Werkwijze voor het isoleren en identificeren van mRNAs, microRNA en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïne complexen uit celextracten met RIP-Chip

Samenvatting

Een stap voor stap-protocol om het isoleren en identificeren van RNA bijbehorende complexen door middel van RIP-Chip.

Samenvatting

Als gevolg van de ontwikkeling van high-throughput sequencing en efficiënte microarray analyse, globale genexpressie analyse een gemakkelijk en direct beschikbare vorm van gegevensverzameling. In veel onderzoek en ziektemodellen echter steady state niveaus van mRNA doelwitgen niet altijd rechtstreeks verband met steady state eiwitniveaus. Post-transcriptionele genregulatie is een waarschijnlijke verklaring van het verschil tussen de twee. Aangedreven door de binding van RNA-bindende eiwitten (RBP), post-transcriptionele regulatie beïnvloedt mRNA lokalisatie, stabiliteit en vertaling vormen van een ribonucleoproteïne (RNP) complex met doelwit mRNA. Identificeren deze onbekende de novo mRNA targets van cellulaire extracten in het RNP complex is cruciaal om te begrijpen mechanismen en functies van de RBP en de daaruit voortvloeiende effect op eiwit output. Dit protocol beschrijft een werkwijze genoemd RNP immunoprecipitatie-microarray (RIP-Chip), waardoor voor de identificatie van sPECIFIEKE mRNA's betrokken bij de ribonucleoproteïne complex, onder veranderende experimentele omstandigheden, samen met opties om verder te optimaliseren een experiment voor de individuele onderzoeker. Met deze belangrijke experimentele instrument, kunnen de onderzoekers verkennen de ingewikkelde mechanismen geassocieerd met post-transcriptionele genregulatie en andere ribonucleoproteïne interacties.

Protocol

Experiment voorbereiding

Voordat u begint te experimenteren, is het essentieel om alle reagentia, containers en apparaten RNase vrij hebben. Behandel glaswerk met RNase inhibitor (RNaseZAP, Ambion) gevolgd door spoelen met DEPC behandeld water. Zorg ervoor dat alle reagentia worden bevestigd als RNase vrij.

1. Bereid mRNP Lysaat

1. Kweken en oogsten exponentieel groeiende weefselcellen tussen 2-5 mg totaal eiwit per RIP.
   1. Twee P150 cultuur gerechten zijn meestal voldoende.
   2. Voor elke RBP wordt onderzocht, moet de totale mobiele nummer en eiwit hoeveelheden worden geoptimaliseerd om geschikt doelwit mRNA en RBP interacties te maximaliseren.
   3. RIP voor qRT-PCR analyse vereisen minder cellulaire lysaat (ongeveer 400 ug totaal eiwit) vanwege de amplificatie en detectie methode vooral voor grote overvloed RBPs zoals Hur, AUF1, TIAR.
2. Pellet cellen via centrifugatie bij 200 xg gedurende 8-10 min bij 4 ° C, vervolgens driemaal wassen met ijskoude PBS.
3. Na een laatste wasbeurt tik zachtjes tegen de onderkant van de buis en resuspendeer celpellet in gelijke volumes bereide polysome lysis buffer (PLB) met RNase en proteaseremmers.
   1. Het is aan te raden om het afmeten van de exacte omvang van de cel pellet.
4. Pipet zachtjes mengsel (niet vortex) te splitsen klompen cellen en incubeer lysaat op ijs gedurende 5 minuten.
5. Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C aan het lysaat van vuil te verwijderen.
6. Onmiddellijk overbrengen supernatant vrijgemaakt voor uw gekoelde microfugebuis.
7. Blijf op ijs en bewaar bij -80 ° C.
   1. Onmiddellijke bevriezing voltooit de juiste lysis van de cellen en voorkomt ongewenste binding. Ga verder met RIP onmiddellijk volgende voorbeeld ontdooien en te houden monsters op ijs om RNA degradatie te voorkomen.
   2. Dit lysaat kan worden opgeslagen gedurende zes maanden bij -80 ° C. Vermijd herhaalde vries-dooi cycli omdat dit kan leiden tot eiwit en / of mRNA degradatie.
8. Kwantificeren eiwitconcentratie in lysaat met standaard Bradford Protein assay.

