Een praktische benadering van genetische Induceerbare Fate Mapping: een visuele gids voor Mark en Track Cellen In Vivo</em

Samenvatting

Genetische Induceerbare Fate Mapping (GIFM) merken en tracks cellen met fijne ruimtelijke en temporele controle In vivo En belicht hoe de cellen van een specifieke genetische afstamming een bijdrage leveren aan het ontwikkelen en volwassen weefsels. Hier blijkt zijn de technieken die nodig zijn om het lot kaart E12.5 muis embryo's voor epifluorescerende en explantatie analyse.

Samenvatting

Fate kaarten worden gegenereerd door deze te markeren en het bijhouden van cellen in vivo te bepalen hoe voorouders bijdragen aan de specifieke structuren en celtypes in het ontwikkelen en volwassen weefsel. Een voorschot in dit concept is G enetic ik nducible F at M apping (GIFM), het koppelen van genexpressie, lot van de cel, en cel-gedrag in vivo, het lot kaarten gebaseerd op genetische afstamming te creëren.

GIFM exploits X-Creer lijnen waarbij X een gen of een reeks van gen-regulatorische elementen die de ruimtelijke expressie van een aangepaste bacteriofaag eiwit, Cre-recombinase (Creer ^T) verleent. Creer ^T bevat een aangepaste e Strogen r eceptor ligand bindend domein dat Creer ^T maakt afgezonderd in het cytoplasma in de afwezigheid van het geneesmiddel tamoxifen. De binding van tamoxifen releases Creer ^T, die naar de kern en bemiddelt recombinatie tussen DNA-sequenties geflankeerd door loxP sites. In GIFM, recombinatie treedt meestal op tussen een loxP geflankeerd Stop cassette voorafgaand aan een reporter-gen, zoals GFP.

Muizen zijn gefokt om ofwel een regio-of celtype-specifieke Creer en een voorwaardelijke verslaggever allel bevatten. Onbehandelde muizen hebben geen markering, omdat de Stop-cassette in de verslaggever voorkomt verdere transcriptie van het reportergen. Wij beheren tamoxifen door orale sondevoeding aan timed-drachtige vrouwtjes, die tijdelijke controle van Creer ^T release en de daarna translocatie naar de kern het verwijderen van de Stop cassette van de verslaggever biedt. Naar aanleiding van recombinatie, de verslaggever allel is constitutief en heritably uitgedrukt. Deze reeks van gebeurtenissen merken cellen zodanig dat hun genetische geschiedenis onuitwisbaar is vastgelegd. De gerecombineerde verslaggever dient dus als een high fidelity genetische afkomst tracer die, eenmaal op, is losgekoppeld van de genexpressie in eerste instantie gebruikt om Creer ^T rijden.

Wij passen GIFM in de muis om een ​​normale ontwikkeling en vast te stellen de bijdrage van genetische lineages tot volwassen soorten cellen en weefsels te bestuderen. We gebruiken ook GIFM om cellen te volgen op de mutant genetische achtergronden om beter te begrijpen complexe fenotypen die opvallende kenmerken van de menselijke genetische aandoeningen na te bootsen.

Deze video artikel leidt onderzoekers door middel van experimentele methoden om met succes toe te passen GIFM. Tonen we de methode met behulp van onze goed gekarakteriseerde Wnt1-Creer ^T; mGFP muizen door het toedienen van tamoxifen bij embryonale dag (E) 8.5 via orale sondevoeding, gevolgd door ontleding bij E12.5 en analyse door epifluorescentie stereomicroscopie. We hebben ook laten zien hoe het lot in kaart gebracht domeinen micro-ontleden voor explantatie voorbereiding of FACS-analyse en ontleden volwassen lot-mapped hersenen voor de ganse berg fluorescerende beeldvorming. Tezamen zijn deze procedures kunnen de onderzoekers de kritische vragen in de ontwikkelingsbiologie en ziekte-modellen adres.

Protocol

Tamoxifen voorbereiding en mondelinge Gavage Procedure (E8.5)

• Bereid een 20 mg / ml stockoplossing van tamoxifen door het oplossen van tamoxifen in de voorverwarmde maïsolie.
• Incubeer de oplossing bij 37 ° C gedurende 2 uur op een nutator en vortex met tussenpozen.
• Bescherm de tamoxifen voorraad van licht, bewaren bij 4 ° C, en gebruik voor maximaal een maand.
• Voor het lot in kaart brengen van experimenten, stelt een kweekkoppel dat bestaat uit een Zwitsers Webster vrouw (wild-type; gekocht van Taconic) en een mannetje die zowel een gen-specifieke Creer ^T allel en een verslaggever allel. Ter demonstratie, maken we gebruik van Wnt1-Creer ^T; mGFP mannen (Ellisor 2009).
• Controleer Zwitserse Webster vrouwtjes elke ochtend voor de verschijning van een vaginale plug. Aanwijzen van de ochtend (0900) van de dag een vaginale plug wordt gezien als 0,5 dagen na de coïtus en het berekenen van de datum van tamoxifen administratie op basis van dit uitgangspunt. (Voor dit experiment, embryonale dag 8.5 werd gebruikt).
• Gebruik een 1 ml spuit met een diervoeder naald (20G x 1-1/2) voor het opstellen van 200 ul van de tamoxifen stockoplossing (4 mg tamoxifen).
• Stevig beperken van de tijd-zwangere vrouwelijke Zwitserse Webster door grijpen de nek van de nek en de rug naar het hoofd immobiliseren en draai om, zodat de buikzijde naar boven is gericht.
• Houd de staart tussen de vingers vrij om het lichaam te houden in een rechte lijn.
• Plaats de voeding naald in de hoek van de mond en voorzichtig de naald gids langs het dak van de mond.
• Draai de naald zodat het parallel aan het lichaam, terwijl tegelijkertijd het kantelen van de kop naar de nek recht te houden.
• Leid de naald naar beneden de slokdarm, in de richting van de maag. Wees voorzichtig dat u de luchtpijp in te voeren. Als er weerstand op de naald, het dier kokhalsreflex bezig, of als de muis strijd, onmiddellijk verwijderen van de naald en probeer het opnieuw de maagsonde.
• Zodra de naald voeren is in de maag, het beheer van de tamoxifen in de maag en terug te keren naar het vrouwtje haar huis kooi tot de datum van dissectie.

Craniotomie:

• Intracardiaal perfuseren de volwassen lot in kaart gebracht muis met 4% PFA en verwijder het hoofd met een schaar door te snijden door de wervelkolom net boven de schouders.
• Voer een scalpel langs de dorsale middellijn van het hoofd (rostraal naar caudaal) te snijden door de hoofdhuid en de schedel bloot te leggen.
• Met behulp van de scalpel, schraap de overtollige weefsel of spieren uit langs de zijkant en de achterkant van de schedel.
• Met een pincet, doorboren de schedel bij de middellijn alleen rostraal van de olfactorische bollen en maak een klein gaatje aan de uiteinden van de fijne schaar tegemoet te komen.
• Plaats de fijne schaar in dit gat en maakt een incisie mediaal naar lateraal ongeveer de lengte van het olfactorische bollen. Deze cut zal breken de schedel op de kruising van de neusbeen en frontale bot en zorgen voor een goede toegang voor de schaar.
• Snijd langs de sagittale hechtingen in de schedel (dorsale middellijn) en zorg ervoor dat de schaar tips uit de buurt van de hersenen hoek om te voorkomen dat schade aan het onderliggende weefsel te houden.
• Voorzichtig pak de schedel met een tang en verwijder het bot langs de mediale incisie aan de hersenen bloot te leggen. De schedel kan off-chip in kleine stukjes of breken weg in grotere secties. Beweeg met de tang aan alle van de frontale, pariëtale, interparietal, en occipitale botten te verwijderen.
• Crack de botten het inkapselen van de paraflocculi (gelegen langs de zijkanten van de hersenen op het niveau van de kleine hersenen) door knijpen de bolvormige botten aan elke kant. Trek weg de botten.
• Draai het hoofd ondersteboven (dorsale zijde naar beneden) en gebruik de tang om de craniale zenuwen te verbreken en de hersenen los van de schedel.

Hele Mount Microscopie: volwassen hersenen

• Beoordeel volwassen hersenen voor het GFP markeren met behulp van een fluorescerende dissectie scope.
• Overdracht hersenen om een ​​petrischaal met PBS en fotograferen met behulp van PictureFrame of een andere geschikte software.

Hele Mount Microscopie: E12.5 embryo's

• Beoordeel ganse berg embryo's voor GFP markeren met behulp van een fluorescerende dissectie scope.
• Transfer die welke GFP positief door de ganse berg naar een petrischaal met PBS en fotograferen met behulp van PictureFrame of een andere geschikte software.
• Gebruik een tang om snuifje af een klein stukje van de staart van elke embryo, plaats elk stuk in een PCR-buis en genotype het weefsel met behulp van PCR (Ellisor 2009) voor beide allelen tot resultaten te zien zijn via volledige mount analyse te bevestigen.

