Methodenartikel
We beschrijven een methode voor de analyse van de verandering van N-gekoppelde glycanen door het vroege leven van glycoproteïnen na hun biosynthese in zoogdiercellen. Dit wordt bereikt door pulse-chase analyse van metabolisch gelabeld glycanen, enzymatische vrijlating uit glycoproteïnen en onderzoek door HPLC.
Bevestiging van de Glc
Het volgende protocol is bedoeld voor de analyse van suiker ketens van in totaal glycoproteïnen of van een specifiek glycoproteïne van belang. De procedure is in principe hetzelfde voor beide gevallen met een paar kleine aanpassingen, zoals vermeld in het gehele protocol.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De pulse-chase analyse van suikers in levende cellen met HPLC-scheiding biedt een methode voor het bestuderen van de dynamiek van oligosaccharide structurele veranderingen gedurende de gehele levensduur van een glycoproteïne. Er zijn steeds meer aanwijzingen dat dergelijke wijzigingen zijn betrokken bij de productie van de signalen voor ER vouwing, kwaliteitscontrole en-handel systemen 2-5. De methode kan worden toegepast, niet alleen voor een specifiek glycoproteïne van belang, maar ook voor het analyseren v.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Wij danken Zehavit Frenkel en Sandra Tolchinsky voor technische bijstand. Onderzoek in verband met dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Israel Science Foundation (1229-1207) en de Duits-Israëlische Project Samenwerking (DIP-DFG).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | |
| Acetonitril LiChrosolv (gradiëntkwaliteit voor vloeistofchromatografie) | Merck & Co., Inc. | 1.0003 | |
| Microcon Amicon Ultra 0,5 ml 30K of Centricon ultracel YM-30 | EMD Millipore | UFC503024 or 4208 | |
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1,5 / 2,0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | |
| Gedialyseerd F–taal kalfserum | Biological Industries | 04-011-1A | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | GIBCO, by Life Technologies | 41965039 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - glucosevrij | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| EDTA dinatriumzout (Titriplex Iii) | Merck & Co., Inc. | 1084180250 | |
| Endo Hf Kit (1.000.000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | |
| F–taal kalfserum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Frac-100 fractiecollector | Amersham | 18-1000-77 | |
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systemen | Beckman Coulter Inc. | 510720 | |
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specifieke Activiteit: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer, Inc. | NET570A | |
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | |
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche Group | 11365177 | |
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | |
| NIH 3T3 cellen | American Type Culture Collection | CRL-1658 | |
| Opti-Flour | PerkinElmer, Inc. | 6013199 | |
| Fosforzuuroplossing (49-51%, voor HPLC) | Fluka | 79607 | |
| Proteaseremmer-cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | |
| Konijn polyklonaal anti-H2 carboxy-terminaal 6 | |||
| Natriumdeoxycholaat | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Natriumdodecylsulfaat | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Natriumfosfaat | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Natriumpyruvaatoplossing (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Spherisorb NH2 Kolom, 5 μm, 4,6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | |
| Triton X-100 | VWR | 306324N | |
| Vibra-Cell ultrasone processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | |
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0,5% w/v natriumdeoxycholaat, proteaseremmer-cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer B: 0,5% w/v SDS, proteaseremmer-cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer C: N-glycosidase F reactiebuffer: 200mM Na3PO4, pH 8,0, 4mM EDTA, 1,5% N-octylglucoside | |||
| NIH 3T3 die H2a 6 stabiel tot expressie brengen | |||
| Buffer D: 0,5% Triton X-100, 0,25% w/v natriumdeoxycholaat, 0,5% w/v SDS, proteaseremmer-cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer E: 0,5% w/v SDS, 1% v/v 2-mercapto–ethanol, proteaseremmer-cocktail 2% v/v in PBS | |||
| 2-mercapto–ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen