Voorbereiding van de Klacht Matrices voor het kwantificeren van Cellular Contractie

Samenvatting

In deze video, tonen we de experimentele technieken die gebruikt worden om compliant, extracellulaire matrix (ECM) gecoate substraten geschikt voor celcultuur fabriceren, en die vatbaar zijn voor trekkracht microscopie en het observeren van de gevolgen van ECM stijfheid op cel gedrag.

Samenvatting

De regulering van cellulaire adhesie aan de extracellulaire matrix (ECM) is essentieel voor cel-migratie en ECM remodeling. Focale adhesies zijn macromoleculaire assemblages dat het koppelen van de contractiele F-actine cytoskelet aan de ECM. Deze verbinding zorgt voor de overdracht van intracellulaire mechanische krachten over het celmembraan aan de onderliggende substraat. Recent werk is gebleken dat de mechanische eigenschappen van de ECM regelen focal adhesion en F-actine morfologie evenals tal van fysiologische processen, zoals celdifferentiatie, divisie, proliferatie en migratie. Zo is het gebruik van celkweek substraten een steeds gangbare methode om nauwkeurig te regelen en te moduleren ECM mechanische eigenschappen.

Te kwantificeren tractie krachten op focale adhesies in een aanhanger cel, voldoen substraten gebruikt in combinatie met hoge-resolutie beeldvorming en computationele technieken in een methode genoemd trekkracht kracht microscopie (TFM). Deze techniek is gebaseerd op metingen van de lokale omvang en richting van substraat vervormingen veroorzaakt door cellulaire contractie. In combinatie met hoge-resolutie fluorescentie microscopie van fluorescent gelabelde eiwitten, is het mogelijk om correleren organisatie van het cytoskelet en remodeling met trekkrachten.

Hier presenteren we een gedetailleerde experimentele protocol voor de bereiding van twee-dimensionale, compliant matrices voor het doel van het creëren van een celkweek substraat met een goed gekarakteriseerde, afstembare mechanische stijfheid, die geschikt is voor het meten van cellulaire contractie. Deze protocollen zijn de fabricage van polyacrylamide hydrogels, coating van ECM eiwitten op dergelijke gels, plating cellen op gels, en hoge-resolutie confocale microscopie met behulp van een perfusie kamer. Daarnaast bieden wij een representatieve steekproef van gegevens die aantonen locatie en de omvang van de cellulaire krachten met behulp van genoemde TFM protocollen.

Protocol

1. Het activeren van de dekglaasje oppervlak

1. Dekglaasjes (# 1.5, 22x40 mm) zijn schoongemaakt met een reeks van zeep en ethanol wast in een eerder beschreven protocol (Waterman-Storer, 1998) te reinigen en stofvrij maken.
2. Plaats coverslips in een roestvrij stalen houder rek, zijn zodanig dat coverslips uit elkaar staan ​​en niet te raken.
3. In de chemische zuurkast (nitril handschoenen en een veiligheidsbril aanbevolen), vul volle kracht 3-aminopropyltrimethoxysilaan in isopropanol voor een uiteindelijke concentratie van 2% (2 ml silaan / 100 ml isopropanol) om een ​​vierkante glazen schaal (~ 350 ml volume) te vullen. Vanwege de reactiviteit met plastic, gebruik dan een glas Pasteur pipet tot 3-aminopropyltrimethoxysilaan van toepassing op de isopropanol.
4. Volledig onder te dompelen dekglaasjes van 1,2 naar deze oplossing voor 10 minuten, terwijl zachtjes roeren op een roer plaat in de zuurkast.
5. Was coverslips door onderdompeling in DDH ₂ O (4 uitwisseling van water). Laat 10 minuten weken tijd voor de laatste uitwisseling, onder roeren. Amino-silaan-bevattende oplossingen dient te worden afgevoerd als gevaarlijk afval.
6. Droge coverslips in de broedstoof bij warme temperatuur (~ 37 ° C) gedurende 10 minuten in een stofvrije omgeving.
7. Afkoelen tot kamertemperatuur.
8. In de zuurkast, dompel dekglaasjes in 1% glutaaraldehyde-oplossing in DDH ₂ O in een glazen vierkante schaal op roer plaat gedurende 30 minuten.
9. Was door drie uitwisseling van DDH ₂ O gedurende 10 minuten per uitwisseling, onder roeren. Gooi glutaraldehyde als gevaarlijk afval.
10. Droog bij kamertemperatuur, afdekken met aluminiumfolie om stof te voorkomen van vasthouden aan de dekglaasjes.
11. Bewaren op een droge plaats, weg van stof, voor maximaal 2 maanden.

