De beperkende manchet die in dit artikel is bedoeld om atherosclerose te induceren in de muis gemeenschappelijke halsslagader. Door de conische vorm van de binnenste lumen van de geïmplanteerde cuff genereert goed gedefinieerde gebieden met een lage, hoge en oscillerende shear stress triggering de ontwikkeling van atherosclerotische letsels van verschillende inflammatoire fenotypes.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Implantatie van een carotis Cuff voor het activeren van Shear-stress geïnduceerde atherosclerose in Muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het is algemeen aanvaard dat wijzigingen in de vasculaire shear stress de expressie van inflammatoire genen in endotheelcellen veroorzaken en daardoor leiden tot atherosclerose (beoordeeld in 1 en 2). De rol van shear stress is uitgebreid bestudeerd in vitro onderzoek naar de invloed van de stroming dynamiek op gekweekte endotheelcellen 1,3,4 en in vivo in grotere dieren en mensen 1,5,6,7,8. Echter, zeer reproduceerbaar kleine diermodellen waardoor systematisch onderzoek naar de invloed van shear stress op plaque ontwikkeling zijn zeldzaam. Onlangs Nam et al. 9. Introduceerde een muismodel waarin de ligatie van bijkantoren van de halsslagader zorgt voor een regio met een lage en oscillerende flow. Hoewel dit model veroorzaakt endotheliale dysfunctie en snelle vorming van atherosclerotische laesies in hyperlipidemie muizen, kan niet worden uitgesloten dat de waargenomen ontstekingsreactie is, althans ten dele, een gevolg oF endotheel-en / of schip schade als gevolg van ligatie.
Om dergelijke beperkingen te vermijden, is een schuifspanning wijzigen manchet is ontwikkeld op basis van berekende vloeistofdynamica, wier kegelvormige innerlijke lumen werd geselecteerd om bepaalde gebieden met een lage, hoge en oscillerende shear stress binnen de gemeenschappelijke halsslagader 10 te creëren. Door het toepassen van dit model in apolipoproteïne E (ApoE) knock-out muizen een hoog cholesterol westers soort dieet, vasculaire laesies ontwikkelen stroomopwaarts en stroomafwaarts van de manchet. Hun fenotype is gecorreleerd met de regionale dynamiek stroom 11 zoals bevestigd door de in vivo Magnetic Resonance Imaging (MRI) 12: Low en laminaire schuifspanning stroomopwaarts van de manchet zorgt ervoor dat de vorming van een uitgebreide plaques van een meer kwetsbare fenotype, terwijl oscillerende shear stress stroomafwaarts van de manchet induceert stabiele atherosclerotische laesies 11. In die regio's van hoge shear stress en een hoge laminaire stroming binnen de manchet,meestal niet atherosclerotische plaques in acht worden genomen.
Kortom, de shear stress-modificerende manchet procedure is een betrouwbare chirurgische benadering van fenotypisch verschillende atherosclerotische laesies te produceren in ApoE-deficiënte muizen.
Protocol
1. De voorbereiding van de shear stress modifier (manchet)
- De schuifspanning modifier bestaat uit twee longitudinale helften van een cilinder met een kegelvormige lumen. De halve schalen zijn gemaakt van thermoplastisch polyetherketone geproduceerd door een plastic casting procedure. De cast elementen zijn gestuurd, terwijl nog steeds aangesloten op de loper. Vandaar dat de halve schalen moeten worden afgesneden voor gebruik. Elke cast bevat half schelpen van verschillende groottes, variërend van 150 micrometer - 300 micrometer (laagste binnendiameter aan stroomafwaartse uiteinde).
- De manchet voorbereiding dient te worden uitgevoerd onder een chirurgische microscoop.
- Houd de manchet half shell met stompe pincet en voorzichtig snijd het af van de cast met behulp van een scherp scalpel. Deze procedure zal leiden tot een half shell voorlopers die moeten verder worden verwerkt.
- Plaats de half shell voorloper op een nog niet-gladde plaat, fix it met stompe pincet en precies snijd hem langs de voorgevormde insnijding in om zakelijkeove het gesloten einde. Dit levert de manchet half shell klaar voor gebruik.