2. Coat Protein A Sepharose kralen met antilichaam en Wash

1. Pre-swell proteïne A Sepharose (PAS) kralen overnight in NT2 buffer (3-4 volumes) met 5% BSA. Bewaar bij 4 ° C.
   1. Langdurige opslag van enkele maanden bij 4 ° C is mogelijk wanneer aangevuld met 0,1% natriumazide.
   2. Protein Sepharose beads worden gekozen op basis van isotype doel RBP antilichaam. Eiwitten A, G en A / G hebben specifieke isotype doelen en verschillen in affiniteit doel. Proteïne A sepharose korrels werden gebruikt na isotype specificiteit en affiniteit voor Hur eiwit antilichaam.
2. Voor het gebruik, verwijder overtollig NT2 buffer, zodatdie laatste kralen buffer verhouding 1:1.
3. Toepassing van 1,5 ml RNAse-vrije microcentrifugebuizen, verwijder 100 ul PAS slurry en voeg 30 ug antilichaam voor elk IP reactie (dat wil zeggen specifieke RBP en isotype controle).
4. Voeg 100-200 ul buffer aan antilichaam NT2 bead mix.
   1. Mengsel kan worden opgeslagen gedurende verscheidene weken bij 4 ° C bij aangevuld met 0,1% natriumazide.
   2. Een isotype-gematchte antilichaam of hele normale sera van dezelfde soort worden gebruikt in parallel als een antilichaam tegen achtergrond controle RNA.
5. Voeg het juiste antilichaam aan kralen en incubeer overnacht, tuimelen eind over eind bij 4 ° C.
   1. Antilichaamtiter optimaliseren voor specifieke eiwit onderzocht (1, 5, 10 of 30 ug antilichaam is gewoonlijk voldoende).
6. Bereid antilichamen beklede kralen onmiddellijk voor gebruik door wassen met 1 ml vanijskoude NT2 buffer 5 keer.
   1. Wassen bead mix door centrifugeren bij 13.000 xg gedurende 1-2 min bij 4 ° C.
   2. Verwijder voorzichtig het maximale bedrag van supernantant met de hand pipet of aspirator maar wees voorzichtig niet te verstoren pellet.
   3. Wassen helpt bij het verwijderen ongebonden antilichaam en RNase verontreinigingen uit antilichaam mengsel.
7. Zodra de laatste wassing voltooid, resuspendeer de beads in 700 pl ijskoude buffer NT2 gevolgd door behandeling met RNase verschillende remmers aan de doelwit mRNA's, waarvan 10 pi RNase Out bij 40 U / ul, 10 ul 100 mM beschermen DTT en 15 ul EDTA (15 mM). Breng volume tot 1000 ui met NT2 buffer.
   1. Vanadyl ribonucleoside complexen niet door remmende effect van EDTA gebruikt.

3. Immunoprecipitatie en RNA Precipitation

1. Optioneel Preclear Stap:
   1. Om de achtergrond te verminderen, kan kralen en controle antilichaam worden gebruikt om vooraf heldere lysaat. Dit kan verminderen signaal in de output.
   2. Deze stap kan nodig zijn om achtergrond te verlagen bij het doen IP gevolgd door microarray. Het is algemeen niet nodig voor IP gevolgd door qRT-PCR.
   3. Preclear met 15 ug isotype controle gedurende 30 min / 4 ° C tuimelen eind over eind.
   4. Voeg 50 ul van preswollen PAS ongecoate kralen met antilichaam van stap 2.1.
   5. Incubeer 30 min / 4 ° C onder rotatie eind over eind
   6. Centrifugeer bij 10.000 xg bij 4 ° C. Opslaan supernatant voor IP.
2. Voeg 100 ul geïsoleerd geklaard lysaat (ongeveer 2-5 mg) bereid antilichaam mix.
   1. Verdunnen lysaat zal helpen om achtergrond en niet-specifieke binding te verminderen.
   2. Bedrag van lysaat ingang kan variëren afhankelijk van detectiemethode en de overvloed van RBP or efficiëntie van RBP antilichaam zoals genoteerd in stap 1.1.c.
3. (Optioneel) direct tube meng voorzichtig tikken herhaaldelijk gevolgd door korte centrifugatie bij 10.000 xg bij 4 ° C tot pellet kralen en onmiddellijk 100 ul supernatant als totale input mRNA vertegenwoordiging qPCR analyse met standaard isolatietechnieken RNA.
   1. Deze stap is om te bevestigen dat invoer lysaat RNA is optimaal voor IP en mag alleen uitgevoerd als een controle stap of als een probleemoplossing stap na RIP met slechte RNA resultaten worden.
4. Wrap in parafilm om afdichting en incubeer bij 4 ° C zorgen voor 2 tot 4 uur, tuimelen eind over eind.
   1. Vertraagd incubatie worden geoptimaliseerd volgens de doelstelling overvloed en moeten worden beperkt tot complexe herschikking of afbraak te voorkomen. Voor sommige RBPs korter incubaties kunnen meer optimaal.
5. Pellet korrels bij 5.000 XGFof 5 min bij 4 ° C en bewaar supernatant voor mogelijke analyse door Western blot. Store aliquots bij -80 ° C.
   1. Hoeveelheden van supernatans met grote hoeveelheden rest doeleiwit kan duiden op een falen van het eiwit wordt neergeslagen door sepharose kralen.
6. Zoals eerder beschreven, was kralen 5 maal met 1 ml ijskoude buffer en NT2 centrifugeren (5.000 g gedurende 5 min bij 4 ° C) en verwijder supernatant met hand pipet of een aspirator.
   1. Strengere wash methoden worden toegepast om de achtergrond te verlagen door aanvulling NT2 buffer met natriumdeoxycholaat, ureum of SDS.
   2. Bewaar monsters op ijs zoveel mogelijk snel werken om degradatie van doelwit mRNA minimaliseren.
7. Optioneel: Sla een kleine hoeveelheid (10%) van bead mix of een extra monster dat parallel controle op de IP efficiëntie van doeleiwit met Western blot analyse.

4. DNase en Proteinase K behandelingen

1. Na wassen resuspendeer beads met 100 pi NT2 buffer aangevuld met 5 gl RNase-vrij DNase 1 (2 U / pl).
2. Houden bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten. Voeg 1 ml van NT2 buffer en centrifugeer bij 5000 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
   1. Een kleine (~ 10%) aliquot van parels worden gebruikt om de IP efficiency controleren door SDS-PAGE analyse.
3. Hersuspendeer pellet PAS in 100 ul buffer NT2, 5 pl Proteinase K (10 mg / ml) en 1 pi 10% SDS.
4. Incubeer de geresuspendeerde bead mengsel gedurende 30 min bij 55 ° C in een waterbad voorzichtig tikken op elke 10 minuten.
   1. Proteinase K zal helpen bij de vrijgave van de RNP componenten.
5. Pellet beads bij 5.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) en verzamel de supernatant (~ 100 pi).
6. Voeg 200 ul buffer NT2 aan beads, centrifuge 5000 g gedurende 2 min bij kamertemperatuur, verzamel supernatant (~ 200 ul) en gooi kralen.
7. Combineer supernatanten (100 ul en 200 ul) en voeg 300 ul onderlaag zuur _fenol-CHCl3.
8. Vortex, 1 min RT (of 37 ° C in shaker) en gecentrifugeerd bij 16.000 xg bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut.
9. Verzamel 250 ul van de bovenste laag (NIET verstoren interface), voeg 25 ul natriumacetaat bij pH 5,2, 625 ul 100% EtOH en 5 ul glycoblue, en meng goed.
10. Bewaar nacht bij -20 ° C.
    1. Om het hergebruiken van RNA waarborgen, de toevoeging van glycoblue de zichtbaarheid van de RNA pellet verhogen als een dragermolecuul.
11. De volgende dag mix buizen door inversie 3-5 keer, centrifugeren bij 12.000 xg bij 4 ° C gedurende 30 min en gooi het supernatant.
12. Voeg 1 ml van 70% ETOH de blauwe pellet en meng door omkeren of vortexen.
13. Centrifugeer 12.000 xg bij 4 ° C gedurende 2 minuten.
14. Discard supernatant en centrifugeer 12.000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C.
15. Eventueel overblijvend 70% ETOH met een pipet en drogen pellet bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
16. Resuspendeer in 20-40 ul RNase / DNase-vrij water of een andere geschikte volume als dat nodig is.
    1. Monster is nu klaar voor verdere verwerking toepassingen zoals qRT-PCR of microarray.
    2. Nanodrop spectrofotometrie worden gebruikt bij de beoordeling monsterconcentratie, maar met kostbare monsters, kan het gunstig zijn nanodropping monsters te voorkomen als het kan verspilling en relatief onnauwkeurig. Wij stellen voor het normaliseren van monsters om de huishouding gentranscripten om zuiverheid en IP-efficiëntie te beoordelen voor edelstenen en lage opbrengst monsters.