2. Voorbereiding van polyacrylamide (PAA) gel

1. Bereid voorraad oplossingen van acrylamide / bis-acrylamide mix van 40% acrylamide en 2% bis-acrylamide, tabel 1. Wij onderhouden een aantal voorraad oplossingen die zijn geoptimaliseerd voor PAA gels van verschillende stijfheid, voorbeelden hiervan zijn vermeld in tabel 1 en 2. Stockoplossingen kan worden gehouden voor meerdere jaren, zolang ze worden onderhouden in een donkere fles bij 4 ° C.
2. Werken oplossingen die de uiteindelijke gewenste concentratie van acrylamide / bis-acrylamide worden verkregen uit voorraad oplossingen. Bijvoorbeeld, bereiden we een werkende oplossing van 7,5% acrylamide/0.10% bis-acrylamide in DDH ₂ O voor het maken van 2.8kPa PAA gels.
3. Degas acrylamide oplossing in een vacuümkamer voor 20 min, om zuurstof te verminderen binnen de oplossing die PAA polymerisatie voorkomt.
4. Bereid 10% ammoniumpersulfaat (APS)-oplossing (0.5g/5mL). Gebruik verse werkvoorraad binnen 3 dagen. Als alternatief kan de voorraad worden ingevroren om te worden gebruikt op latere tijdstippen.
5. Terwijl acrylamide is ontgassen, een 1x3 "microscoop glaasje krachtig af met Rain-X doekjes om glasplaatje oppervlak hydrofoob te maken. Om overtollige regen-X te verwijderen, glaasje veeg met een vochtige Kimwipe. Stel glasplaatje opzij, overdekt.
6. Verwijder de oplossing van acrylamide vacuümkamer en voeg fluorescerende beads (1% van het volume, 5 ul voor de werkende oplossing vermeld in tabel 1). Voeg 0.75μl TEMED en 2,5 ul 10% APS, wat gel polymerisatie zal initiëren. Meng goed door pipetteren voor ~ 5 sec, de invoering van bubbels te minimaliseren,
7. Van toepassing 10-12 ul van de acrylamide oplossing om hydrofobe microscoopglaasje (opgesteld in stap 2.4) en plaats geactiveerd 22x40mm dekglaasje op de top van de druppel. Gel-oplossing moet vacht hele dekglaasje aan. Strijk eventuele luchtbellen die kunnen worden weergegeven in de oplossing. Laat de gel oplossing polymeriseren bij kamertemperatuur ~ 10 minuten.
8. De voltooiing van de polymerisatie kan worden beoordeeld door het omkeren van de resterende werkende oplossing in microcentrifugebuis. Ook kan de gepolymeriseerde gel weg te trekken van dekglaasje randen. Direct na het macroscopische polymerisatie wordt waargenomen, scheid de dekglaasje van het glaasje. Met behulp van de fijne punt van een pincet of een scheermesje rand, verwijder voorzichtig dekglaasje, met gel verbonden, uit microscoopglaasje oppervlak en dompel gel in DDH ₂ O, tot hydratatie te behouden.

3. Koppeling extracellulaire matrix (ECM) eiwitten aan de PAA gel

Drie verschillende methoden kunnen worden gebruikt voor het ECM-eiwit ofwel hechten aan de bovenkant van de PAA gel (3.1 en 3.2) of het opnemen van ECM eiwitten in de gel volume (3.3). Hier bespreken we de koppeling van fibronectine met PAA gels te resulteren in een oppervlak ligand dichtheid van die gelijkwaardig is aan de hoeveelheid geadsorbeerd op glas na incubatie met 10 ug / mL fibronectine-oplossing gedurende 1 uur. Overwegingen voor het kiezen van een methode zijn beschreven in de discussie.