Micro-dissectie en Explantatie voorbereiding van de ventrale mesencephalon van E12.5 embryo's

• Na dissectie van de baarmoeder keten en identification van het lot-mapped embryo's door middel van volledige montage fluorescentie, transfer embryo's ijskoud steriel PBS in een celcultuur schotel.
• Met behulp van fijne schaar, verwijdert u het hoofd gedeelte van het embryo te snijden dwars, caudaal van rhombomere 1.
• Verwijder vervolgens de rostrale deel van het hoofd met een coronale snijden door het diencephalon. Dit zal blootstellen een tube-achtige structuur, waarin de 4e ventrikel via de mesencephalic blaasje vormen een leiding tussen dorsale en ventrale weefsels.
• Zorgvuldig de schaar tips te voegen in de 4e ventrikel, en knip langs de dorsale middellijn, caudaal van rostraal, volledige openstelling van de buis, het creëren van een "open-boek" voorbereiding. Het ventrale mesencephalon wordt nu mediaal worden blootgesteld, terwijl de twee helften van het dorsale mesencephalon zal lateraal verblijven.
• Verwijder alle resterende niet-neuraal weefsel onder de ventrale mesencephalon, zodat het weefsel om meer botweg te leggen. Indien nodig, maak inkepingen in de rostrale en caudale aspecten zodanig dat de rug "vleugels" van de explantatie zal plat ook. De explant moet nu lijken op een "vlinder, waarbij de dorsale mesencephalon vertegenwoordigt de vleugels, en een rhombomere de staart.
• Om verder te isoleren van de ventrale mesencephalon voor FACS-analyse of celkweek experimenten, verwijder dan de laterale (dorsale aspecten) van het weefsel.

Representatieve resultaten:

In deze GIFM experiment, Wnt1 expressie cellen zijn permanent en heritably gemerkt tijdens de embryogenese door het toedienen van tamoxifen bij E8.5 aan Wnt1-CreERT; mGFP embryo's. Vervolgens zijn deze gemarkeerde cellen worden gevisualiseerd via volledige mount fluorescentie en sectie immunohistochemie om te bepalen hoe Wnt1-afgeleide cellen bijdragen aan de neurale structuren over ontwikkeling. Hele monteren fluorescentie berust op het membraan-gebonden GFP onderdeel van de mGFP reporter en biedt daarom cellulaire informatie alsook een overkoepelend uitzicht Wnt1-afgeleide neurale projecties. Bijvoorbeeld, met tamoxifen administratie op E8.5, Wnt1-CreERTmGFP embryo's op E12.5 tentoonstelling GFP-fluorescentie in de eerste plaats in de middenhersenen, achterste achterhersenen en het ruggenmerg (Figuur 1A). Bij een hoge vergrotingsfactor, zijn prima neuronale projecties gezien innerveren de middenhersenen, het lichaam muur, ledematen en craniofaciale regio. Op dit ontwikkelingsfase, het embryo is doorschijnend en de interne GFP etikettering is gemakkelijk te onderscheiden. Echter, als het brein zich ontwikkelt, de dichtheid van volwassen weefsel verduistert GFP-fluorescentie afkomstig van interne hersenstructuren. Daarom, met tamoxifen administratie op E8.5, is slechts een kleine GFP labeling waargenomen in de superieure colliculi van de volwassen door de ganse berg fluorescentie (figuur 1C, inzet). Daarnaast zijn een aantal axonale projecties gezien windhonden langs het ventrale oppervlak van de achterhersenen (niet afgebeeld). In tegenstelling, als tamoxifen wordt toegediend E9.5, aanzienlijke GFP etikettering gebeurt de hele inferieure colliculi (Figuur 1B, inzet). Deze toename in hele berg fluorescentie kan erop wijzen dat Wnt1 expressie cellen op E9.5 meer in belangrijke mate bijdragen tot oppervlakkige regio's van de dorsale middenhersenen of uit te breiden meer processen binnen deze regio dan Wnt1 uitdrukken cellen van E8.5. Hoe dan ook, dit verschil in hele berg fluorescentie weerspiegelt de dynamische aard van Wnt1 expressie tijdens de ontwikkeling en laat zien hoe GIFM kan worden gebruikt om verschillende celpopulaties volgen uit het embryo in de volwassen.

