			<td>Sterktes</td>
			<td>Zwakke punten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Indirect</td>
			<td>1) Hoge gevoeligheid vanwege het feit dat meerdere enzymgeconjugeerde secundaire antilichamen zich kunnen binden aan het primaire antilichaam</td>
			<td rowspan="3">1) Hoge achtergrondsignaal kan optreden omdat de coating van het antigeen van belang op de plaat niet specifiek is (d.w.z. alle eiwitten in het monster zullen de plaat coaten)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Veel verschillende primaire antilichamen kunnen worden herkend door een enkel enzymgeconjugeerd secundair antilichaam, waardoor de gebruiker de flexibiliteit heeft om hetzelfde enzymgeconjugeerd secundair antilichaam te gebruiken in veel verschillende ELISA (ongeacht het gedetecteerde antigeen)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3) Beste keuze wanneer er slechts één antilichaam voor het antigeen van belang beschikbaar is</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Sandwich</td>
			<td>1) Het gebruik van antigeenspecifiek opvang- en detectiemonoklonaal antilichaam verhoogt de gevoeligheid en specificiteit van de test (vergeleken met de indirecte ELISA)</td>
			<td rowspan="2">1) Het optimaliseren van de concentraties van de opvang- en detectiemonoklonale antilichamen kan moeilijk zijn (vooral voor niet-commerciële kits)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Beste keuze voor het detecteren van een groot eiwit met meerdere epitopen (zoals een cytokine)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Competitief</td>
			<td>1) Onzuivere monsters kunnen worden gebruikt</td>
			<td rowspan="3">1) Vereist een grote hoeveelheid zeer zuiver antigeen om de plaat te coaten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Minder gevoelig voor reagentdilutie-effecten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3) Ideaal voor het detecteren van kleine moleculen (zoals een hapteen)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 3: Samenvatting. Een samenvatting van de sterke en zwakke punten van de verschillende ELISA-technieken.
Hoewel het een eenvoudige en nuttige techniek is, zijn er ook enkele nadelen aan elke ELISA. Een daarvan is de onzekerheid over de hoeveelheid van het eiwit van belang in de te testen monsters. Als de hoeveelheid te hoog of te laag is, kunnen de absorptiewaarden die worden verkregen door de microplaatlezer boven of onder de grenzen van de standaardcurve vallen, respectievelijk. Dit maakt het moeilijk om nauwkeurig de hoeveelheid eiwit in de te testen monsters te bepalen. Als de waarden te hoog zijn, kan het testmonster worden verdund voordat het aan de putjes van de plaat wordt toegevoegd. De uiteindelijke waarden moeten dan worden aangepast aan de verdunningsfactor. Zoals gezegd, zelfgemaakte kits vereisen vaak zorgvuldige optimalisatie van de gebruikte antilichaamconcentraties om een hoog signaal-ruisverhouding te verkrijgen.