5. Representatieve resultaten

Als de procedure geoptimaliseerd en correct wordt uitgevoerd, dient de immunoprecipitatie opleveren significante verrijking van mRNA targets. TypischAfhankelijk van de RBP en mRNA target (s), zien we verrijking van ongeveer 10 - tot 50-voudig indien beoordeeld door qRT-PCR. Veel doelstellingen van RBPs kan worden ontdekt en masse met behulp van microarray analyse. Deze methode is gevoelig voor afbraak vergeleken met qRT-PCR. Afhankelijk van de RBP, het aantal doelen en de efficiëntie van de reactie kan microarray onthullen honderden nieuwe targets, of kan pas ontdekken een paar, indien aanwezig. Bijvoorbeeld, een van de betere kenmerk RNA bindingseiwitten Hur, post-transcriptioneel de expressie reguleert en translatie van vele belangrijke fysiologische genen ^{1, 2.} Isolatie van de Hur-ribonucleo-complex via RIP-Chip in borstkanker cellijnen bijvoorbeeld geopenbaard verrijking van enkele belangrijke bekende Hur doelen, inclusief β-actine met qRT-PCR zoals weergegeven in figuur 1. In beide cellijnen β-actine is verrijkt 12 - tot 15-voudige. Typisch, op de juiste wijze uitgevoerd zien we een significante Enrichment van β-actine in verschillende cellijnen. Echter, als de RIP blijkt geen significante verrijking voor β-actine is er een probleem met de RIP en de procedure kan moeten worden herhaald. Bovendien microarray analyse van monsters van deze immunologisch cellijnen openbaarde verschillende subsets expressie van Hur targets in verschillende oestrogeenreceptor (ER) positieve MCF-7 kankercellen versus ER negatieve MB-231 borstkanker cellijnen zoals aangetoond in figuur 2 ^1. Deze doelstellingen vallen in verschillende categorieën: bekende en onbekende Hur doelen die ofwel werden geassocieerd of niet geassocieerd met kanker. Bijvoorbeeld, CALM2 en CD9 zijn beide kanker genen die niet eerder werden geïdentificeerd als HUR doelen. Met de microarray en bevestigd met qRT-PCR, en CALM2 CD9 bleken 5 - tot 180-voudig verrijkt in de Hur pellet geeft een belangrijke interactie tussen het eiwit en Hur deze doelgenen.