- De controle van de halve schalen onder de microscoop en verwijder voorzichtig de resterende scherpe randen. De conische binnenste lumen is essentieel voor het induceren van verschillende kwaliteiten van shear stress binnen, stroomopwaarts en stroomafwaarts van de geïmplanteerde cuff. Een groef op de buitenkant van de halve schalen lopen loodrecht op de binnenste lumen dient als een leidraad voor de thread die uiteindelijk steekt de halve schalen samen vormen de functionele manchet.
- Bewaar de manchet halve schalen, ingedeeld naar grootte, in 70% ethanol.
2. Implantatie van de manchet om de rechter halsslagader
- ApoE knock-out muizen moet worden ongeveer 10 weken oud en op een gewicht van ten minste 20 gram. Als tandplak ontwikkeling moeten worden onderzocht onder hoge cholesterol dieet, begonnen wordt met zo'n soort westers dieet 4 weken vóór de manchet implantatie wordt aanbevolen.
- De gehele chirurgische procedure moetworden uitgevoerd onder minimaal semi-steriele omstandigheden: Draag een chirurgisch schort, masker en muts en steriele handschoenen. Steriliseer de instrumenten voor 30 seconden in een kraal instrument sterilisator en leg ze op een steriele ondoorzichtige folie. Pas op! Instrumenten hebben om af te koelen voor gebruik!
- Plaats de muis in een anesthesie inductie kamer gevuld met 3% isofluraan totdat deze volledig verdoofd. Controleer of de diepte van anesthesie met respons op teen knijpen. Als alternatief kan verdoving worden uitgevoerd met intraperitoneale (ip) injectie van ketamine (80 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) of alternatieve anesthetica goedgekeurd door de IACUC. Voor ip injectie, houd de muis in rugligging en injecteren het verdovingsmiddel in de linker onderste kwadrant van de buik.
- Plaats de muis op een verwarmde chirurgische plaat, in rugligging. Om de ogen van drooglopen bevochtig ze met het oog zalf (bijv. Bepanthen oog en de neus lotion) te voorkomen. Verspreiding van de voor-en achterpoten-poten en tape ze naar beneden op de plaat. Als het uitvoeren van isofluraan anesthesie, de verdovende gasstroom (2% isofluraan) moet worden geleverd via een klein knaagdier masker.
- Verwijder het haar tussen de onderkaak en het borstbeen door een van beide toe te passen ontharingsmiddel (bijv. Pilca Med) of met behulp van een fijne elektrische scheerapparaat (bijv. Wella Contura). Scheren moet worden uitgevoerd met de nodige voorzichtigheid om irritatie van de huid te voorkomen. Bij gebruik van een ontharingsmiddel, geef het 1-2 min voor het penetreren van de haar, daarna wrijf zachtjes totdat al het haar en ontharingsmiddel is verwijderd.
- Hebben klaar eerder bereid manchet half schelpen van verschillende afmetingen (twee van elk formaat) en een 2,5 cm lang stuk van 6-0 zijden hechtdraad voor het onderling verbinden van de lagerschalen op de site van carotis occlusie.
- Ontsmet de operationele veld met ruime hoeveelheid Betadine. Gebruik scherp klein schaartje op de huid en de onderliggende fascia van de nek door een 4-5mm mediale incisie vanaf de bovenkant van het borstbeen (handvat) te openen.
- Vouw de opening, sterzijde hift de juiste oorspeekselklier en plaats een chirurgische spreader. Dan botweg ontleden in het diepe, net links van de luchtpijp (van de chirurgen te zien), waar het recht sternomastoideus spier kruist de juiste omohyoid spier, totdat u in staat om de pulserende juiste halsslagader te identificeren.
- Met behulp van zeer fijne schuine of gebogen pincet (bijv. Dumont # 5 / 45), ontleden het recht gemeenschappelijke halsslagader door voorzichtig verwijderen van de omliggende bindweefsel. Scheid de carotis van de nervus vagus - de witte, draderige object loopt direct langs de halsslagader - zoals deze stap nodig is om volledig bloot te leggen van het schip. Wees voorzichtig noch aan de nervus vagus, noch een tak van de linker interne halsader, die ook in nauwe verbinding met de carotis schade.
- Om de juiste manchet maat te kiezen, vergelijk de diameter van de blootgestelde carotis met de innerlijke-diameter van de manchet halve schalen: de grootste breedte van de manchetten lumen moet de buitendiameter van de carotis te voldoen. Nu, voorzichtig met de punt van de tang in de halsslagader, open de tang, draad het stuk van 6-0 zijde hechtdraad in de halsslagader en een lus vormen. Tussen de lus en de halsslagader plaats een manchet half shell onder de halsslagader. De zijkant van de grootste vernauwing moet worden stroomafwaarts.
- Plaats de tweede cuff half shell binnen de lus op de top van de carotis.
- Voorzichtig draai de hechting loop met behulp van hechtingen pincet en knooppunt de draad. Door dit te doen op de werking schuifspanning modifier wordt gevormd. Voor de precieze plaatsing van de manchet is het essentieel dat de hechtdraad precies actief is binnen de voorgevormde groef op de buitenkant van de manchet.
- Verplaats de rechter oorspeekselklier in de oorspronkelijke positie, bij benadering en sluit de huid of met behulp van een kleine hoeveelheid van 6-0 prolene hechtingen of, als alternatief, kunt u gebruik maken wond clips.
- Injecteer een enkele dosis van 5 mg / kg Carprofen (bijv. Rimadyl) subcutaan om profylactische behandeling van pijn en plaats biedende muis in een warming kamer totdat het zich herstelt. Normaal gesproken, dit duurt 30-60 minuten bij gebruik van ketamine / Xylazine anesthesie. Bij het gebruik van isofluraan inhalatie-anesthesie de herstelperiode is aanzienlijk korter (10-20 min).
- In onze ervaring, de dieren weer normale onbeklemtoonde activiteit binnen de eerste 24 uur na de implantatie manchet met de interventie wordt uitgevoerd door een ervaren chirurg. Echter, als het dier lijkt te zijn streek zelfs een dag na de operatie, herhaal dan de pijnstillende behandeling en overleg met het diergeneeskundig personeel.
3. Explanting de manchet en de halsslagaders
- Voor histologische analyse van de halsslagaders dienen te worden geoogst op het einde van de observatieperiode. Voordat u begint met explantatie, het dier moet worden gedood volgens IACUC richtlijnen.
- Als de manchet halve schalen zijn bedoeld voor hergebruik, verwijder zorgvuldig alle weefsel fragmenten en de verbindende hechtdraad uit de plastic elementen, DISsecting van de halsslagaders, wassen en op te slaan de halve schalen in 70% alcohol oplossing. Men moet in gedachten houden dat de manchet is ingebed in bindweefsel verklevingen na enkele weken van de implantatie en dat men moet de manchet ontleden met de nodige voorzichtigheid om te voorkomen dat de vaatwanden beschadigen.
- Als alternatief kan de manchet worden geëxplanteerd en samen embedded met de halsslagader. Het kunststof materiaal van de manchet is bestand tegen normale fixatie oplossingen en oplosmiddelen gebruikt worden voor paraffine inbedding. Ook kan de ingesloten monsters worden gesneden met behulp van een normale microtoom uitgerust met een normale bladen.
4. Representatieve resultaten
De manchet moet altijd geplaatst worden rond een van de twee gemeenschappelijke halsslagaders van een dier (Fig. 1A, 1B) - de contralaterale zijde dient als een controle. Op de afbeelding de presentatie van de twee halve schelpen van de manchet (fig. 1B) de conische vorm van de binnenste lumen zichtbaar is. Deze conische vorm is essentieel voor de establishing de drie regio's met verschillende stromen dynamiek. Typische schuifspanning die worden geïnduceerd door de cast berekend op basis van Doppler-metingen 11 en de bijbehorende stroomsnelheden op basis van fase-contrast MRI snelheid 12 worden gegeven in figuur 2.
Als de manchet wordt geïmplanteerd in ApoE knock-out muizen een westers soort dieet de veranderde dynamiek van de stroming te provoceren shear stress geïnduceerde depositie atherosclerotische plaque (afb. 3): Stroomopwaarts van de conische vernauwing lage laminaire shear stress leidt tot massale ontwikkeling van atherosclerotische plaques van een meer kwetsbaar fenotype, gekenmerkt door een lipide kernen dicht bij de centrale lumen die alleen tot een dunne vezelige kap (Fig. 3A1). De conische binnenste lumen van de manchet leidt tot een toename van de stroomsnelheid. Bijna geen plaque depositie wordt waargenomen in dit gebied. Direct stroomafwaarts van de plaats van het knelpunt de directe resultaten van de slagader verbreding in een gebied van draaikolken en oscillerende flow parameters, die minder uitgebreide plaque ontwikkeling van een meer stabiele fenotype (dwz minder lipiden kernen die gelokaliseerd zijn meer dicht bij de media) veroorzaakt.