elisa-tests: indirect, sandwich en competitief

ELISA Assays: Indirect, Sandwich, and Competitive

Bron: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3 en Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Afdeling Urologie, Universiteit van Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Centrum voor Immunologie, Universiteit van Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Afstudeerprogramma Microbiologie, Immunologie en Kankerbiologie, Universiteit van Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Kankercentrum, Universiteit van Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) wordt vaak gebruikt om de aanwezigheid en/of concentratie van een antigeen, antilichaam, peptide, eiwit, hormoon of andere biomolecuul in een biologisch monster te meten. Het is uiterst gevoelig en kan lage antigeenconcentraties detecteren. De gevoeligheid van ELISA wordt toegeschreven aan het vermogen om de interacties tussen een enkel antigeen-antilichaamcomplex te detecteren (1). Bovendien maakt de opname van een enzym-geconjugeerd antigeen-specifiek antilichaam de omzetting van een kleurloze substraat in een chromogeen of fluorescerend product mogelijk dat kan worden gedetecteerd en gemakkelijk gekwantificeerd door een platenlezer. Wanneer vergeleken met de waarden gegenereerd door getitreerde hoeveelheden van een bekend antigeen van belang, kan de concentratie van hetzelfde antigeen in de experimentele monsters worden bepaald. Verschillende ELISA-protocollen zijn aangepast om antigeenconcentraties in een verscheidenheid aan experimentele monsters te meten, maar ze hebben allemaal hetzelfde basisconcept (2). Het kiezen van het type ELISA dat moet worden uitgevoerd, indirect, sandwich of competitief, hangt af van een aantal factoren, waaronder de complexiteit van de te testen monsters en de beschikbare antigeen-specifieke antilichamen. De indirecte ELISA wordt vaak gebruikt om de uitkomst van een immunologisch antwoord te bepalen, zoals het meten van de concentratie van een antilichaam in een monster. De sandwich ELISA is het meest geschikt voor het analyseren van complexe monsters, zoals weefselkweeksupernatant of weefselleesbuffers, waarbij de analyt, of het antigeen van belang, deel uitmaakt van een gemengd monster. Ten slotte wordt de competitieve ELISA het meest gebruikt wanneer er slechts één antilichaam beschikbaar is om het antigeen van belang te detecteren. Competitieve ELISA's zijn ook nuttig voor het detecteren van een klein antigeen met slechts een enkel antilichaam-epitoop dat niet twee verschillende antilichamen kan accommoderen vanwege sterische belemmering. Het protocol beschrijft de basisprocedures voor de indirecte, sandwich en competitieve ELISA-assays.
De indirecte ELISA-assay wordt vaak gebruikt om de hoeveelheid antilichamen in serum of in het supernatant van een hybridoma-kweek te meten. De algemene procedure voor de indirecte ELISA-assay is:
<ol>
	<li>Bekleed putjes met antigenen</li>
	<li>Voeg serum of hybridoma-kweeksupernatant toe met antilichaam (primair of 1° antilichaam)</li>
	<li>Incuberen en wassen</li>
	<li>Voeg secundair (of 2°) enzym-geconjugeerd antilichaam toe</li>
	<li>Incuberen en wassen</li>
	<li>Voeg substraat toe</li>
</ol>
De sandwich ELISA-assay verschilt van de indirecte ELISA-assay doordat de methode geen bekleding van de platen met een gezuiverd antigeen omvat. In plaats daarvan wordt een "vangst"-antilichaam gebruikt om de putjes van de plaat te bekleden. Het antigeen wordt "gesandwichd" tussen het vangstandlichaam en een tweede "detectie" enzym-geconjugeerd antilichaam - waarbij beide antilichamen specifiek zijn voor hetzelfde antigeen, maar op verschillende epitopen (3). Door te binden aan het vangstandlichaam/antigeencomplex, blijft het detectieantilichaam in de plaat. Zowel monoklonale antilichamen als polyklonale antisera kunnen worden gebruikt als vangstand en detectie-antilichamen. Het belangrijkste voordeel van de sandwich ELISA is dat de monster niet hoeft te worden gezuiverd voor analyse. Bovendien kan de assay vrij gevoelig zijn (4). Veel commercieel verkrijgbare ELISA-kits zijn van het sandwichtype en gebruiken geteste, gepaarde antilichamen. De algemene procedure voor de sandwich ELISA-assay is:
<ol>
	<li>Bekleed putjes met vangstandlichaam</li>
	<li>Voeg testmonsters toe met antigeen</li>
	<li>Incuberen en wassen</li>
	<li>Voeg enzym-geconjugeerd detectie-antilichaam toe.</li>
	<li>Incuberen en wassen</li>
	<li>Voeg substraat toe</li>
</ol>
De meeste commercieel verkrijgbare sandwich ELISA-kits worden geleverd met enzym-geconjugeerde detectie-antilichamen. In gevallen waar een enzym-geconjugeerd detectie-antilichaam niet beschikbaar is, kan een secundair enzym-geconjugeerd antilichaam dat specifiek is voor het detectie-antilichaam worden gebruikt. Het enzym op het secundaire antilichaam vervult dezelfde rol, namelijk het omzetten van het kleurloze substraat in een chromogeen of fluorescerend product. Het bovengenoemde secundaire enzym-geconjugeerde antilichaam zou meer gebruikt worden in een "zelfgemaakte" sandwich ELISA ontwikkeld door een onderzoeker die zijn eigen monoklonale antilichamen heeft gegenereerd, bijvoorbeeld. Een nadeel van het gebruik van een secundair enzym-geconjugeerd antilichaam is om er zeker van te zijn dat het alleen bindt aan het detectie-antilichaam en niet aan het vangstandlichaam dat aan de plaat is gebonden. Dit zou resulteren in een meetbaar product in alle putjes, ongeacht de aanwezigheid of afwezigheid van antigeen of detectie-antilichaam.
Ten slotte wordt de competitieve ELISA-assay gebruikt om oplosbare antigenen te detecteren. Het is eenvoudig uit te voeren, maar het is alleen geschikt wanneer het gezuiverde antigeen in relatief grote hoeveelheden beschikbaar is. De algemene procedure voor de competitieve ELISA-assay is:
<ol>
	<li>Bekleed putjes met antigeen</li>
	<li>Incuberen en wassen</li>
	<li>Pre-incubeer testmonster met enzym-geconjugeerde primaire antilichamen</li>
	<li>Voeg mengsel toe aan putje</li>
	<li

In het volgende voorbeeld van een indirecte ELISA werd de aanwezigheid van influenza A-virus (IAV)-specifiek IgG in het serum van IAV-geïnfecteerde muizen bepaald. C57Bl/6-muizen werden geïnfecteerd met influenza A-virus (A/PR/8; 105 PFU in 100 µL PBS i.p.) en serum werd 28 dagen later verzameld. Om de hoeveelheid IAV-specifiek IgG in het serum te kwantificeren, werden 96-well ELISA-platen gecoat met gezuiverd A/PR/8 Influenza A-virus (50 µL/well van 2 mg/ml PBS-virus) overnacht bij 4°C. Gecoate platen werden geblokkeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 5% normaal ezelsserum in PBS, gevolgd door incubatie met verdunde serummonsters van IAV-uitgedaagde muizen overnacht bij 4°C. Het serum werd aanvankelijk 1:12,5 verdund, gevolgd door 1:4-verdunningen (verdunningsbereik - 1:12,5 tot 1:204.800). Na het wassen werden de platen 1 uur geïncubeerd met een alkalische fosfatase (AP)-geconjugeerd ezelsanti-muis IgG. De platen werden gewassen en vervolgens werd p-Nitrofenylfosfaat (PNPP; 1 mg/mL, 100 µL/well) toegevoegd. De kleurloze PNPP-oplossing verkleurt geel in aanwezigheid van AP. Na 5-10 minuten werd de enzymatische reactie gestopt door 100 µL/well 2N H2SO4 toe te voegen. De plaat werd gelezen op een microplaatlezer bij 405 nm. De verkregen resultaten worden getoond in Tabel 1 en Figuur 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stapel</td>
			<td>Wells</td>
			<td>OD405</td>
			<td>Gemiddelde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Serum 1:12,5</td>
			<td>A1</td>
			<td>2.163</td>
			<td rowspan="3">2.194</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B1</td>
			<td>2.214</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1</td>
			<td>2.204</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Serum 1:50</td>
			<td>A1</td>
			<td>1.712</td>
			<td rowspan="3">1.894</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B1</td>
			<td>2.345</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1</td>
			<td>1.624</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Serum 1:200</td>
			<td>A1</td>
			<td>1.437</td>
			<td rowspan="3">1.541</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B1</td>
			<td>1.73</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1</td>
			<td>1.456</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Serum 1:800</td>
			<td>A1</td>
			<td>1.036</td>
			<td rowspan="3">0.957</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B1</td>
			<td>0.912</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1</td>
			<td>0.923</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Serum 1:3200</td>
			<td>A1</td>
			<td>0.579</td>
			<td rowspan="3">0.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B1</td>
			<td>0.431</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1</td>
			<td>0.429</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Serum 1:12800</td>
			<td>A1</td>
			<td>0.296</td>
			<td rowspan="3">0.281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B1</td>
			<td>0.312</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1</td>
			<td>0.236</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Serum 1:51200</td>
			<td>A1</td>
			<td>0.308</td>
			<td rowspan="3">0.283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B1</td>
			<td>0.299</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1</td>
			<td>0.243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Serum 1:204800</td>
			<td>A1</td>
			<td>0.315</td>
			<td rowspan="3">0.303</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B1</td>
			<td>0.298</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1</td>
			<td>0.297</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: Indirecte ELISA-assaygegevens. Serumverdunningen (van 1:12,5 tot 1:204.800), van met influenza A-virus (IAV) geïnfecteerde muizen die IAV-specifiek IgG bevatten, optische dichtheid (OD) (405 nm) waarden en gemiddelde OD405 waarden.
<img alt="Absorbantie versus concentratiegrafiek, data-analyse, optische dichtheid, experimentele resultaten, OD405." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10496/10496fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1: Indirecte ELISA-assay scatter plot van gemiddelde OD405 waarden (+ S. D.) en serumverdunningen (van 1:12,5 tot 1:204.800), van influenza A-virus (IAV)-specifiek IgG in het serum van IAV-geïnfecteerde muizen. De OD405 waarden kunnen omgekeerd worden gecorreleerd aan de serumverdunningen.
In het volgende voorbeeld van een sandwich ELISA werd een 1:2,5-verdunning van recombinante humane TNFα-standaarden (beginnend bij een concentratie van 75 pg/mL) toegevoegd aan de aangegeven wells van een 96-well vlakbodemplaat. Deze standaarden leidden tot een overeenkomstige 2,5-voudige verandering in de absorptiewaarden.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stapel</td>