Figuur 1. Immunoprecipitatie en RIP in MB-231 (ER-) en MCF-7 (ER +) borstkankercellen. Immunoprecipitaties werden uitgevoerd door MB-231 of MCF-7 cellysaten met anti-Hur monoklonaal antilichaam (3A2) en IgG1 isotype controle. A. IP West van Hur onthulde de verwachte lengte band zoals gedetecteerd door 3A2. Panel rechts toont hoeveelheden van Hur in input lysaten gebruikt van beide cellijnen, met β-tubuline als een laad controle. B. Controle door kwantitatieve RT-PCR toonde vijftien en elf maal verrijkingen van β-actine, een bekend doelwit Hur, in het 3A2 IPs van MB-231 en MCF-7, respectievelijk. Alle ΔΔCT waarden werden genormaliseerd voor GAPDH. Experimenten werden uitgevoerd in tweevoud (n = 2).

Figuur 2. Hur RIP-CHIP identificeert verschillende genetische profielen in ER + en ER-borstkankercellen.Hur immunoprecipitaties werden uitgevoerd van MB-231 of MCF-7 cellysaten met Hur IgG1 antilichaam en isotype controle gehybridiseerd Illumina Sentrix arrays (47.000 genen). Controle signalen werden afgetrokken. Resultaten geven gecumuleerde gegevens uit 12 verschillende arrays. Experimenten werden uitgevoerd in drievoud (n = 3) voor elke cellijn met bijpassende controles. Weegschalen zijn log2.

Discussie

Vanwege de aard van dit experiment optimalisatie en ervaring de enige gegarandeerd manieren om succesvol de beoogde resultaten te verkrijgen. In vele stappen van deze procedure, temperatuur en efficiënte behandeling van de reagentia en producten van doorslaggevend belang zijn. Een goede planning en uitvoering van techniek zal helpen verzekeren dat het experiment werd uitgevoerd binnen een passende termijn in de aanbevolen optimale temperaturen. Een belangrijk probleem met RNA isolatie experimenten is de gevoeligheid van RNA voor afbraak door RNasen. Alle reagentia moeten RNase vrij en opgeslagen of gebruikt in RNase-vrij containers. Dit is een cruciale stap in het waarborgen van de integriteit van uw mRNA monster. Zelfs wanneer het experiment goed wordt uitgevoerd, kan echter het gewenste resultaat niet door de aard van de interactie tussen de RBP en zijn doelwit mRNA worden bereikt.

Een potentieel probleem is het hebben van lage of zelfs geen signaal van de RNA geïsoleerd door RIP-Chip.Hoewel er signaal van totaal RNA zijn, kan dit het gevolg van onvoldoende binding eiwit wordt afgebroken door de kralen. De eerste stap is om te bevestigen dat het cellulaire lysaat gebruikt adequate expressie van de specifieke RBP heeft. Na bevestiging kan eiwit worden geïsoleerd na de laatste NT2 wassen en geresuspendeerd in Laemmli buffer of andere geschikte denaturerende buffer en verwarmd op 95 ° C gedurende 5 minuten. Western blot analyse kan worden gebruikt bij deze monsters in coördinatie met ingang lysaat als negatieve controles om voldoende beneden trekken van geassocieerde eiwitten.

Bovendien, omdat het lyseren van de cel nodig is om deze componenten te openen, kan de mogelijkheid van abnormale en ongewenste interacties tussen normaal gescheiden eiwitten en mRNA worden ingevoerd. Deze interacties zou kunnen binden en "genieten" je doel mRNA's of bindende eiwitten door middel van niet-specifieke interacties. Bovendien eiwitten in deze verschillende conditions kunt vouwen in meerdere varianten en hun bindende motieven kan ontoegankelijk geworden om hun doel mRNA's, het voorkomen van hun interacties. Beide versterken het belang van het efficiënt gebruik en de optimale temperatuur genoemde deze ongewenste interacties beperken. Daarnaast zal optimalisatie van wasomstandigheden voor elke specifieke doeleiwit kritisch om de zuiverheid van de interactie maximaliseren. Strengere wascondities nodig zijn. Bijvoorbeeld kan de wasbuffer worden aangevuld met SDS of een geschikte hoeveelheid ureum om niet-specifieke interacties en achtergrond te verminderen in een uitgangssignaal. Dit is volledig afhankelijk doel de experimentator RBP en het doel-mRNA in de unieke fysiologische omstandigheden. Sommige omstandigheden niet geschikt voor bepaalde mRNA analyse-instrumenten opgemerkt in voorbereiding van het monster.