Met immunohistochemie, het lot in kaart gebracht weefsel secties van Wnt1-CreERT; mGFP dieren worden geanalyseerd op cellulair niveau. Antilichamen tegen GFP en β-galactosidase (β-gal) worden gebruikt in combinatie met een verscheidenheid van weefsel specifieke biomarkers voor de fijne schaal cellulaire bijdrage van de Wnt1 lijn om neurale structuren en soorten cellen te bepalen. Met tamoxifen administratie op E8.5 en weefsel analyse op E12.5, dubbele positieve cellen (GFP + en β-gal +) worden waargenomen in de middenhersenen en de achterhersenen met projecties die zich door het ventrale mesencephalon (Figuur 1B). In het volwassen brein, de Wnt1-lijn gemarkeerd op E8.5 geeft aanleiding tot vele middenhersenen structuren met inbegrip van de superieure en inferieure colliculi evenals in de omgeving van dopaminerge cel populaties van de ventrale tegmentale gebied en de substantia nigra (figuur 1D) (zie Ook Zervas 2004). In tegenstelling, de Wnt1-lijn gemarkeerd op E9.5 leidt tot inferieure colliculi als de neuronen in de nabijheid van dopaminerge celpopulaties (Figuur 1F).

Figuur 1 representatieve resultaten voor Wnt1-lot in kaart brengen.:

Voorbeelden van whole-mount en immunocytochemie resulteert in Wnt1-CreERT, mGFP embryo's en volwassen hersenen lot in kaart gebracht (gemarkeerd) op E8.5 (AD)en E9.5 (EF). A. Wnt-1 Creer; mGFP embryo's op E12.5 tentoonstelling GFP-fluorescentie in de eerste plaats in de middenhersenen (Mb), posterior achterhersenen (Hb) en het ruggenmerg (Sp). B. gemarkeerde cellen gevisualiseerd en geanalyseerd op cellulair niveau door immunohistochemie zoals op deze 1-urn dikke optische gedeelte (40x objectief, z-series overname). Nucleair β-galactosidase (nβ-gal) antilichaam labeling (rood) en GFP antilichaam labeling (groen) geeft het lot-mapped cellen die in het ventrale middenhersenen. Hier gerecombineerde cellen zijn voorzien van dubbel positief (nβ-gal + / GFP +) vanwege de aard van de voorwaardelijke mGFP verslaggever. C. Whole-mount bloei microscopie onthult flauw GFP fluorescentie in de superieure colliculi (SC) van de volwassen (inzet). De beoordeling van de Wnt1 lijn gemarkeerd op E8.5 op volwassen gedeelten met een lage vergroting (5X) microscopie laat zien dat de Wnt1 lijn aanleiding geeft tot middenhersenen structuren met inbegrip van de superieure (SC) en inferieure (IC) colliculi (C). D. Een 40x, 1 mm optische gedeelte afkomstig van de ventrale middenhersenen in de buurt van dopaminerge neuronen met nβ-gal + cellen en een rijke GFP + axonale plexus. E. Markering op E9.5 resulteert in een aanzienlijke GFP etiket dat gemakkelijk wordt waargenomen in de colliculus inferior van de middenhersenen door de ganse berg fluorescentie (inzet). De Wnt1 lijn gemarkeerd op E9.5 op volwassen secties (β-gal +, rood) is geconcentreerd in de colliculus inferior (dorsale-posterior middenhersenen) zoals te zien is met een lage vergroting (5x) microscopie (E). F. Een 40x, 1 mm optische gedeelte afkomstig van de ventrale middenhersenen in de buurt van dopaminerge neuronen met nβ-gal + cellen en een rijke GFP + axonale plexus. Wnt1-afgeleide neuronen gemarkeerd op E8.5 E9.5 versus geleidelijk worden uitgesloten van bij te dragen aan dorsale middenhersenen, terwijl de Wnt1 lijn blijft bij te dragen aan ventrale middenhersenen.

Discussie

Het GIFM systeem dat we hebben laten zien kan worden gebruikt om een ​​breed scala van vragen in een verscheidenheid van cellulaire processen te beantwoorden. Kan bijvoorbeeld muizen ontwikkeld met verschillende Cre drivers worden gebruikt om een ​​celtype, weefsel of genetische afstamming van belang doel. Bovendien, omdat tamoxifen kan worden toegediend op elk gewenst embryonale of postnatale tijdstip, kan recombinatie worden gericht op alle relevante ontwikkelingsfase. De ruimtelijke en temporele controle van dit syst...