1. Cross-linking ECM eiwit PAA gel oppervlakte door Sulfo-SANPAH Reactieve amines op eiwitten zijn covalent gebonden aan de PAA gel oppervlak door de heterobifunctionele cross-linker Sulfo-SANPAH
   1. Bereid 40 pi werken fracties van Sulfo-SANPAH door het oplossen van S ulfo-SANPAH poeder in watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) (20 ul per mg Sulfo-SANPAH). Flits bevriezen voorraden in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C voor later gebruik.
   2. Verwijder DDH ₂ O van gel oppervlak met behulp van een dekglaasje spinner (<2 sec). Vermijd het drogen van de gel.
   3. Verdunnen Sulfo-SANPAH-DMSO monsters in DDH ₂ O (2mg/ml, pH 7) onmiddellijk voor het gebruik en de vacht gel oppervlak (~ 200 pi). Merk op dat de reactiviteit halfwaardetijd van Sulfo-SANPAH kort is (~ 5 min) bij kamertemperatuur in het water, daarom deze stappen moet worden gedaan in een snel tempo.
   4. Expose gel oppervlak aan UV-licht in een UV cross-linker oven (8W, 254 nm golflengte op een afstand van 2-3 cm voor 1,5 min). Sulfo-SANPAH zal veranderen in kleur van oranje tot bruin.
   5. Dip UV-behandeld dekglaasjes in een beker met verse DDH ₂ O en overmaat aan water verwijderen gel oppervlak met behulp van een dekglaasje spinner (<2 sec).
   6. Pipetteer ~ 50 ul van koude 1mg/ml Fibronectine (FN) (in PBS, pH 7,4) op de Parafilm in petrischaaltje container. Omgekeerde dekglaasje op de top van FN vallen, gel kant worden blootgesteld aan FN.
   7. Reageren bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur of bij 4 ° C gedurende de nacht.
   8. Plaats coverslips in 6 cm weefselkweek platen met PBS (pH 7,4), genoeg om dekglaasje te dekken, onder steriele omstandigheden in weefselkweek kap.
   9. Was uitgebreid met enkele wasbeurten (3-5) van PBS (pH 7,4), onder steriele omstandigheden.
   10. Steriliseer de dekglaasjes door het gebruik van kiemdodende lamp in weefselkweek kap voor 30 minuten.
   11. Incubeer coverslips in cel media gedurende 30-45 minuten voorafgaand aan de plating cellen.
2. Cross-linking ECM naar de PAA gel oppervlak door hydrazinehydraat Koolhydraten groepen op eiwitten worden geoxideerd en gekoppeld aan de gel met hydrazinehydraat.
   1. Bereid polyacrylamide gels zoals beschreven in paragraaf 2.
   2. Plaats PAA gel dekglaasjes in plastic petrischaal in een zuurkast en het gebruik van handschoenen pipet ongeveer 1 ml onverdunde hydrazinehydraat op het oppervlak van elk PAA gel en incubeer gedurende ten minste twee uur, maar niet langer dan 24 uur
   3. Voeg DDH ₂ O aan de petrischaal; Verwijder hydrazinehydraat oplossing en afvoeren als gevaarlijk afval.
   4. Voeg 5% azijnzuur op de petrischaal te dekglaasje onder te dompelen. Cover en incubeer gedurende een uur.
   5. Verwijder de azijnzuur en wassen met DDH ₂ O. Incubeer in DDH ₂ O gedurende een uur. De dekglaasjes zijn nu geactiveerd en klaar voor cross-verbinding geoxideerd Fibronectine (FN).
   6. Vul 10 ul van 1 mg / ml FN-oplossing in 940 ui 50 mM natriumacetaat buffer (pH 4,5) in een donkere micro centrifugebuis, het maken van een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml.
   7. Maak de balans opgemaakt van 20X natrium meta-perjodaat door het toevoegen van 80 mg natrium meta-perjodaat tot 1 ml van 50 mM natriumacetaat buffer (pH 4,5).
   8. Voeg 50 ul 20X natrium meta-perjodaat bouillon aan de FN-oplossing bereid in 3.2.6, zodanig dat de uiteindelijke werken concentratie 10 ug / ml FN en 4 ng / ml natrium meta-perjodaat. Incubeer in het donker buis bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
   9. Verwijder overtollig DDH ₂ O uit geactiveerde gel oppervlak bereid in 3.2.5 met behulp van een dekglaasje spinner (<2 sec). Vermijd het drogen van de gel.
   10. Pipet ~ 500 pi van FN oplossing op geactiveerde gel oppervlak en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
   11. Plaats coverslips in gerechten met PBS (pH 7,4), genoeg om dekglaasje te dekken.
   12. Was uitgebreid met enkele wasbeurten (3-5) van PBS (pH 7,4).
   13. Steriliseer de dekglaasjes door het gebruik van kiemdodende lamp in weefselkweek kap voor 30 minuten.
   14. Incubeer coverslips in cel media gedurende 30-45 minuten voorafgaand aan de plating cellen.
3. Bulk vervoeging van ECM-eiwit in de PAA-gel door acryloyl-X, succinimidylester Dit protocol is voor gedaan tot 2,5. Reactief amines op eiwitten zijn gekoppeld aan een acrylamide monomeer met NHS ester chemie en vervolgens co-gepolymeriseerd tot het gros van de PAA gel.
   1. Conjugaat ECM eiwitten van keuze om acryloyl-X volgens de instructies van de fabrikant. Stock oplossingen van geconjugeerd eiwit moet worden bewaard bij 4 ° C.
   2. Bereken het volume van de PAA werkende oplossing die nodig is voor gel fabricage (bijv. 10 uL per dekglaasje).
   3. Trek 50 pi (bijv. 10% volume) van het water uit bedragen die in de werkoplossing recept in tabel 1 en start de polymerisatie.
   4. Verwijder het volume berekend in 3.3.2 en voeg ECM / acryloyl-X oplossing voor 10% vol. (Bijv. een pL ECM / acryloyl-X 9 ul van PAA-oplossing). Deze stap moet snel worden uitgevoerd, zoals gel is polymerisatie.
   5. Voltooi de stappen 2.6 en 2.7 zoals eerder beschreven.
   6. Was uitgebreid met enkele wasbeurten (3-5) van PBS (pH 7,4), onder steriele omstandigheden.
   7. Steriliseer de dekglaasjes door het gebruik van kiemdodende lamp in weefselkweek kap voor 30 minuten.
   8. Incubeer coverslips in cel media gedurende 30-45 minuten voorafgaand aan de plating cellen.

le "> 4. laden dekglaasje in confocale imaging kamer

Deze stappen worden uitgevoerd nadat cellen zijn toegestaan ​​om zich te verspreiden over ECM-gecoate gel substraat (~ 6-12 uur). Te monteren van de confocale beeldvorming kamer (RC-30WA), is het nuttig om de Warner Instruments website te raadplegen voor advies.

1. Warm cel media en 0,5% of 0,25% trypsine en laden in een 5 ml of 10 ml spuit.
2. Plaats een 22x30mm dekglaasje op de Top Coverslip houder van een Warner Instruments confocale beeldvorming kamer (RC-30WA) met behulp van vacuüm vet aan op het dekglaasje zijn plaats te houden.
3. Plaats een kamer vormen van rubber pakking op de bovenkant van het dekglaasje, die toegang geeft tot zowel de inlaat-en uitlaat polyethyleen buizen. Dit zal toelaten een afstand van 150-1000 micrometer tussen de bovenkant dekglaasje en de gel-coating 22x40mm dekglaasje, afhankelijk van de grootte van de pakking gebruikt.
4. Laad spuiten op inlaat buizen, via connector kit, en controleer dat de media stroomt door buizen en op Top Coverslip en er geen luchtbellen zijn duidelijk zichtbaar in de stroom-lijnen.
5. Van toepassing zijn vacuüm vet op basis van kamer en load gel-coating 22x40mm dekglaasje, cel-kant naar boven. Van toepassing zijn warm media aan cellen.
6. Plaats Top Coverslip houder op kamer basis, met Kamer Pakking scheidt van de gel-coating dekglaasje aan. Zorg dat de paspennen in de kamer zitten bodem binnen de bevestigingsgaten in de Top Coverslip.
7. Breng de drukplaat naar de kamer basis en gebruik maken van de Pressure Plate Wrench te schroeven in en de drukplaat veilig te stellen.
8. Controleer de stroom van media via de slang en de kamer naar eventuele lekken in de kamer controleren en om eventueel media-vrije zones op het celoppervlak te elimineren. Let op: met behulp van een kleine naald in een lichte vacuüm te trekken, terwijl infusie met de media kan helpen elimineren media-vrije zones.
9. Breng de confocale imaging kamer naar de Stage-adapter gelegen in een microscoop houder voor de beeldvorming.
10. Image fluorescent gelabelde eiwitten en fluorescerende kralen ingebed in de gel substraat op een confocale fluorescentiemicroscoop.
11. Voor het verkrijgen van een beeld van de ongedwongen kraal functies binnen de gel, perfuseren trypsine tot cellulaire verklevingen los te maken van de gel, en neem een ​​beeld van de fluorescerende kralen in hetzelfde beeldveld, waar de cel aangehouden. Vergelijking van de gespannen en ongedwongen kraal posities zorgt voor de kwantificering van de gel substraat verplaatsing onder contractie.

Representatieve resultaten:

Het bovenstaande protocol beschrijft de experimentele procedure voor het opstellen van compliant PAA gels voor het bestuderen van cellen contractiliteit en wordt geïllustreerd in figuur 1. De gel oppervlak verkregen met dit protocol is vrij vlak en glad, met fluorescerende kralen gelijkmatig ingebed in heel (Figuur 2A).

Als het meten van gel samentrekking op de plaats van focale adhesies, beeldvorming van de cel (Figuur 3A) en gel oppervlak (Figuur 3B) moet worden gedaan bij de confocale optische vlak van focale adhesies. De samentrekking van een gel kan gevisualiseerd worden door de verplaatsing van embedded TL-kralen (Figuur 3B) op het gel oppervlak wanneer de cellen zijn aanhanger (gespannen) versus vrijstaande (ongedwongen). Het gebruik van algoritmes kunnen opleveren tractie spanningen in verband met kraal verdringing en bijbehorende elasticiteitsmodulus van de gel (figuur 3C en 3D) (Sabass et al.., 2008). Als beeldvorming vindt plaats dieper in de gel, dan kraal verplaatsingen zullen kleiner zijn en niet representatief voor de tractie krachten uitgeoefend aan focale adhesies.

Figuur 1. Schematische weergave van de experimentele opstelling. De algemene doelstelling van deze procedure is het creëren van compliant matrices in het kader van de studie van cellulaire contractie. De eerste stap van de experimentele procedure is om dekglaasjes activeren door amino-silane/glutaraldehyde behandeling ten behoeve van verankering gepolymeriseerde gels. De tweede stap is om een ​​polyacrylamide gel polymeriseren, met fluorescerende kralen, op de geactiveerde dekglaasje aan. De derde stap betreft de chemische verknoping van extracellulaire ligand aan het oppervlak van het polyacrylamide gel, met behulp van een van de drie genoemde technieken koppeling in stap 3. Cellen worden vervolgens uitgeplaat op de gel en liet zich te houden en te verspreiden. Onder actieve cellulaire contractie, kralen ingebed in de gel verdringen.

Figuur 2. Optical confocale stukje bovenkant van PAA gel, zoals gevisualiseerd door (A.), TL-40nm kralen ingebed in gel en (B.), fibronectine immunofluorescentie.