Tenslotte, hoewel RIP succesvol in de verrijking van RNARBP-interacties, een bekend probleem met RIP (CHIP) methode is het onvermogen om de specifieke bindende domeinen van de RBP identificeren op transiënte mRNA targets. Aantal verknopingstechnieken kan worden gevolgd door RIP unieke sequentie targets isoleren, maar het gebruik van korte golf UV gewoonlijk tot nucleïnezuur schade. Een nieuwe methode die PAR-CLIP of fotoactiveerbare ribonucleoside verknoping en immuoprecipitation, stelt langegolf UV thiouridine te nemen in nascent RNA waardoor de identificatie van unieke bindingsplaatsen van zowel stabiele en transiënte RNA interacties.

Over het algemeen is RIP-Chip is opgericht als een uitstekend instrument dat wordt gebruikt voor het isoleren en de interacties tussen RNA-bindende eiwitten en hun mRNA doelen te bestuderen door onze groep net als vele andere onderzoeksgroepen. Hoewel gevoelig van aard en de praktijk zal goede uitvoering van deze procedure opbrengst van de isolatie van deze RNP complexen, die tot voor kort, zijn inaccessible voor ontdekking en analyse.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van de Reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
1 M dithiothreitol	Visser	BP172-5	DTT
DNase 1	Ambion	2235	RNase vrij
Ethyleendiamine Tetraccetic Acid	Visser	BP118-500	EDTA
Glycogeen	Ambion	9516
1 HEPES	Sigma	H3375-100G	pH 7,0
Igepal Nonidet P-40	USB	78641	NP40
1 M KCl	Visser	BP366-500
1 M MgCl2	Visser	BP214-500
NT2 Buffer	* Hieronder zie
Polysome Lysis Buffer	* Hieronder zie
Proteaseremmer cocktail tabletten	Roche	11873580001
Protein A Sepharose kralen	Sigma	P3391
Proteinase K	Visser	BP1700-100
RNase Out RNase inhibitor	Invitrogen	10777-019	40 U / pl
1 M NaCl	Visser	BP358-212
Natriumdodecylsulfaat	Visser	BP166-500	SDS
1 M Tris-HCl	Visser	BP153-500	pH 7,4
Trizol	Invitrogen	15596-026
Vanadyl Ribonucleoside Complexen	New England Labs	S1402S	VRC

Reagens Opwerken

Bereid reagentia in RNase / DNase-vrij, DEPC behandeld glaswerk

Polysome lysisbuffer

100 mM KCl

5 mM MgCl2

10 mM HEPES (pH 7,0)

0,5% NP40

1 mM DTT

100 eenheden / ml RNase Out

400 uM VRC

Proteaseremmer cocktail tablet

5 ml lysisbuffer Polysome

Voeg 50 ul van 1 M HEPES (pH 7,0)

500 pi van 1 M KCL

25 ul van 1 M MgCl2

25 pi van NP40

4,7 ml RNase-vrij DNase-H 2 O

50 ul van 1 M DTT

12,5 pi van 100 U / ml RNase Out

200 pi proteaseremmer cocktail (opgelost volgens fabrikant)

10 pl 200 mM VRC (ten tijde van gebruik)

NT2 Buffer

50 mM Tris-HCl (pH 7,4)

150 mM NaCl

1 mM MgCl2

0,05% NP40

1 L van NT2 Buffer

50 ml Tris (pH 7,4)

30 ml 5 M NaCl

1 ml 1 M MgCl 2

500 pi NP40

820 ml RNase-vrij DNase-H 2 O