ELISA-tests: indirect, sandwich en competitief

Source: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
...

Enzyme-linked Immunosorbent Assay, of ELISA, is een zeer gevoelige kwantitatieve test die vaak wordt gebruikt om de concentratie van een analyt zoals cytokinen en antilichamen in een biologisch monster te meten. Het algemene principe van deze test omvat drie stappen: beginnend met het vastleggen of immobiliseren van de doel-analyt op een microplaat, gevolgd door de detectie van de analyt door doelspecifieke detectie-eiwitten, en ten slotte, enzymreactie, waarbij een geconjugeerd enzym zijn substraat omzet in een gekleurd product. Op basis van verschillende methoden van vastleggen en detectie kan ELISA van vier typen zijn: direct, indirect, sandwich en competitief.Voor directe ELISA wordt het doel-antigeen eerst aan de plaat gebonden en wordt vervolgens gedetecteerd door een specifiek detectie-antilichaam. Deze methode wordt veel gebruikt voor het screenen van antilichamen voor een specifiek antigeen. Indirecte ELISA wordt gebruikt voor het detecteren van antilichamen in een monster om immuunresponsen te kwantificeren. De plaat wordt eerst bedekt met een specifiek captuur-antigeen, dat het doel-antilichaam immobiliseert, en deze antigeen-antilichaam-complex wordt vervolgens gedetecteerd met behulp van een tweede antilichaam.In het geval van sandwich ELISA is het doel-analyt een antigeen, dat op de plaat wordt gevangen met behulp van een captuur-antilichaam en vervolgens wordt gedetecteerd door het detectie-antilichaam, waardoor een antilichaam-antigeen-antilichaam sandwich ontstaat. Deze methode is nuttig voor het meten van de concentratie van een antigeen in een gemengd monster.Competitiever ELISA wordt gebruikt wanneer er slechts één antilichaam beschikbaar is voor een doel-antigeen van belang. De plaat wordt eerst bedekt met het gezuiverde antigeen. Ondertussen wordt het monster dat het antigeen bevat voorgeïncubeerd met het antilichaam en vervolgens aan de plaat toegevoegd, om eventuele vrije antilichaammoleculen te laten binden aan het geïmmobiliseerde antigeen. Hoe hoger het signaal van de plaat, hoe lager de antigeenconcentratie in het monster. In alle vier de soorten ELISA, direct, indirect, sandwich en competitief, is het detectie-antilichaam of direct geconjugeerd aan het enzym of kan het indirect eraan worden gekoppeld via een ander antilichaam of eiwit.De enzymen die gewoonlijk worden gebruikt voor de reactie zijn paardenradenperoxidas of alkalische fosfatase met hun respectieve substraten, die beide een oplosbaar, gekleurd product produceren dat kan worden gemeten en gekwantificeerd met behulp van een platenlezer. In deze video zul je zien hoe indirecte ELISA, sandwich ELISA en competitieve ELISA worden uitgevoerd, gevolgd door voorbeelden van kwantificering van de doel-analyt uit de indirecte en sandwich ELISA-methoden.Het eerste experiment zal aantonen hoe indirecte ELISA wordt gebruikt om de aanwezigheid van anti-influenza-virusantilichamen in serum verkregen uit influenza-geïnfecteerde muizen te bepalen.Voeg om te beginnen 50 microliter gezuiverd antigeen toe - in dit geval 2 milligram per milliliter gezuiverd