Figuur 3. Vertegenwoordiger resultaat voor een trekkracht experiment. (A.) focale adhesies in een menselijke cel zijn osteosarcoom U2OS marked door GFP-paxillin en (B.) posities van fluorescerende kralen ingebed in de PAA gel onderliggende focale adhesies in de gespannen (groen) en ongedwongen (rood) staten. Pijlen geven voorbeelden van de kraal verplaatsing. (C.) Traction stress-vectoren en (D.) die overeenkomt warmte-schaal kaart van tractie spanningen afgeleid van de samentrekking van de gel, met behulp van algoritmes (Sabass et al.., 2008). Schaalbalk = 5 micrometer.

Tabel 1:

Voorbeeld Stock en Werken PAA Solutions (De gegevens in tabel 1 werd voor het eerst verkregen van Yeung et. Al.. En onafhankelijk bevestigd in ons laboratorium.)

Stock PAA Solution
Afschuifmodulus van PAA Gel (Pa)	230	2833	8640	16344
40% Acrylamide (ml)	1.25	3.12	2.34	2.50
2% Bis-acrylamide (ml)	0.50	0.83	1.88	0.60
Water (ml)	3.25	1.04	0.78	1. 90
Totaal Volume (ml):	5	5	5	5

Werken PAA Solution
Stock oplossing die wordt gebruikt (Pa)	230	2833	8640	16344
Stock Solution Volume (pi)	150	150	200	300
Water (pi)	341,75	341,75	291,75	191,75
Kralen (pi)	5	5	5	5
TEMED (pi)	0.75	0.75	0.75	0.75
10% APS (pi)	2.5	2.5	2.5	2.5
Totaal Volume (pi):	500	500	500	500
Final Acrylamide%	3	7.5	7.5	12
Final Bis-acrylamide%	0.06	0.1	0.3	0.15

Tabel 2:

Afschuifmodulus van PAA substraten van verschillende finale acrylamide en bis-acrylamide percentages

12% Acrylamide			7,5% Acrylamide
% Bis-acrylamide	Afschuifmodulus (Pa)		% Bis-acrylamide	Afschuifmodulus (Pa)
0.145	16344		0.01	689
0.28	30067		0.03	1535
0.45	34263		0.05	2286
0.55	42375		0.075	2833
0.575	50873		0.1	4069
0.6	55293		0.2	5356
			0.3	8640
5% Acrylamide			3% Acrylamide
% Bis-acrylamide	Afschuifmodulus (Pa)		% Bis-acrylamide	Afschuifmodulus (Pa)
0.05	430		0.02	1.3
0.075	600		0.04	54
0.1	1431

Discussie

De procedure hier beschreven voor het opzetten van een trekkracht microscopie (TFM) experiment samen, met de implementatie van computationele tracking routines (Sabass et al.., 2008), maakt voor de kwantificering van cellulaire krachten met micron-schaal ruimtelijke resolutie. Voor het optimaliseren van de experimentele protocol, is het van cruciaal belang voor een zuivere en uniforme gel substraat vormen met uniforme coating van ECM ligand. We bespreken hieronder mogelijke valkuilen:

...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3-aminopropyltrimethyloxilaan	Aldrich	28, 177-8
40% acrylamide	Bio-Rad	161-0140
2% bis-acrylamide	Fisher Scientific	BP1404
TEMED	Fisher Scientific	BP 150-20
Ammoniumpersulfaat	Fisher Scientific	BP179
40nm fluorescente microsferen	Invitrogen	F8789
Sulfo-SANPAH	Pierce, Thermo Scientific	22589
Confocale beeldvormingskamer (RC-30)	Warner Instruments	64-0320
Dekglasspinner	Zelfgemaakt	NA
Ultravioletlamp CL1000	UVP Inc.	95-0228-01
Rostvrijstalen rek	Electron Microscopy Sciences	72239-04
acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoïzuur)	Invitrogen	A-20770
Hydrazinehydraat	Sigma-Aldrich	225819
Natriummetaperiodaat	Thermo Fisher Scientific, Inc.	20504
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-4
Fibronectine	Sigma-Aldrich	F2006
Collageen	BD Biosciences	354236
Dekglasjes (#1.5)	Corning	2940‐224
Glutaaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16120
Rain-X	SOPUS Products	www.rainx.com
Azijnzuur	Acros Organics	64-19-7