Figuur 1 De schuifspanning modifier - montage en plaatsing (A) Schematische tekening van de geïmplanteerde cuff:.. De manchet wordt geplaatst rond de juiste gemeenschappelijke halsslagader (RCCA) - de contralaterale zijde (LCCA = linker gemeenschappelijke halsslagader) dient als controle . (B) In vivo MRI angiografie in een muis: In de maximale intensiteit projectie van een drie-dimensionale tijd-of-flight MR angiografie de conische vernauwing veroorzaakt door de cast (witte pijl) zichtbaar is (voor details zie 12). (H = hoofd, F = voeten, R = rechts, L = links). In de rechter bovenhoek een macroscopisch uitzicht op de binnenste lumen en de buitenkant van de manchet halve schalen wordt gegeven. Bij montage, twee halve schalen vormen een conische cilinder die wijzigtde stroom dynamiek binnen het schip in een bepaalde manier. Om ervoor te zorgen de juiste pasvorm, een groef aan de buitenzijde van de manchet (gele pijl) dient als een leidraad voor het koppelen van hechtdraad.
Figuur 2. Regio's van de verschillende stromen dynamiek en shear stress. Implantatie van de manchet verandert stroom dynamiek en vervolgens shear stress in de vernauwde halsslagader in een gedefinieerde manier. In de bovenste schematische weergave van de verschillende vloei-eigenschappen worden vermeld en de lokale benadering waarden voor shear stress worden gegeven (gebaseerd op de Doppler-metingen 11). Hieronder, worden de desbetreffende stroomsnelheden voor een enkel dier gemeten met MRI stroomopwaarts van de geïmplanteerde cuff getoond in een T1-gewogen transversale MRI-beeld van de nek (fase-contrast snelheid imaging, voor meer informatie 12 te zien).
Figuur 3. Shear stress veroorzaakt plaque ontwikkeling in ApoE knock-out muizen. De linkerbovenhoek toont de macroscopische uitzicht op de open hals en blootgesteld halsslagaders van een ApoE knock-out muis onder hoge vet (West-type) dieet acht weken na de implantatie van een schuifspanning modifier om de juiste gemeenschappelijke halsslagader (RCCA). De ondoorzichtige witte gebied van het schip (*) stroomopwaarts van de manchet komt overeen met een site van een uitgebreide atherosclerotische plaque depositie. De gele pijl geeft de draad die de twee helften manchet combineert. In tegenstelling, er zijn geen tekenen van plaque depositie in de linker gemeenschappelijke kransslagader (LCCA).
(A) - (C) Representatieve HE gekleurde dwarsdoorsneden van het recht gemeenschappelijke halsslagader van een ApoE knock-out muis onder westerse soort dieet acht weken na de implantatie van de manchet. De schematische weergave geeft de overeenkomstige vlakken (stippellijnen) Where de secties waren gevestigd. (A) Stroomopwaarts van de manchet atherosclerose leidt tot enorme plaque depositie. Grote lipide kernen (rode pijlen), die voor een deel dicht bij de centrale lumen (detail A1) zich karakteriseren de kwetsbare karakter van deze plaques. (B) op het vlak van de manchet bottleneck bijna geen plaque ontwikkeling ligt voor de hand, terwijl de direct stroomafwaarts van de manchet (C) oscillerende stroom leidt tot matige plaque ontwikkeling van een meer stabiele type (dwz minder of geen lipide cores). (C1, C2 = half schelpen van de manchet, P = plaques, sterretje = schip lumen)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Met het oog op experimentele variatie te minimaliseren is het raadzaam om te werken met dieren van bijna dezelfde leeftijd en met hetzelfde dieet geschiedenis. Een recent gepubliceerde onderzoek blijkt dat de schuifspanning modifier toegepast in wildtype muizen misschien een goed model voor het onderzoek van endotheliale dysfunctie en het begin van ontstekingsreacties veroorzaakt door veranderde dynamiek van de stroming 13. Echter, voor het onderzoek van de atherosclerotische plaque ontwikkeling transgene mui...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd mede ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), project GZ PI 771/1-1, SFB 656 "Cardiovasculaire Molecular Imaging," Münster, Duitsland (projecten C6, Z2, B3, en PM3); EU NoE "Diagnostic Molecular Imaging-DIMI "(WP 11.1 en 11.2). De studie werd ook deels gefinancierd door de British Heart Foundation, Verenigd Koninkrijk.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam | Vennootschap | Reacties | |
| Shear stress modifier (polyetherketone) | Promolding BV http://promolding.nl | De werpt worden verstuurd, terwijl nog steeds aangesloten op de loper. Dus, de enige elementen moeten worden afgesneden voor gebruik. |
Referenties
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Lab. Invest. 85, 9-23 (2005).
- Ali, F., Zakkar, M., Karu, K., Lidington, E. A., Hamdulay, S. S., Boyle, J. J., Zloh, M., Bauer, A., Haskard, D. O., Evans, P. C., Mason, J. C. Induction of the cytoprotective enzyme heme oxygenase-1 by statins is enhanced in vascular endothelium exposed to laminar shear stress and impaired by disturbed flow. J. Biol. Chem. 284, 18882-18892 (2009).
- Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 293, C1824-C1833 (2007).
- Zheng, J., Abendschein, D. R., Okamoto, R. J., Yang, D., McCommis, K. S., Misselwitz, B., Gropler, R. J., Tang, D. MRI-based biomechanical imaging: initial study on early plaque progression and vessel remodeling. Magn. Reson. Imaging. 27, 1309-1318 (2009).
- Stone, P. H., Coskun, A. U., Kinlay, S., Clark, M. E., Sonka, M., Wahle, A., Ilegbusi, O. J., Yeghiazarians, Y., Popma, J. J., Orav, J., Kuntz, R. E., Feldman, C. L. Effect of endothelial shear stress on the progression of coronary artery disease, vascular remodeling, and in-stent restenosis in humans: in vivo 6-month follow-up study. Circulation. 108, 438-444 (2003).
- Pedersen, E. M., Oyre, S., Agerbaek, M., Kristensen, I. B., Ringgaard, S., Boesiger, P., Paaske, W. P. Distribution of early atherosclerotic lesions in the human abdominal aorta correlates with wall shear stresses measured in vivo. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 18, 328-333 (1999).
- Buchanan, J. R., Kleinstreuer, C., Truskey, G. A., Lei, M. Relation between non-uniform hemodynamics and sites of altered permeability and lesion growth at the rabbit aorto-celiac junction. Atherosclerosis. 143, 27-40 (1999).
- Nam, D., Ni, C. W., Rezvan, A., Suo, J., Budzyn, K., Llanos, A., Harrison, D., Giddens, D., Jo, H. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 1535-1543 (2009).
- Cheng, C., van Haperen, R., de Waard, M., van Damme, L. C., Tempel, D., Hanemaaijer, L., van Cappellen, G. W., Bos, J., Slager, C. J., Duncker, D. J., van der Steen, A. F., de Crom, R., Krams, R. Shear stress affects the intracellular distribution of eNOS: direct demonstration by a novel in vivo technique. Blood. 106, 3691-3698 (2005).
- Cheng, C., Tempel, D., van Haperen, R., van der Baan, A., Grosveld, F., Daemen, M. J., Krams, R., de Crom, R. Atherosclerotic lesion size and vulnerability are determined by patterns of fluid shear stress. Circulation. 113, 2744-2753 (2006).
- van Bochove, G. S., Straathof, R., Krams, R., Nicolay, K., Strijkers, G. J. MRI-determined carotid artery flow velocities and wall shear stress in a mouse model of vulnerable and stable atherosclerotic plaque. MAGMA. 23, 77-84 (2010).
- Cuhlmann, S., Van der Heiden, K., Saliba, D., Tremoleda, J. L., Khalil, M., Zakkar, M., Chaudhury, H., Luong, L. A., Mason, J. C., Udalova, I., Gsell, W., Jones, H., Haskard, D. O., Krams, R., Evans, P. C. Disturbed Blood Flow Induces RelA Expression via c-Jun N-Terminal Kinase 1: A Novel Mode of NF-{kappa}B Regulation That Promotes Arterial Inflammation. Circ. Res. 108, Forthcoming (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