A/PR/8 Influenza A-virus- aan elke put van een 96-puts ELISA-plaat. Bedek vervolgens de plaat met een kleefbare afdichting en incubeer deze een nacht bij 4 graden Celsius om het antigeen aan de plaat te laten binden. Verwijder de volgende dag de coatingoplossing door de plaat over een gootsteen te laten klappen. Blokkeer vervolgens de resterende eiwitbindplaatsen in de gecoate putjes door 200 microliter blokkeringsbuffer toe te voegen - hier 5% donkeyserum in 1X PBS- aan elke put. Laat de plaat minimaal 2 uur bij kamertemperatuur incuberen. Na de incubatie verwijdert u de blokkeringsbuffer en wast u de plaat door 200 microliter 1X PBS met 1% Tween-20 toe te voegen. Laat de plaat nogmaals over de gootsteen klappen om de was te verwijderen.Bereid vervolgens de testmonsters voor door 460 microliter PBS toe te voegen aan een nieuwe buis en vervolgens 40 microliter serum toe te voegen om een 1 op 12,5-verdunning te maken. Voeg vervolgens 300 microliter PBS toe aan een tweede buis en vervolgens 100 microliter van de eerste verdunning. Ga door met deze reeks verdunning totdat u een laatste monster krijgt met een verdunning van 1 op 204.800. Voeg de stap voor stap verdunde serummonsters in drievoud toe aan de putjes. Bedek de plaat met een kleefbare afdichting en incubeer deze een uur bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de monsters door de plaat in de gootsteen te laten klappen en was de plaat door 200 microliter 1X PBS met 1% Tween-20 toe te voegen. Laat de plaat opnieuw over de gootsteen klappen om de was te verwijderen.Voeg nu 100 microliter van een enzymgeconjugeerd secundair antilichaam toe, dat in dit experiment een paardenradenperoxidas, of HRP, geconjugeerd donkey anti-muis secundair is, aan elke put. Incubeer de plaat een uur bij kamertemperatuur en laat de plaat klappen om eventueel overtollig vocht te verwijderen. Was de plaat met 1X PBS met 1% Tween-20 en breng vervolgens 100 microliter van de indicator-substraat aan met een concentratie van één milligram per milliliter in elke put. Incubeer de plaat met het substraat gedurende 5 tot 10 minuten bij kamertemperatuur. In dit voorbeeld wordt de kleurloze 3,3', 5,5' - tetramethylbenzidine, of TMB, substraat blauw wanneer HRP aanwezig is. Na 10 minuten stopt u de enzymatische reactie door 100 microliter 2N zwavelzuur toe te voegen. De monsters worden geel van kleur.Binnen 30 minuten na het toevoegen van de stopoplossing, plaatst u de plaat in een microplaatlezer en leest u de plaat bij de juiste golflengte voor het substraat om de absorptie van de putjes te bepalen.Om de sandwich ELISA te starten, moet de plaat worden gecoat met gezuiverd captuur-antilichaam. Om dit te doen, voegt u 100 microliter van het captuur-antilichaam toe met een concentratie in het bereik van 1-10 microgram per milliliter aan elke put van een 96-puts ELISA-plaat. Bedek vervolgens de plaat met een kleefbare plaatafdichting en incubeer de plaat een nacht bij 4 grade

elisa-assays-indirect-sandwich-and-competitive

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Gevorderde biologie

Immunology

Immunologie

elisa methods for detecting antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure.

Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is often used to measure antibody levels in serum or in hybridoma culture supernatants. Sandwich ELISA works well for complex samples such as tissue culture supernatants or tissue lysates, where the antigen is mixed with many other molecules. Competitive ELISA is useful when only one antibody is available, or when a small antigen has only one epitope and cannot fit two antibodies because of steric hindrance.

The indirect ELISA starts by coating the wells with antigen. Then serum or hybridoma supernatant with the primary antibody is added, followed by incubation and washing. A secondary enzyme-conjugated antibody is added next, and after another wash, substrate is added. This format is commonly used to measure how much antibody is present in a sample.

The sandwich ELISA uses a capture antibody instead of a purified antigen on the plate. The antigen from the test sample binds between the capture antibody and a second detection antibody, so the antigen is “sandwiched” between them. Both antibodies must recognize the same antigen at different epitopes. This format is very sensitive and has the advantage that the sample usually does not need to be purified first. Many commercial ELISA kits use matched antibody pairs, and some assays use an enzyme-conjugated detection antibody while others use a secondary enzyme-conjugated antibody. In homemade assays, that secondary antibody must bind only the detection antibody and not the capture antibody, or false signal can appear in every well.

The competitive ELISA is used for soluble antigens and is simple to run, but it works best when purified antigen is available in a relatively large amount. In this assay, the wells are coated with antigen first. The test sample is preincubated with an enzyme-conjugated primary antibody and then added to the plate. If the sample contains more antigen, less antibody can bind to the antigen on the well, so the final color or fluorescent signal is lower. For that reason, the signal is inversely related to antigen amount in the test sample.

A standard curve is an important part of any ELISA. Wells with known concentrations of purified recombinant protein are run alongside the test samples, usually in decreasing amounts. The absorbance values from these standards give a reference that can be compared with the unknown samples to calculate protein concentration. The standard curve also helps show whether dilution steps were done accurately.

The final signal depends on the enzyme and substrate used. Horseradish peroxidase, or HRP, and alkaline phosphatase, or AP, are the most common enzymes attached to antibodies. Common HRP substrates include ABTS and TMB, while PNPP is used with AP. ABTS makes a water-soluble green product, and TMB makes a water-soluble blue product. After an acidic stop solution is added, both ABTS and TMB turn yellow and are often read at 450 nm. ABTS changes slowly, while TMB reacts faster and is more sensitive, although it can create more background if the reaction goes too long. PNPP produces a yellow water-soluble product that is read at 405 nm.

ELISA Methods for Detecting Antigens

flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

flow-cytometry-fluorescence-activated-cell-sorting-facs-isolation

Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

magnetic-activated-cell-sorting-macs-isolation-of-thymic-t-lymphocytes

Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

elispot-assay-detection-of-ifn-secreting-splenocytes

ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

immunohistochemistry-immunocytochemistry-tissue-imaging-via-light

Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

antibody-generation-producing-monoclonal-antibodies-using-hybridomas

Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

immunofluorescence-microscopy-immunofluorescence-staining-paraffin

Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

confocal-fluorescence-microscopy-technique-to-determine-localization

Confocal Microscopy for Protein Localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

immunoprecipitation-based-techniques-purification-endogenous-proteins

Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

cell-cycle-analysis-assessing-cd4-cd8-t-cell-proliferation-after

Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

adoptive-cell-transfer-introducing-donor-mouse-splenocytes-to-host

Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

assay-for-cell-death-chromium-release-assay-of-cytotoxic-ability

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

This collection covers many staple techniques of immunology labs, including the labeling and sorting of immune cells. It also demonstrates proliferation methods for immune cells and antibodies, as well as common assays for immune activity including ELISA. Finally, it demonstrates staining and imaging of immune tissue and cell samples.

Learn how indirect, sandwich, and competitive ELISA methods detect antigens and antibodies, and how enzymes, substrates, and standard curves reveal results.

ELISA Methods for Detecting Antigens

Description

Transcript

Tags